בידוד, תרבית ואפיון של תאי שוואן ראשוניים, קרטינוציטים ופיברובלסטים מעורלה אנושית

Summary

המחקר של ריפוי פצעים הקשורים לפגיעה בשרירים-שלד דורש לעתים קרובות הערכה של אינטראקציות במבחנה בין תאי שוואן (SCs), קרטינוציטים ופיברובלסטים. פרוטוקול זה מתאר את הבידוד, התרבות והאפיון של תאים ראשוניים אלה מהעורלה האנושית.

Abstract

פרוטוקול זה מתאר שיטות בידוד, תנאי גידול ואפיון של תאים ראשוניים אנושיים בעלי תפוקה גבוהה וכדאיות באמצעות דיסוציאציה אנזימטית מהירה של העור. קרטינוציטים ראשוניים, פיברובלסטים ותאי שוואן נקטפים כולם מעורלת היילוד האנושית, הזמינה בהתאם להליכי הטיפול הסטנדרטיים. העור שהוסר מחוטא, והשומן והשרירים התת עוריים מוסרים באמצעות אזמל. השיטה מורכבת מהפרדה אנזימטית ומכנית של שכבות אפידרמיס ודרמליות, ואחריה עיכול אנזימטי נוסף לקבלת תרחיפים חד-תאיים מכל אחת משכבות העור הללו. לבסוף, תאים בודדים גדלים במדיה מתאימה של תרביות תאים בהתאם לפרוטוקולים סטנדרטיים של תרביות תאים כדי לשמור על גדילה וכדאיות במשך שבועות. יחד, פרוטוקול פשוט זה מאפשר בידוד, התרבות ואפיון של כל שלושת סוגי התאים מפיסת עור אחת לצורך הערכה חוץ גופית של מודלים של עור-עצבים. בנוסף, ניתן להשתמש בתאים אלה יחד בתרביות משותפות כדי לאמוד את השפעתם זה על זה ואת תגובותיהם לטראומה במבחנה בצורה של שריטות המבוצעות באופן רובוטי בתרבית הקשורה לריפוי פצעים.

Introduction

תאים ראשוניים שמקורם ברקמות חיות ובתרבית בתנאי מבחנה דומים מאוד למצב הפיזיולוגי¹, מה שהופך אותם למודל אידיאלי לחקר תהליכים פיזיולוגיים ופתופיזיולוגיים. העור מכיל סוגי תאים מרובים, כולל קרטינוציטים, פיברובלסטים, סבוציטים, מלנוציטים ותאי שוואן (SCs), אותם ניתן לבודד ולתרבת אותם לניסויים במבחנה . שיטות לבידוד ותרבית קרטינוציטים, פיברובלסטים ו-SCs, מפיסת עור אחת, לא תוארו. מטרתו של פרוטוקול זה היא כפולה: 1) לבסס שיטה אמינה וניתנת לשחזור לבידוד וגידול של מעגלים עוריים ו-2) להשתמש בשיטה יעילה וחזקה לבידוד של קרטינוציטים, פיברובלסטים ו-SCs מעורלה אנושית אחת.

כיום, ישנם פרוטוקולים מבוססים לבידוד קרטינוציטים בעור ^2,3,4 ופיברובלסטים ^5,6. מחקרים אלה מתארים את הבידוד של קרטינוציטים, פיברובלסטים או שניהם מהעור, אך אין פרוטוקול המתייחס לאופן שבו ניתן ליצור תרביות של SCs ראשוניים מעור האדם. מחקרים אחרונים מצביעים על כך ש-SCs עצביים מווסתים תהליכים תאיים של קרטינוציטים ופיברובלסטים ומווסתים תפקודים פיזיולוגיים תקינים בעור⁷. לפיכך, SCs הם קריטיים להומאוסטזיס של העור ותורמים באופן משמעותי לפיזיולוגיה של הוויסות המשפיעה על התנהגותם של סוגי תאי עור שכנים הנמצאים⁸. לכן, פרוטוקול המאפשר בידוד של כל אחד מסוגי התאים הללו הוא אידיאלי לניסויים במבחנה הכוללים תקשורת בין תאים לתאים או לשיחה צולבת בין סוגי תאים.

