בידוד וירוסים הקשורים ליתושים מיתושים שנאספו בשטח

Summary

רצפים חדשים רבים דמויי וירוסים נמצאו ביתושים בשל השימוש הנרחב בטכנולוגיות ריצוף. אנו מספקים הליך יעיל לבידוד והגברה של וירוסים באמצעות קווי תאים של בעלי חוליות ויתושים, אשר עשוי לשמש בסיס למחקרים עתידיים על וירוסים הקשורים ליתושים, כולל וירוסים המועברים על ידי יתושים וספציפיים ליתושים.

Abstract

עם היישום הרחב של טכנולוגיות ריצוף, רצפים חדשים רבים דמויי וירוסים התגלו בפרוקי רגליים, כולל יתושים. שתי הקטגוריות העיקריות של וירוסים חדשים אלה הקשורים ליתושים הם "וירוסים המועברים על ידי יתושים (MBVs)" ו"וירוסים ספציפיים ליתושים (MSVs)". נגיפים חדשים אלה עשויים להיות פתוגניים הן לבעלי חוליות והן ליתושים, או שהם יכולים פשוט להיות סימביוטיים עם יתושים. וירוסי ישויות חיוניים כדי לאשר את המאפיינים הביולוגיים של וירוסים אלה. לפיכך, תואר כאן פרוטוקול מפורט לבידוד והגברה של וירוסים מיתושים שנאספו בשטח. ראשית, דגימות היתושים הוכנו כסופרנאטים של הומוגנאטים של יתושים. לאחר צנטריפוגה פעמיים, הסופרנאטנטים חוסנו לקו תאי יתוש C6/36 או לקו תאי חוליות BHK-21 להגברת הנגיף. לאחר 7 ימים, הסופרנאטנטים נאספו כסופרנאטנטים P1 ואוחסנו בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, סופרנאטנטים P1 הועברו פעמיים נוספות בתאי C6/36 או BHK-21 בזמן שמצב התא נבדק מדי יום. כאשר התגלתה ההשפעה הציטופתוגנית (CPE) על התאים, סופרנאטנטים אלה נאספו ושימשו לזיהוי נגיפים. פרוטוקול זה משמש כבסיס למחקר עתידי על וירוסים הקשורים ליתושים, כולל MBV ו- MSVs.

Introduction

יתושים הם קבוצה של וקטורים פתוגניים חשובים של פרוקי רגליים. ישנם כ -3,500 מינים של יתושים במשפחה Culicidae ^1,2. פיתוח טכנולוגיות ריצוף בתפוקה גבוהה הוביל לגילוי רצפים חדשים דמויי וירוסים רבים ביתושים ממקומות שונים בעולם³. באופן כללי, ניתן לסווג את הנגיפים הקשורים ליתושים אלה לשתי קבוצות עיקריות: MBVs ו- MSVs.

MBVs הם קבוצה של וירוסים מגוונים שהם גורמים סיבתיים למחלות רבות של בני אדם או בעלי חיים, כגון וירוס קדחת צהובה (YFV), נגיף דנגי (DENV), וירוס דלקת המוח היפנית (JEV), וירוס הנילוס המערבי (WNV) ונגיף קדחת עמק השבר הסורי אפריקאי (RVFV)⁴. הם איימו באופן חמור על בריאות הציבור בכך שגרמו לתחלואה ותמותה קשות הן בבני אדם והן בבעלי חיים ברחבי העולם. MBVs מקיימים באופן טבעי מחזור חיים בין פונדקאים מגוונים באמצעות העברה מיתוש נגוע לפונדקאי תמים, כמו גם מפונדקאי נגוע בנגיף ויתוש האכלה⁵. לכן, נגיפים אלה יכולים להדביק הן שורות תאי יתושים והן שורות תאים של בעלי חוליות במעבדה¹.

MSVs, הכוללים וירוס Yichang (YCN), Culex flavivirus (CxFV) ווירוס Chaoyang (CHAOV), הם תת-קבוצה של וירוסים ספציפיים לחרקים ^1,6,7. בשנים האחרונות, חלה עלייה בגילוי של MSV חדשים, וחלק MSV אלה נמצאו כבעלי השפעה על העברת MBVs. לדוגמה, CxFV, אשר יכול להיות זיהום מתמשך ב Culex pipiens, יכול לדכא שכפול WNV בשלב מוקדם⁸. נגיף פלבי ספציפי נוסף לחרקים, נגיף סוכן איחוי תאים (CFAV), נמצא כמעכב את התפשטות נגיף DENV וזיקה (ZIKV) ביתושים Aedes aegypti ⁹. לפיכך, פרוטוקול זה הוא גישה שימושית לבידוד וירוסים הקשורים ליתושים ויכול לסייע במחקר נוסף על התפלגות פתוגנים הקשורים ליתושים ושליטה במחלות המועברות על ידי יתושים.

