Выделение, культивирование и характеристика первичных шванновских клеток, кератиноцитов и фибробластов из крайней плоти человека

Резюме

Изучение заживления ран, связанных с повреждением опорно-двигательного аппарата, часто требует оценки взаимодействий in vitro между шванновскими клетками (SCs), кератиноцитами и фибробластами. Этот протокол описывает выделение, культивирование и характеристику этих первичных клеток из крайней плоти человека.

Аннотация

Этот протокол описывает методы изоляции, условия культивирования и характеристику первичных клеток человека с высоким выходом и жизнеспособностью с использованием быстрой ферментативной диссоциации кожи. Первичные кератиноциты, фибробласты и шванновские клетки собираются из крайней плоти новорожденного человека, которая доступна в соответствии со стандартными процедурами ухода. Удаленная кожа дезинфицируется, а подкожный жир и мышцы удаляются с помощью скальпеля. Метод состоит из ферментативного и механического разделения эпидермального и дермального слоев с последующим дополнительным ферментативным перевариванием для получения одноклеточных суспензий из каждого из этих слоев кожи. Наконец, одиночные клетки выращиваются в соответствующих средах клеточных культур в соответствии со стандартными протоколами клеточной культуры для поддержания роста и жизнеспособности в течение нескольких недель. Вместе этот простой протокол позволяет выделять, культивировать и характеризовать все три типа клеток из одного куска кожи для оценки in vitro моделей кожи-нерва. Кроме того, эти клетки могут быть использованы вместе в кокультурах для оценки их воздействия друг на друга и их реакций на травму in vitro в виде царапин, выполненных роботизированно в культуре, связанной с заживлением ран.

Введение

Первичные клетки, полученные из живой ткани и культивируемые в условиях in vitro , очень похожи на физиологическое состояние¹, что делает их идеальной моделью для исследования физиологических и патофизиологических процессов. Кожа содержит несколько типов клеток, включая кератиноциты, фибробласты, себоциты, меланоциты и шванновские клетки (SCs), которые могут быть выделены и культивированы для экспериментов in vitro . Методы выделения и культивирования кератиноцитов, фибробластов и СК из одного куска кожи не были описаны. Цель этого протокола двояка: 1) установить надежный и воспроизводимый метод выделения и культивирования кожных СК и 2) использовать эффективный, надежный метод выделения кератиноцитов, фибробластов и СК из одной крайней плоти человека.

В настоящее время существуют установленные протоколы выделения кератиноцитов кожи ^2,3,4 и фибробластов ^5,6. Эти исследования описывают выделение кератиноцитов, фибробластов или обоих из кожи, но ни в одном протоколе не рассматривается, как создавать культуры первичных СК из кожи человека. Недавние исследования показывают, что нейронные СК модулируют клеточные процессы кератиноцитов и фибробластов и регулируют нормальные физиологические функции кожи⁷. Таким образом, SCs имеют решающее значение для гомеостаза кожи и вносят существенный вклад в физиологию регулирования, которая влияет на поведение соседних типов клеток кожи, присутствующих⁸. Поэтому протокол, который позволяет изолировать каждый из этих типов клеток, идеально подходит для экспериментов in vitro, включающих клеточную связь или перекрестные разговоры между типами клеток.

Этот протокол описывает создание отдельных клеточных культур первичных клеток из одного куска кожи. Этот протокол особенно полезен, когда количество доступной ткани ограничено. Кроме того, выделение всех трех типов клеток от одного донора позволяет проводить надежные сравнения между типами клеток или экспериментами с кокультурой, одновременно смягчая влияние генетики во время желаемого эксперимента.

протокол

Приобретение и использование деидентифицированной ткани крайней плоти человека в исследовательских целях было рассмотрено и получило определение «не человеческих исследований» Советом по институциональному обзору Медицинского колледжа штата Пенсильвания (IRB #17574).

ПРИМЕЧАНИЕ: Следуя приведенному ниже протоколу, из одной крайней плоти получают 2,4 х 10⁶ кератиноцитов, 4,4 х 10⁶ фибробластов и 1,1 х 10⁶ СК. В общем, эти первичные клетки могут быть использованы в течение 3 проходов, в зависимости от условий эксперимента.