פרוטוקול זה מתאר את הקמתן של תרביות תאים בודדות של תאים ראשוניים מפיסת עור אחת. פרוטוקול זה שימושי במיוחד כאשר כמות הרקמה הזמינה מוגבלת. יתר על כן, בידוד של כל שלושת סוגי התאים מתורם יחיד מאפשר השוואות חזקות בין סוגי תאים או ניסויים בתרבית משותפת תוך הפחתת השפעת הגנטיקה במהלך הניסוי הרצוי.

Protocol

רכישה ושימוש ברקמת עורלה אנושית לא מזוהה למטרות מחקר נבדקה וקיבלה את הקביעה של "מחקר לא אנושי" על ידי מועצת הביקורת המוסדית של המכללה לרפואה של פן סטייט (IRB #17574).

הערה: על ידי ביצוע הפרוטוקול שלהלן, 2.4 x 10⁶ קרטינוציטים, 4.4 x 10⁶ פיברובלסטים ו 1.1 x 10⁶ SCs מתקבלים מעורלה אחת. באופן כללי, תאים ראשוניים אלה יכולים לשמש עבור 3 מעברים, בהתאם לתנאי הניסוי.

1. בידוד של תאים ראשוניים ותנאי תרבית

1. הליך ההפרדה של אפידרמיס ודרמיס
   1. לרכוש עורלה יילודית בעקבות נהלי טיפול סטנדרטיים על ידי רופא תחת פרוטוקולים רגולטוריים מאושרים של בית החולים. הרופא קובע את עיתוי ברית המילה לאחר הלידה ואת כמות העור שהוסרה.
   2. מניחים את העורלה הנכרתת בצינור מיקרוצנטריפוגה המכיל 8-10 מ"ל של מדיום הנשר המתוקן (DMEM) של דולבקו קר כקרח, ומיד מעבירים את העורלה למעבדת תרביות התאים לבידוד תאים. שטפו את העור פעמיים עם 20-25 מ"ל של 1x Dulbecco's מלח בחסימת פוספט (DPBS) המכיל 1x אנטיביוטיקה/אנטימיקוטי.
      הערה: עבור הכדאיות המרבית של התא, העורלה שנכרתה צריכה להיות ממוקמת על 4 °C (66 °F) עד לעיבוד, ויש לקצור תאים תוך 24 שעות.
   3. לאחר שטיפה ב-DPBS/אנטיביוטיקה, משרים את העורלה ב-25-30 מ"ל של מדיום בסיסי DMEM קר כקרח למשך 10-15 דקות בצלחת תרבית רקמה של 10 ס"מ. בצע את כל שלבי העיבוד במכסה המנוע של תרבית רקמה בטכניקה סטרילית.
   4. באמצעות אזמל, פורסים בזהירות את העורלה פתוחה וחושפים את הדרמיס ואת רקמת השומן התת עורית.
   5. הסר את רקמת השומן התת עורית באמצעות מלקחיים, להב אזמל ומספריים, לפי הצורך. להשליך את רקמת השומן. חותכים את העורלה המנוקה לשלוש עד חמש חתיכות קטנות יותר.
   6. מעבירים את חתיכות העור לצינור חרוטי סטרילי המכיל 16-20 מ"ל של מדיום Dispase-I/DMEM (4 מ"ג/מ"ל במדיום הבסיסי DMEM).
   7. מערבבים את חתיכות העור בצינור החרוטי על ידי היפוך, לסירוגין, במהלך 30 הדקות הראשונות של הדגירה עם dispase-I. לאחר מכן הניחו את הצינור החרוטי בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 16-18 שעות, תוך שימת לב לטבילת חתיכות העור ב-dispase-I/media.
      הערה: יש להכין את תמיסת Dispase-I ממש לפני התוספת באמצעות מדיום בסיסי DMEM קר, מסונן עם מסננת 0.22 מיקרומטר, ונשמרת בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
   8. לאחר עיכול לילה עם dispase-I, להסיר את חתיכות העור ולהניח אותם על צלחת יבשה, סטרילית, תרבית. שחררו כל פיסת עור כך ששכבת האפידרמיס החיצונית תיגע בצלחת התרבות.
   9. באמצעות שתי קבוצות של מלקחיים, מפרידים בזהירות את האפידרמיס מהדרמיס. מתחילים בקצה הרקמה ומקלפים את האפידרמיס הרחק מהדרמיס.