Protocol

1. דיגום ומיון יתושים

1. לכדו את היתושים הבוגרים דרך מלכודות האור MXA-02 או מלכודות יתושים פחמן דו חמצני בשטח.
2. הרגו את היתושים שנאספו על ידי טבילה בחנקן נוזלי^10,11. העברתם למעבדה על ידי המערכת הלוגיסטית של שרשרת הקירור¹².
   הערה: קרח יבש שימש בעיקר במערכת הלוגיסטית של שרשרת הקור.
3. (אופציונלי) אם אתרי הדגימה היו בקרבת המעבדה, שלחו ישירות את היתושים החיים במלכודות הרשת למעבדה והרדימו אותם על ידי הקפאה בטמפרטורה של ≤-20 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות⁴.
4. בצע זיהוי מורפולוגי של היתושים שנאספו באמצעות ספר הכלים¹³ לסיווג וזיהוי יתושים.
   הערה: במידת הצורך, ניתן להשתמש ברקוד DNA כדי לסווג ולזהות יתושים^14,15.
5. בהתבסס על תאריכי הדגימה והאתרים, הקצו אותם לבריכות שונות, ולאחר מכן אחסנו אותם בצינורות של 2-5 מ"ל.
6. ציירו טבלה כדי לתעד כל צינור עם מיני יתושים, מספר, קוד דגימה, תאריך ואתרים.
7. הדפס את התוויות עם קודי דגימה והצמיד אותן לצינורות.
8. שמור צינורות עם דגימות יתושים ב -80 ° C עד ניתוח נוסף.

2. טחינת יתושים

1. הכניסו 20-50 יתושים לכל צינור סטרילי בנפח 2 מ"ל עם חרוזי קרמיקה בקוטר 3 מ"מ עם 1.5 מ"ל של תווך Roswell Park Memorial Institute (RPMI) המכיל 2% תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין-אמפוטריצין B.
   הערה: יש לשמור את הצינורות על מגש קרח או ניס.
2. הומוגניזציה של היתושים עם הומוגנייזר רקמות בטמפרטורה נמוכה על ידי טחינה במשך 30 שניות ב 70 הרץ ב 4 ° C במשך שלושה מחזורים¹⁶.
3. צנטריפוגו את התערובות ב-15,000 × גרם למשך 30 דקות ב-4°C והעבירו את הסופרנאטנטים לצינורות חדשים.
4. צנטריפוגה את supernatants שוב ב 15,000 × גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C כדי להסיר את פסולת יתושים^12,17.
   הערה: במידת הצורך, ניתן לסנן את הסופרנאטנטים באמצעות מסנני 0.22 מיקרומטר.
5. Aliquot את supernatants (P0) לתוך 2 מ"ל פקק בורג צינורות אחסון (200 μL לכל צינור) ולאחסן אותם ב -80 ° C.

3. הכנת תאים ואמצעי תחזוקת תרבית תאים

הערה: קו תאי יתוש C6/36 (חסר RNAi Aedes albopictus ) וקו תאי חוליות BHK-21 (כליה של אוגר תינוק) שימשו להגברה ולבידוד הנגיף.

1. יש לחסן 1 × 10⁶ תאי C6/36 לתוך בקבוק 2 בגודל 75 ס"מ עם 10 מ"ל של RPMI בינוני בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי (FBS) ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין (P/S) ב-28°C באינקובטור לח 5% CO².
2. חסן 1 × 10⁶ BHK-21 תאים לתוך בקבוק 2 75 ס"מ עם 10 מ"ל של מדיום הנשר המעובד של Dulbecco (DMEM) בתוספת 10% FBS ו 1% P / S ב 37 ° C באינקובטור 5% CO² לח.
   הערה: התאים עברו פעמיים או שלוש בשבוע^17,18.
3. זרעו את התאים בתרבית^{של 75} ס"מ 2 בקבוקים (C6/36 או BHK-21 תאים) לתוך לוחות 24 בארות (C6/36 לכל באר: 1.4 × 10⁵; BHK-21 לכל באר: 0.8 × 10⁵).
4. הניחו את הצלחות עם 24 הבארות ב-28°C או 37°C למשך הלילה.
5. התבוננו בתאים מתחת למיקרוסקופ ואשרו אם מפגש התאים בכל באר הוא 80%-90%.
6. הכינו את מדיום תחזוקת תרבית התאים (500 מ"ל).
   הערה: עבור C6/36, המדיום היה RPMI בינוני בתוספת 2% FBS ו 2% פניצילין-סטרפטומיצין-Amphotericin B פתרון. עבור BHK-21, המדיום היה DMEM בינוני בתוספת 2% FBS ו 2% פניצילין-סטרפטומיצין-Amphotericin B פתרון.