1. Выделение первичных клеток и условий культивирования

1. Процедура разделения эпидермиса и дермы
   1. Приобретите неонатальную крайнюю плоть в соответствии со стандартными процедурами ухода врача в соответствии с утвержденными протоколами регулирования больницы. Врач определяет сроки обрезания после рождения и количество удаленной кожи.
   2. Поместите иссеченную крайнюю плоть в микроцентрифужную трубку, содержащую 8-10 мл ледяной базальной среды Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM), и немедленно транспортируйте крайнюю плоть в лабораторию клеточной культуры для изоляции клеток. Дважды промойте кожу 20-25 мл 1x фосфатно-буферного физиологического раствора Dulbecco (DPBS), содержащего 1x антибиотика/антимикотика.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для максимальной жизнеспособности клеток иссеченную крайнюю плоть следует поместить при 4 °C до обработки, а клетки должны быть собраны в течение 24 ч.
   3. После промывания DPBS/антибиотиками замочите крайнюю плоть в 25-30 мл ледяной базальной среды DMEM в течение 10-15 мин в чашке для культуры тканей 10 см. Выполните все этапы обработки в вытяжке культуры тканей с использованием стерильной техники.
   4. С помощью скальпеля аккуратно разрезайте крайнюю плоть и обнажите дерму и подкожную жировую клетчатку.
   5. Удалите подкожную жировую клетчатку с помощью щипцов, лезвия скальпеля и ножниц по мере необходимости. Отбросьте жировую ткань. Нарежьте очищенную крайнюю плоть на три-пять более мелких кусочков.
   6. Переложите кусочки кожи в стерильную коническую трубку, содержащую 16-20 мл диспазно-I/DMEM среды (4 мг/мл в базальной среде DMEM).
   7. Перемешайте кусочки кожи в конической трубке путем инверсии, с перерывами, в течение первых 30 мин инкубации с диспазой-I. Затем поместите коническую трубку при 4 °C в течение 16-18 ч, помня о погружении кусочков кожи в dispase-I/media.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор Диспазы-I следует готовить непосредственно перед добавлением с использованием холодной базальной среды DMEM, фильтровать с помощью ситечка 0,22 мкм и хранить при 4 °C.
   8. После ночного переваривания с диспазом-I удалить кусочки кожи и поместить их на сухую, стерильную, культуральную посуду. Раскрутите каждый кусочек кожи так, чтобы внешний эпидермальный слой касался блюда культуры.
   9. Используя два набора щипцов, тщательно отделите эпидермис от дермы. Начните с края ткани и отшелушите эпидермис от дермы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если слой эпидермиса трудно отделить от дермы, то диспазно-I пищеварения было недостаточно. Варианты устранения неполадок: 1) возврат кусочков кожи в раствор dispase-I/DMEM и инкубация в течение дополнительных 2-3 ч при 4 °C; 2) поместить кусочки кожи в свежую диспазу-I/DMEM и инкубировать при 4 °C еще 2-3 ч.
   10. Используют разделенный эпидермис и дерму для выделения кератиноцитов (эпидермиса) и фибробластов и шванновских клеток (дермы).
       ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните следующие действия для определенных типов клеток изоляции и условий культивирования.
2. Выделение кератиноцитов из эпидермиса