      הערה: אם קשה להפריד את שכבת האפידרמיס מהדרמיס, העיכול של dispase-I לא היה מספיק. אפשרויות לפתרון בעיות: 1) להחזיר חתיכות עור לתמיסת dispase-I/DMEM ולדגום למשך 2-3 שעות נוספות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס; 2) מניחים את פיסות העור בדיסקפוזה טרייה-I/DMEM ודגירה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 2-3 שעות נוספות.
   10. השתמשו באפידרמיס ובדרמיס המופרדים כדי לבודד קרטינוציטים (אפידרמיס) ופיברובלסטים ותאי שוואן (דרמיס).
       הערה: בצע את השלבים הבאים עבור סוגי תאים ספציפיים בתנאי בידוד ותרבית.
2. בידוד קרטינוציטים מהאפידרמיס
   1. הוסיפו 5 מ"ל של מלח חיץ HEPES (HBS) לתבשיל תרבית של 10 ס"מ והוסיפו את שברי האפידרמיס המופרדים. דגירה בטמפרטורת החדר (RT) למשך 10 דקות.
   2. לאחר הדגירה של HBS, אספו את תמיסת ה-HBS בצינור חרוטי של 50 מ"ל. הוסף 5 מ"ל של מאגר נטרול טריפסין (TNB) (טבלת חומרים) בצינור חרוטי של 50 מ"ל והניח בצד.
   3. הוסף 3 מ"ל של תמיסת טריפסין לשברי האפידרמיס. דגירה ב 37 °C (84 °F) למשך 10 דקות.
   4. עצבו בעדינות את שברי האפידרמיס באמצעות מלקחיים עד שתמיסת הטריפסין הופכת עכורה.
   5. הוסיפו את תמיסת הטריפסין/קרטינוציטים לצינור המכיל HBS ו-TNB בשלב 1.2.2.
   6. עבור כל שברי האפידרמיס הנותרים שלא התמוססו בעיכול הטריפסין הראשוני, הוסיפו 3 מ"ל של 0.25% טריפסין/חומצה אתילנדיאמינט-אצטית (EDTA). דגירה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות וחוזרת על שלבים 1.2.4 ו-1.2.5.
   7. הוסיפו 2 מ"ל של סרום בקר עוברי (FBS) לתמיסת טריפסין/EDTA המכילה צינורות תמיסת HBS ו-TNB.
   8. צנטריפוגה צינור האיסוף המכיל HBS / TNB / טריפסין וקרטינוציטים ב 870 x g במשך 5 דקות ב 4 ° C.
   9. לשאוף את הסופרנטנט ולהחזיר את גלולת התא ב 3 מ"ל של קרטינוציטים להשלים את מדיום הגדילה (טבלת החומרים).
   10. סנן את תרחיף התא עם מסנן סטרילי של 100 μM לתוך צינור חרוטי סטרילי של 50 מ"ל כדי להסיר פסולת.
   11. לכמת את מספר התא ואת הכדאיות של התא.
       הערה: כאן, מכשיר מיוחד לדגימת תאים וצביעתם (טבלת חומרים) שימש לכימות מספר התא והכדאיות בהתאם להוראות היצרן.
   12. צלחות תרבית זרעים לפי הצורך לניסויים. צפיפות הזריעה המומלצת היא ~ 45,000 תאים / ס"מ².
   13. הניחו את צלחות התרבית באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב-5% CO₂ למשך יומיים כדי לאפשר לקרטינוציטים להיצמד למנה.
   14. לאחר יומיים, שאפו את כל התאים שאינם דבקים. רענן את המדיה של תרביות התאים כל יומיים עד שהקרטינוציטים יגיעו למפגש הרצוי לניסויים חולפים או במורד הזרם (50%-80% מפגש).
3. בידוד של תאי שוואן (SCs) ופיברובלסטים מהדרמיס
   1. צלוחיות T25 טרום-ציפוי עם פולי-L-ליזין (PLL, 0.01 מיקרוגרם/מיקרול) באמצעות 5 מ"ל של 1x DPBS. הניחו את הצלוחיות המצופים מראש בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 3 שעות. שטפו את מטריצת ציפוי ה-PLL פעמיים באמצעות 1x DPBS (5 מ"ל).
      הערה: ניתן להכין צלוחיות T25 מראש.
   2. יש לשטוף את החלקים המבודדים של הדרמיס ב-5 מ"ל של מדיום בסיסי DMEM.
   3. לטחון את הדרמיס לחתיכות קטנות עם מספריים או אזמל.
   4. מעכלים את הדרמיס הטחון עם 5 מ"ל של קולגןאז (2 מ"ג/מ"ל במדיום הבסיסי של DMEM) ב-37 מעלות צלזיוס למשך 2.5 שעות. מקצצים בעדינות את הדרמיס הטחון עם קצה פיפטה כל 30 דקות עד שהדרמיס מתנתק לחלוטין.