4. בידוד וירוסים

הערה: כל השלבים בוצעו במעבדה ברמת בטיחות ביולוגית 2 (BSL-2). דרישת רמת הבטיחות של מעבדת הבטיחות הביולוגית נקבעה על ידי הערכת סיכוני הבטיחות הביולוגית בהתבסס על תקנות של מדינות ואזורים שונים. התהליך חייב להתבצע בארון בטיחות ביולוגית.

1. הסר את מדיום תרבית התאים מלוחות 24 הקידוחים והוסף 100 μL של מדיום תחזוקת תרבית התא ו 100 μL של supernatant של הומוגנאט יתוש (P0) לכל באר.
2. יש לדגור על הצלחות בטמפרטורה של 28°C או 37°C למשך 60 דקות ולנער אותן בעדינות כל 15 דקות כדי למנוע התייבשות תאים.
3. הסירו את הסופרנאטנט ושטפו כל אחד מהם היטב בעדינות עם 600 מיקרוליטר של מדיום תחזוקת תרבית תאים כדי להסיר את הלכלוך לחלוטין.
4. הוסף 800 μL של אמצעי תחזוקה של תרבית תאים לכל באר ושמור את הצלחות באינקובטור 5% CO₂ לח ב 28 ° C או 37 ° C במשך 7 ימים.
5. עקוב אחר מצב התא של כל באר תחת המיקרוסקופ מדי יום¹⁵.
6. אספו את הסופרנאטנטים של התאים (P1 supernatants) ביום^השביעי ואחסנו את הסופרנאטנטים בטמפרטורה של -80°C.
7. חזור על שלבים 4.1-4.6 2x כדי לקבל סופרנאטנטים P2 ו-P3.
   הערה: בשלב 4.3, שטיפה עדינה של כל באר עם 600 מיקרוליטר של אמצעי תחזוקה של תרבית תאים הייתה אופציונלית עבור P2 ו-P3.
8. תלוי איזו באר מראה את ההשפעה הציטופתוגנית (CPE) - תאים מתים, פיקנוזיס, ומתנתקים מפני השטח; מיזוג עם תאים סמוכים ליצירת סינקטיה; או הופעתם של גופי הכללה גרעיניים או ציטופלזמיים – הוסיפו 300-400 מיקרוליטר של הסופרנאטנט של CPE זה היטב לכל באר של לוחות 6 בארות חדשים המכילים תאים (מפגש התאים היה 80%-90%) כדי להגביר מאוד את הנגיפים.
9. אספו את הסופרנאטנטים והכניסו אותם לצינורות אחסון של 2 מ"ל פקק בורג (500 מיקרוליטר לצינור). אחסנו אותם בטמפרטורה של -80°C.
   הערה: לאחר שלושה דורות של מעבר רצוף בתאים, הדגימות שלא גרמו ל-CPE הושלכו. במידת הצורך, ניתן להגדיל את הדורות של מעברים רצופים בתאים.