   1. Добавьте 5 мл буферного физиологического раствора HEPES (HBS) в 10 см культуральную чашку и добавьте отделенные фрагменты эпидермиса. Инкубировать при комнатной температуре (RT) в течение 10 мин.
   2. После инкубации HBS собирают раствор HBS в коническую трубку объемом 50 мл. Добавьте 5 мл буфера нейтрализации трипсина (TNB) (Таблица материалов) в коническую трубку объемом 50 мл и отложите в сторону.
   3. Добавьте 3 мл раствора трипсина к эпидермальным фрагментам. Инкубировать при 37 °C в течение 10 мин.
   4. Аккуратно перемешайте эпидермальные фрагменты с помощью щипцов до тех пор, пока раствор трипсина не станет мутным.
   5. Добавьте раствор трипсина/кератиноциты к трубке, содержащей HBS и TNB, на стадии 1.2.2.
   6. Для любых оставшихся эпидермальных фрагментов, которые не растворились в первоначальном переваривании трипсина, добавьте 3 мл 0,25% трипсина / этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА). Инкубируют при 37 °C в течение 10 мин и повторяют шаги 1.2.4 и 1.2.5.
   7. Добавьте 2 мл фетальной бычьей сыворотки (FBS) в раствор трипсина/ЭДТА, содержащий пробирки для растворов HBS и TNB.
   8. Центрифугируют сборную трубку, содержащую HBS/TNB/трипсин и кератиноциты при 870 х г в течение 5 мин при 4 °C.
   9. Аспирировать супернатант и повторно суспендировать клеточную гранулу в 3 мл кератиноцитарной полной питательной среды (Таблица материалов).
   10. Фильтруйте клеточную суспензию стерильным фильтром 100 мкМ в стерильную коническую трубку объемом 50 мл для удаления мусора.
   11. Количественно оцените количество клеток и жизнеспособность клеток.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь для количественной оценки количества и жизнеспособности ячеек использовалось специализированное устройство для отбора проб и окрашивания клеток (Таблица материалов) в соответствии с инструкциями производителя.
   12. Тарелки для посева семян по мере необходимости для экспериментов. Рекомендуемая плотность посева составляет ~45 000 клеток/^см2.
   13. Поместите культуральные пластины в инкубатор при 37 °C в 5% CO₂ в течение 2 дней, чтобы кератиноциты прилипли к блюду.
   14. Через 2 дня аспирируют любые неприлипшие клетки. Обновляйте среду культивирования клеток через день до тех пор, пока кератиноциты не достигнут желаемого слияния для экспериментов по прохождению или последующему течению (слияние 50-80%).
3. Выделение шванновских клеток (SCs) и фибробластов из дермы
   1. Предварительно покрывать колбы T25 поли-L-лизином (ФАПЧ, 0,01 мкг/мкл) с использованием 5 мл 1x DPBS. Поместите предварительно покрытые колбы при температуре 37 °C в течение 3 ч. Дважды вымойте матрицу покрытия ФАПЧ, используя 1 dpBS (5 мл).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Колбы T25 могут быть приготовлены заранее.
   2. Изолированные кусочки дермы промыть 5 мл базальной среды ДМЭМ.
   3. Измельчите дерму на мелкие кусочки ножницами или скальпелем.
   4. Переварить измельченную дерму 5 мл коллагеназы (2 мг/мл в базальной среде ДМЭМ) при 37 °C в течение 2,5 ч. Аккуратно тритурируйте измельченную дерму кончиком пипетки каждые 30 минут, пока дерма полностью не отделится.
   5. Фильтруйте клеточную суспензию с помощью клеточного ситечка 70 мкМ. Необходимо приложить механическую силу с помощью шприца 1 мл для полной фильтрации суспензии.