   5. סנן את תרחיף התא באמצעות מסננת תאים של 70 מיקרומטר. יש צורך להפעיל כוח מכני באמצעות מזרק 1 מ"ל כדי לסנן באופן מלא את המתלים.
   6. יש לדלל את תרחיף התא המסונן ב-5 מ"ל של מדיום DMEM שלם (מדיום בסיסי DMEM + 5% FBS + פי 1 של אנטיביוטיקה) כדי לעצור את הפעילות האנזימטית של קולגן.
   7. צנטריפוגה של תרחיף התא ב-870 x g למשך 5 דקות ב-RT כדי להדוף את התאים.
   8. מכדור תא זה יתקבלו גם פיברובלסטים וגם SCs. בצעו החייאה של גלולת התא ב-2 מ"ל של מדיום מלא של DMEM כדי לחלק את התאים (1 mL cell suspension/tube) ואת הצנטריפוגה ב-870 x g למשך 5 דקות ב-RT.
   9. עבור תרבית SCs, בצע את השלבים 1.3.10-1.3.17 ועבור תרבית פיברובלסטים, בצע את השלבים 1.3.18-1.3.22.
   10. משלב 1.3.8, שאפו לסופרנאטנט. בצעו מחדש את גלולת התא ב-5 מ"ל של מדיום DMEM מלא טרי.
   11. לכמת את מספר התא ואת הכדאיות.
       הערה: כאן, מכשיר מיוחד לדגימת תאים וצביעתם (טבלת חומרים) שימש לכימות מספר התא והכדאיות בהתאם להוראות היצרן.
   12. זרעו את צלוחיות T25 המצופים מראש עם 5 מ"ל של תאים שעברו החייאה בצפיפות של 4.0 x 10³ תאים/מ"ל. דגירה של הבקבוקון בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בנוכחות 5% CO₂ למשך הלילה (כ-12-16 שעות דגירה).
   13. לאחר 16 שעות, אשרו את הידבקות התאים על ידי מיקרוסקופיה (טבלת חומרים) בהגדלה של פי 10.
   14. הסר את התאים שאינם דבקים ושטף את הבקבוקון 3x עם 5 מ"ל של 1x DPBS.
   15. הוסף 5 מ"ל של 10 μM ציטוזין ארבינוזיד (חומר אנטי-מיטוטי, הורג פיברובלסטים) במדיום מלא של DMEM. דגירה של הבקבוקון בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בנוכחות 5% CO₂ למשך 24 שעות.
   16. לשאוף את הציטוזין ארבינוזיד המכיל מדיום מהבקבוקון. יש לשטוף את הבקבוקון 3x עם 5 מ"ל של 1x DPBS.
   17. מלאו מחדש את בקבוקון התרבית ב-5 מ"ל של מדיום תרבית מלאה של SCs (טבלת חומרים) ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בנוכחות 5% CO₂ למשך 48 שעות. רענן את מדיום התרבות המלאה של SC כל יומיים עד ש-SCs יגיעו ל-80% מפגש.
   18. שאפו את הסופרנטנט משכבת העור המנותקת (שלב 1.3.8) והחזירו את גלולת התא עם 5 מ"ל של מדיום פיברובלסט שלם (מדיום בסיסי פיברובלסט + 5% FBS + 1x אנטיביוטיקה).
   19. לכמת את מספר התא ואת הכדאיות של התא.
       הערה: כאן, מכשיר מיוחד לדגימת תאים וצביעתם (טבלת חומרים) שימש לכימות מספר התא והכדאיות בהתאם להוראות היצרן.
   20. צלחת את הפיברובלסטים בצפיפות תאים של 4.0 x 10³ תאים/מ"ל בבקבוקי תרבית T25 (לא מצופים מראש) באמצעות 5 מ"ל של מדיום מלא פיברובלסט. דגירה ב 37 °C בנוכחות 5% CO₂ לילה (~ 12-16 שעות דגירה).
   21. לאחר 16-24 שעות, אשרו את הידבקות התאים על ידי מיקרוסקופיה (טבלת חומרים) בהגדלה של פי 10. לשאוף לתאים שאינם דבקים מהבקבוקון ולשטוף את הבקבוקון פעמיים עם 5 מ"ל של 1x DPBS.
   22. הוסף 5 מ"ל של פיברובלסט טרי מלא בינוני ודגירה ב 37 ° C בנוכחות 5% CO₂ במשך 48 שעות. רענן את מדיום התרבית אחת ליומיים עד שהפיברובלסטים יגיעו למפגש הרצוי לבדיקות עוברות או במורד הזרם (50%-80% מפגש).

2. אימות של קרטינוציטים אפידרמליים, SCs עוריים וסמן חלבון פיברובלסטים על ידי אימונופלואורסצנציה

1. יום 1- ציפוי שקופיות זכוכית של תא ותאי ניתוק
   1. ציפוי קדם-ציפוי של 4 שקופיות זכוכית עם קולגן-I לקרטינוציטים, או PLL עבור SCs או, רק 1x DPBS עבור פיברובלסטים (0.5 מ"ל כל באר). הקפידו לצפות את כל המשטח. תא הדגירה מחליק בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. במהלך הדגירה, להכין את התאים.
   2. לאחר שהתאים בתרבית מגיעים למפגש של 50%-80%, שטפו את הצלוחיות עם 1x DPBS 3x (1 מ"ל לכל באר).
   3. נתקו את התאים המודבקים עם 5 מ"ל של תמיסת 0.25% טריפסין-EDTA (TE) על ידי דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בנוכחות 5% CO₂ למשך 2 דקות, עד שהתאים מתחילים להיות עגולים. דמיינו את ניתוק התאים באמצעות מיקרוסקופיה (טבלת חומרים) בהגדלה של פי 10.
   4. לאחר הדגירה, העבירו תמיסת TE המכילה תאים לצינור חרוטי עם סרום בקר עוברי של 5 מ"ל (FBS).
   5. הוסף 5 מ"ל של מאגר נטרול טריפסין (TNB) לבקבוק התרבית ולאחר מכן העבר את התוכן לצינור הצנטריפוגה הנ"ל (תאים עם TE ו- FBS). דמיינו את ניתוק התאים באמצעות מיקרוסקופיה (טבלת חומרים) בהגדלה של פי 10.
      הערה: ניתן להשתמש ב- TNB או ב- FBS או בשניהם כדי לנטרל את פעילות הטריפסין.
   6. צנטריפוגה הצינור החרוטי המכיל תאים / TE / TNB ב 870 x g במשך 5 דקות. מעבירים את ה-supernatant לצינור אחר ומחזירים את גלולת התא בתווך התרבית השלם המתאים. מדוד את הכדאיות של התא כאמור בשלב 1.2.11.
   7. שטפו את שקופיות הזכוכית הקאמריות המצופים מראש (שלב 2.1.1) עם 1x DPBS (1 מ"ל לכל באר) 3x.
   8. יבשו למחצה את המגלשות בתוך מכסה המנוע של תרבית הרקמה וזרעים של קרטינוציטים, SCs או פיברובלסטים בצפיפות מתאימה (30,000 תאים/0.5 מ"ל/תא) במדיום תרבית תאים שלם מתאים.
   9. דגירה של שקופיות החדר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי לאפשר לתאים להידבק.
2. יום 2- חסימת מגלשת הזכוכית הקאמרית עם אלבומין בסרום בקר (BSA) ודגירה של נוגדנים ראשוניים
   1. שאפו את המדיה התאית מהתא מחליק ושטפו 3x עם 1 מ"ל של 1x DPBS.
   2. קבעו את התאים הדביקים עם 4% פרפורמלדהיד ב-1x DPBS (1 מ"ל לכל באר) ודגרו במשך 15 דקות ב-RT בתוך מכסה המנוע של תרבית הרקמה.