   6. Разбавить фильтрованную клеточную суспензию 5 мл полной dmEM среды (базальная среда DMEM + 5% FBS + 1x антибиотика), чтобы остановить ферментативную активность коллагеназы.
   7. Центрифугируйте клеточную суспензию при 870 х г в течение 5 мин при РТ для гранулирования клеток.
   8. Из этой клеточной гранулы будут получены как фибробласты, так и СК. Повторно суспендируют ячейку гранулы в 2 мл полной среды DMEM для деления клеток (1 мл клеточной суспензии / трубки) и центрифуги при 870 х г в течение 5 мин при РТ.
   9. Для культуры СК выполните шаги 1.3.10-1.3.17, а для культуры фибробластов - шаги 1.3.18-1.3.22.
   10. Начиная с шага 1.3.8, аспирируйте супернатант. Повторно суспендируйте ячейку гранулы в 5 мл свежей полной среды DMEM.
   11. Количественно оцените количество клеток и жизнеспособность.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь для количественной оценки количества и жизнеспособности ячеек использовалось специализированное устройство для отбора проб и окрашивания клеток (Таблица материалов) в соответствии с инструкциями производителя.
   12. Засейте предварительно покрытые колбы T25 5 мл повторно суспендированных клеток плотностью 4,0 х 10³ клетки/мл. Инкубируют колбу при 37 °C в присутствии 5% CO₂ в течение ночи (~12-16 ч инкубации).
   13. Через 16 ч подтвердить адгезию клеток с помощью микроскопии (Таблица материалов) при 10-кратном увеличении.
   14. Удалите неадгезивные клетки и промыть колбу 3x 5 мл 1x DPBS.
   15. Добавьте 5 мл 10 мкМ цитозина арабинозида (антимитотическое средство, убивает фибробласты) в полную среду DMEM. Инкубировать колбу при 37 °C в присутствии 5% CO₂ в течение 24 ч.
   16. Аспирировать цитозинарабинозид, содержащий среду из колбы. Промыть колбу 3x 5 мл 1x DPBS.
   17. Наполните колбу для культивирования 5 мл полной питательной среды SCs (Таблица материалов) и инкубируйте при 37 °C в присутствии 5% CO₂ в течение 48 ч. Обновляйте полную культуральную среду SC через день до тех пор, пока SCs не достигнут 80% слияния.
   18. Аспирировать супернатант из диссоциированного кожного слоя (стадия 1.3.8) и повторно суспендировать клеточную гранулу 5 мл фибробластной полной среды (базальная среда фибробластов + 5% FBS + 1x антибиотик).
   19. Количественная оценка количества клеток и жизнеспособности клеток.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь для количественной оценки количества и жизнеспособности ячеек использовалось специализированное устройство для отбора проб и окрашивания клеток (Таблица материалов) в соответствии с инструкциями производителя.
   20. Обложите фибробласты плотностью клеток 4,0 х 10³ клетки/мл в колбах культуры Т25 (без предварительного покрытия) с использованием 5 мл фибробластной полной среды. Инкубировать при 37 °C в присутствии 5% CO₂ в течение ночи (~12-16 ч инкубации).
   21. Через 16-24 ч подтвердить адгезию клеток с помощью микроскопии (Таблица материалов) при 10-кратном увеличении. Аспирировать неадгезивные клетки из колбы и дважды промыть колбу 5 мл 1x DPBS.
   22. Добавить 5 мл свежей фибробластной полной среды и инкубировать при 37 °C в присутствии 5% CO₂ в течение 48 ч. Обновляйте культуральную среду через день до тех пор, пока фибробласты не достигнут желаемого слияния для проходных или последующих анализов (50-80% слияние).