   3. יש לשאוף ל-4% פרפורמלדהיד משקופיות התא ולשטוף את שקופיות התא 3x עם 1x DPBS (1 מ"ל לכל באר).
   4. חלחלו את קרומי התאים עם 1% TritonX-100 ב-1x DPBS (1 מ"ל לכל באר) ודגרו במשך 15 דקות ב-RT.
   5. שאפו את תמיסת החסימה משקופיות התא, שטפו 3x עם 1x DPBS (1 מ"ל לכל באר) במשך 30 שניות ואז שאפו 1x DPBS מהבאר.
   6. חסום את שקופיות התא עם 5% BSA (0.5 מ"ל לכל באר) ודגירה למשך 45 דקות ב- RT.
   7. שאפו את תמיסת החסימה משקופיות התא, שטפו 3x עם 1x DPBS (1 מ"ל לכל באר) במשך 30 שניות כל אחת ואז שאפו 1x DPBS מהבאר.
   8. דילול הנוגדנים העיקריים עם 5% BSA (0.2 מ"ל לכל באר) (דילול נוגדנים ראשוניים: קרטינוציטים: עכבר ציטוקראטין 14 נוגדן (1:100) ונוגדן ציטוקראטין 10 (1:100); תאי שוואן: נוגדן עכבר S100 (1:200), ונוגדן קולטן גורם גדילה עצבי ארנב (p75-NTR) (1:500); פיברובלסטים: נוגדן וימנטין ארנב (1:200), ונוגדן אקטין שרירי אלפא-חלק של עכבר (α-SMA) (1:200)).
   9. מוסיפים את הנוגדנים העיקריים לתאים המתאימים על מגלשת הזכוכית של החדר ודגירה במשך כ-15-16 שעות (לילה) בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בתא לח.
   10. שאפו את הנוגדנים העיקריים מהחלקות התאיות, שטפו 3 פעמים עם 1x DPBS (1 מ"ל לכל באר) במשך 30 שניות כל אחד ואז שאפו 1x DPBS מהבאר.
   11. דיללו את הנוגדנים המשניים (נוגדן משני IgG נגד ארנב עזים-אלקסה פלואור 488 (1:500) ונוגדן משני IgG נגד עכבר עזים-אלקסה פלואור 594 (1:500)) עם 0.5% BSA. הוסיפו נוגדן משני מתאים לכל באר (0.2 מ"ל לכל באר). דגירה למשך 45 דקות ב- RT.
   12. שאפו את הנוגדן המשני משקופיות התא, שטפו 3x עם 1x DPBS (1 מ"ל לכל באר) במשך 30 שניות כל אחת ואז שאפו 1x DBPS מהבאר.
   13. הסר את האטם בשקופית התא בעלת 4 הבארות באמצעות מסיר אטם. נסו לא להשאיר שום דבק בשקופית מכיוון שהדבר מפריע ליישום הכיסוי. הוסף טיפה של מדיום הרכבה עם 4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI). לחלופין, הכתימו את הבארות ב-DAPI והשתמשו במדיום הרכבה שאינו מכיל תוויות.
   14. הניחו בזהירות את הכיסוי על מגלשת הזכוכית על ידי הימנעות מבועות אוויר ואטמו את קצה הכיסוי בדבק. שימו לב לדפוסי צביעה אימונופלואורסצנטיים על ידי מיקרוסקופיה (טבלת חומרים) בהגדלה של פי 10 ו/או פי 20.

תוצאות

עורלה יילודית תקינה שימשה לבידוד של קרטינוציטים אפידרמליים ראשוניים ו-SCs עוריים ופיברובלסטים. התאים הראשוניים המבודדים עברו תרבית במדיה המתאימה של תרביות תאים שהכילו גורמי גדילה. לאחר זריעה של SCs ופיברובלסט בצלוחיות תרבית, רוב התאים דבקו בתחתית הבקבוקון תוך 2 שעות. במקרה של קרטינוציטים, ר...

Discussion

פרוטוקול זה מתאר שיטה לבודד שלוש אוכלוסיות תאים נפרדות מחתיכה אחת של העורלה, כלומר קרטינוציטים, פיברובלסטים ותאי שוואן. ישנם מספר פרוטוקולי בידוד זמינים לבידוד קרטינוציטים ופיברובלסטים ^2,3,5,6, אך אף אחד מהם אינו מתאר בידוד SC.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µM sterile filters (Millex-GP Syringe Filter Unit,polyethersulfone)	MilliporeSigma	SLGPR33RS
70 µM cell strainers	CELLTREAT	229483
100 µM cell strainers	CELLTREAT	229485
1 mL disposable syringes	BD Luer-Lok	BD-309659
5 mL disposable syringes (Syringe sterile, single use)	BD Luer-Lok	BD309646
10 mL disposable syringes	BD Luer-Lok	BD305462
1% TritonX-100	Sigma	X100-1L	Prepared at the time of use
4% paraformaldehyde solution	ThermoFisher Scientific	J19943.K2	Ready to use and store at 4 °C
5% BSA	Sigma	A7906-100G	Prepared at the time of use
70% ethanol	Pharmco	111000200
Antibiotic	ScienCell Research	503
Chemometec Vial1-Cassette	Fisher Scientific	NC1420193
Collagenase	Gibco	17018-029
Coverslip	Fisherbrand	12544D 22*50-1.5
Dispase I	Sigma-Aldrich	D46693
DMEM basal medium	ScienCell Research	9221
Dulbecco's phosphate-buffered saline free from Ca2+ and Mg2+ (DPBS)	Corning	21-031-CV)
Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	ThermoFisher Scientific	339651
Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	ThermoFisher Scientific	339653
1.5 mL micro-centrifuge tubes	Fisherbrand	02-681-5
Fetal bovine serum (FBS)	ThermoFisher Scientific	10082147
Fibroblast complete medium	ScienCell Research	2331
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594	Invitrogen	A11032	Dilution (1:500)
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11008	Dilution (1:500)
Hanks' Buffered Saline Solution (HBSS buffer)	Lonza	CC-5022
Human foreskin			De-identified human foreskin tissue for research purposes (Institutional Review Board- IRB #17574).
KGM-GOLD keratinocyte medium (KGM gold and supplements)	Lonza	00192151 and 00192152
Mouse alpha-smooth muscle actin antibody	ThermoFisher Scientific	14-9760-82	Dilution (1:200)
Mouse Cytokeratin14 antibody	Abcam	ab7800	Dilution (1:100)
Mouse S100 antibody	ThermoFisher Scientific	MA5-12969	Dilution (1:200)
Multi chambered (4 well glass slide)	Tab-Tek	154526
NucleoCounter -Via1-Cassette	Chemometec	941-0012
Poly-L-Lysisne (PLL)	ScienCell Research	32503
ProLong Gold Anti-fade Mountant with DAPI	Invitrogen	P36935
Rabbit K10 antibody	Sigma-Aldrich	SAB4501656	Dilution (1:100)
Rabbit p75-NTR antibody	Millipore	AB1554	Dilution (1:500)
Rabbit vimentin	ProteinTech	10366-1-AP	Dilution (1:200)
Schwann cell culture medium	ScienCell Research	1701
Precision tweezers DUMONT straight with extra fine tips Dumostar, 5	ROTH	LH75.1	Sterilize with 70% alcohol before use
IRIS Scissors, sharp/sharp. Length 4–3/8"(111mm)	Codman	54-6500	Sterilize with 70% alcohol before use
Sterilized surgical - sharp blade (Duro Edge Economy Single Edge Blades)	Razor blade company	94-0120	Sterilize with 70% alcohol before use
T25 culture flask	Corning	353109
Trypsin neutralization buffer (TNS)	Lonza	CC-5002
Trypsin/EDTA	Lonza	CC-5012
Inverted microscope	ZEISS	Axio Observer 7- Axiocam 506 mono – Apotome.2 microscope	For immunofluorescence of chamber slide containing stained cells
Inverted microscope	ZEISS	Primovert	For visulaizing/observing cell attachment or detachment