2. Верификация эпидермальных кератиноцитов, кожных СК и белкового маркера фибробластов иммунофлуоресценцией

1. День 1 - Стеклянные слайды камеры покрытия и отсоединяющие ячейки
   1. Предварительное покрытие стеклянных слайдов с 4-луночной камерой коллагеном-I для кератиноцитов или PLL для SCs или, только 1x DPBS для фибробластов (0,5 мл в каждой лунке). Убедитесь, что покрыта вся поверхность. Инкубационная камера скользит при 37 °C в течение 2 ч. Во время инкубации подготовьте клетки.
   2. После того, как культивируемые клетки достигнут 50%-80% слияния, промыть колбы 1x DPBS 3x (1 мл на каждую лунку).
   3. Отсоедините прилипшие клетки 5 мл 0,25% раствора трипсина-ЭДТА (ТЭ) путем инкубации при 37 °C в присутствии 5% CO₂ в течение 2 мин, пока клетки не начнут становиться круглыми. Визуализация отслоения клеток с помощью микроскопии (Таблица материалов) с 10-кратным увеличением.
   4. После инкубации переложите раствор ТЭ, содержащий клетки, в коническую трубку с 5 мл фетальной бычьей сыворотки (FBS).
   5. Добавьте 5 мл буфера нейтрализации трипсина (TNB) в колбу для культивирования, а затем перенесите содержимое в вышеупомянутую центрифужную трубку (клетки с TE и FBS). Визуализация отслоения клеток с помощью микроскопии (Таблица материалов) с 10-кратным увеличением.
      ПРИМЕЧАНИЕ: TNB или FBS или оба могут быть использованы для нейтрализации активности трипсина.
   6. Центрифугирование конической трубки, содержащей ячейки/TE/TNB при 870 х г в течение 5 мин. Перенесите надосадочную среду в другую трубку и повторно суспендируйте клеточную гранулу в соответствующей полной питательной среде. Измерьте жизнеспособность клеток, как указано на этапе 1.2.11.
   7. Промыть предварительно покрытые стеклянные стекла камеры (этап 2.1.1) 1x DPBS (1 мл для каждой скважины) 3x.
   8. Полусухие горки внутри тканевой культуральной вытяжки и семенных кератиноцитов, СК или фибробластов с соответствующей плотностью (30 000 клеток / 0,5 мл / камера) в соответствующей полной клеточной питательной среде.
   9. Инкубируйте скользящие ступени камеры при 37 °C в течение ночи, чтобы ячейки прилипали.
2. День 2 - Блокирование стеклянной горки камеры с помощью бычьего сывороточного альбумина (BSA) и инкубации первичных антител
   1. Аспирируйте клеточную среду из камерных слайдов и промывайте 3x с 1 мл 1x DPBS.
   2. Зафиксируйте прилипшие клетки 4% параформальдегидом в 1x DPBS (1 мл на каждую лунку) и инкубируйте в течение 15 мин на RT внутри вытяжки культуры тканей.
   3. Аспирировать 4% параформальдегида из камерных слайдов и промыть камерные слайды 3x с 1x DPBS (1 мл для каждой скважины).
   4. Пермеабилизируют клеточные мембраны 1% TritonX-100 в 1x DPBS (1 мл на каждую лунку) и инкубируют в течение 15 мин при RT.
   5. Аспирировать блокирующий раствор из камерных слайдов, промыть 3x с 1x DPBS (1 мл для каждой скважины) в течение 30 с, а затем аспирировать 1x DPBS из скважины.
   6. Заблокируйте камерные слайды с 5% BSA (0,5 мл на каждую лунку) и инкубируйте в течение 45 мин на RT.
   7. Аспирировать блокирующий раствор с горок камеры, промыть 3x с 1x DPBS (1 мл для каждой скважины) в течение 30 с каждая, а затем аспирировать 1x DPBS из скважины.
   8. Разбавляют первичные антитела 5% BSA (0,2 мл на каждую лунку) (Первичные разведения антител: Кератиноциты: мышиный цитокератин 14 антитело (1:100) и цитокератин 10 антитело (1:100); Шванновские клетки: антитело S100 мыши (1:200) и антитело рецептора фактора роста нервов кролика (p75-NTR) (1:500); Фибробласты: антитело к виментину кролика (1:200) и антитело к альфа-гладкомышечному актину мыши (α-СМА) (1:200)).
   9. Добавляют первичные антитела к соответствующим клеткам на стеклянном слайде камеры и инкубируют в течение примерно 15-16 ч (ночью) при 4 °C в увлажненной камере.
   10. Аспирировать первичные антитела из камерных слайдов, промыть 3 раза 1x DPBS (1 мл для каждой лунки) в течение 30 с каждая, а затем аспирировать 1x DPBS из скважины.
   11. Разбавляют вторичные антитела (Козье анти-кролик IgG Вторичное антитело-Alexa Fluor 488 (1:500) и Козье анти-Мышиное IgG Вторичное антитело-Alexa Fluor 594 (1:500)) с 0,5% BSA. Добавьте соответствующее вторичное антитело к каждой лунке (0,2 мл на каждую лунку). Инкубировать в течение 45 мин на RT.
   12. Аспирировать вторичное антитело из камерных слайдов, промыть 3x с 1x DPBS (1 мл для каждой лунки) в течение 30 с каждая, а затем аспирировать 1x DBPS из скважины.
   13. Снимите прокладку на затворе камеры с 4 лунками с помощью абсорбционного средства. Старайтесь не оставлять клея на слайде, так как это мешает нанесению крышки. Добавьте каплю монтажной среды с 4',6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI). В качестве альтернативы можно окрасить скважины с помощью DAPI и использовать монтажную среду, не содержащую этикетки.
   14. Осторожно поместите крышку на стеклянную горку, избегая пузырьков воздуха, и запечатайте конец крышки клеем. Наблюдение за паттернами иммунофлуоресцентного окрашивания с помощью микроскопии (Таблица материалов) при 10-кратном и/или 20-кратном увеличении.

Результаты

Нормальная неонатальная крайняя плоть использовалась для выделения первичных эпидермальных кератиноцитов и кожных СК и фибробластов. Изолированные первичные клетки культивировали в соответствующих клеточных культуральных средах, содержащих факторы роста. После посева СК и фибробл...

Обсуждение

Этот протокол описывает метод выделения трех различных клеточных популяций из одного куска крайней плоти, а именно кератиноцитов, фибробластов и шванновских клеток. Существует несколько протоколов изоляции для выделения кератиноцитов и фибробластов ^2,3,5,6<...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µM sterile filters (Millex-GP Syringe Filter Unit,polyethersulfone)	MilliporeSigma	SLGPR33RS
70 µM cell strainers	CELLTREAT	229483
100 µM cell strainers	CELLTREAT	229485
1 mL disposable syringes	BD Luer-Lok	BD-309659
5 mL disposable syringes (Syringe sterile, single use)	BD Luer-Lok	BD309646
10 mL disposable syringes	BD Luer-Lok	BD305462
1% TritonX-100	Sigma	X100-1L	Prepared at the time of use
4% paraformaldehyde solution	ThermoFisher Scientific	J19943.K2	Ready to use and store at 4 °C
5% BSA	Sigma	A7906-100G	Prepared at the time of use
70% ethanol	Pharmco	111000200
Antibiotic	ScienCell Research	503
Chemometec Vial1-Cassette	Fisher Scientific	NC1420193
Collagenase	Gibco	17018-029
Coverslip	Fisherbrand	12544D 22*50-1.5
Dispase I	Sigma-Aldrich	D46693
DMEM basal medium	ScienCell Research	9221
Dulbecco's phosphate-buffered saline free from Ca2+ and Mg2+ (DPBS)	Corning	21-031-CV)
Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	ThermoFisher Scientific	339651
Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	ThermoFisher Scientific	339653
1.5 mL micro-centrifuge tubes	Fisherbrand	02-681-5
Fetal bovine serum (FBS)	ThermoFisher Scientific	10082147
Fibroblast complete medium	ScienCell Research	2331
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594	Invitrogen	A11032	Dilution (1:500)
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11008	Dilution (1:500)
Hanks' Buffered Saline Solution (HBSS buffer)	Lonza	CC-5022
Human foreskin			De-identified human foreskin tissue for research purposes (Institutional Review Board- IRB #17574).
KGM-GOLD keratinocyte medium (KGM gold and supplements)	Lonza	00192151 and 00192152
Mouse alpha-smooth muscle actin antibody	ThermoFisher Scientific	14-9760-82	Dilution (1:200)
Mouse Cytokeratin14 antibody	Abcam	ab7800	Dilution (1:100)
Mouse S100 antibody	ThermoFisher Scientific	MA5-12969	Dilution (1:200)
Multi chambered (4 well glass slide)	Tab-Tek	154526
NucleoCounter -Via1-Cassette	Chemometec	941-0012
Poly-L-Lysisne (PLL)	ScienCell Research	32503
ProLong Gold Anti-fade Mountant with DAPI	Invitrogen	P36935
Rabbit K10 antibody	Sigma-Aldrich	SAB4501656	Dilution (1:100)
Rabbit p75-NTR antibody	Millipore	AB1554	Dilution (1:500)
Rabbit vimentin	ProteinTech	10366-1-AP	Dilution (1:200)
Schwann cell culture medium	ScienCell Research	1701
Precision tweezers DUMONT straight with extra fine tips Dumostar, 5	ROTH	LH75.1	Sterilize with 70% alcohol before use
IRIS Scissors, sharp/sharp. Length 4–3/8"(111mm)	Codman	54-6500	Sterilize with 70% alcohol before use
Sterilized surgical - sharp blade (Duro Edge Economy Single Edge Blades)	Razor blade company	94-0120	Sterilize with 70% alcohol before use
T25 culture flask	Corning	353109
Trypsin neutralization buffer (TNS)	Lonza	CC-5002
Trypsin/EDTA	Lonza	CC-5012
Inverted microscope	ZEISS	Axio Observer 7- Axiocam 506 mono – Apotome.2 microscope	For immunofluorescence of chamber slide containing stained cells
Inverted microscope	ZEISS	Primovert	For visulaizing/observing cell attachment or detachment