5. איתור רצפים נגיפיים על ידי RT-PCR

1. חלצו את סך כל הרנ"א מ-200 מיקרוליטר של הסופרנאטנט הנגיפי באמצעות ערכת מיני RNA נגיפי¹⁶.
   הערה: כאן, מערכת מיצוי חומצת גרעין אוטומטית שימשה לחילוץ RNA כולל בהתאם להוראות יצרן המכשיר.
2. המר את הרנ"א ל-cDNA בהתאם להוראות ערכת RT-PCR באמצעות מכשיר PCR.
   1. הוסף 15 μL של RNA מעורבב עם 1 μL של פריימרים אקראיים לתוך צינור PCR. מניחים את הצינור בטמפרטורה של 70°C למשך 5 דקות ולאחר מכן מניחים אותו על קרח למשך 5 דקות.
   2. הוסף 5 μL של 5x buffer ו 25 μL של תערובת (10 mM dNTP, 40 U/μL RNase inhibitor, ו 200 U/μL M-MLV) לתוך הצינור ומניחים את הצינור על 42 ° C במשך 60 דקות ו 95 ° C במשך 10 דקות.
   3. יש לאחסן את הצינור בטמפרטורה של -20°C.
3. השתמש בערכת PCR ובפריימרים אוניברסליים (טבלה 1) כדי לזהות וירוסים באמצעות PCR.
   1. עבור arboviruses, להגדיר את מערכת התגובה PCR (סה"כ 30 μL) עם הרכיבים הבאים: 3 μL של 10x Taq buffer, 3 μL של dNTP (1mM), 1 μL של פריימר קדמי (10 μm), 1 μL של פריימר הפוך (10 μm), 0.3 μL של Taq (10 U/μL), 19.7 μL של ddH 2 O, ו₂μL של cDNA.
   2. לזיהוי flaviviruses, להגדיר את תהליך התגובה כמו: שלב 1: 35 מחזורים של 94 ° C עבור 30 שניות, 52 ° C עבור 30 שניות, ו 72 ° C עבור 30 שניות; שלב 2: 72 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
   3. לזיהוי אלפא-וירוסים, הגדר את תהליך התגובה כ: שלב 1: 35 מחזורים של 94 ° C עבור 30 שניות, 50 ° C עבור 30 שניות, ו 72 ° C עבור 30 שניות; שלב 2: 72 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
   4. לזיהוי של bunyaviruses, להגדיר את תהליך התגובה כמו: שלב 1: 35 מחזורים של 94 ° C עבור 30 שניות, 50 ° C עבור 30 שניות, ו 72 ° C עבור 30 שניות; שלב 2: 72 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
4. זהה את מוצרי הגברה PCR על ידי 1% אלקטרופורזה ג'ל agarose ולשלוח אותם לניתוח ריצוף.
   הערה: אם התנאים מאפשרים זאת, הסופרנאטנטים יכולים לעבור ניתוח ריצוף של הדור הבא כדי לזהות וירוסים חדשים ולקבל את כל הגנום הנגיפי.

תוצאות

לאחר שחוסנו עם הסופרנאטנטים של ההומוגנטים של היתושים (P0), תאי C6/36 הציגו מרחב בין-תאי רחב, ותאי פילינג נצפו בשעה 120 שעות (איור 1A) בהשוואה לתאים הלא מחוסנים (קבוצת ביקורת) באותו זמן (איור 1B). לאחר הדגירה על תאי BHK-21 עם סופרנאטנטים P3, CPE נראה בתאי BHK-21 לאחר 48 שעות (איור ...

Discussion

מטרת שיטה זו הייתה להציע דרך מעשית לבידוד נגיפים הקשורים ליתושים באמצעות קווי תאים שונים. חיוני להוסיף את האנטיביוטי-אנטי-מיקוטי (פניצילין-סטרפטומיצין-אמפוטריצין) לסופרנאטנטים של ההומוגנטים של היתושים כדי למנוע זיהום על ידי חיידקים או פטריות. יתושים וסופרנאטנטים נגיפיים המתקבלים בשדה ח...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm membrane filter	Millipore	SLGP033RB	Polymer films with specific pore ratings.To remove cell debris and bacteria.
24-well plates	CORNING	3524	Containers for cell
75 cm2 flasks	CORNING	430641	Containers for cell
a sterile 2 mL tube with 3 mm ceramic beads
Antibiotic-Antimycotic	Gibco	15240-062	Antibiotic in the medium to prevent contamination from bacteria and fungi
Automated nucleic acid extraction system	NanoMagBio	S-48
BHK-21 cells	National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology
C6/36 cells	National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology
Centrifugal machine	Himac	CF16RN	Instrument for centrifugation of mosquito samples
CO2
Dulbecco’s minimal essential medium (DMEM)	Gibco	C11995500BT	medium for vertebrate cell lines
Ebinur Lake virus			Cu20-XJ isolation
Feta Bovine Serum (FBS)	Gibco	10099141C	Provide nutrition for cells
high-speed low-temperature tissue homogenizer	servicebio	KZ-III-F	Instrument for grinding
incubator (28 °C)	Panasonic	MCO-18AC	Instrument for cell culture
incubator (37 °C)	Panasonic	MCO-18AC	Instrument for cell culture
PCR tube
penicillin-streptomycin	Gibco	15410-122	Antibiotic in the medium to prevent contamination from bacteria
Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B Solution	Gibco	15240096
Refrigerator (-80 °C)	sanyo	MDF-U54V
Roswell Park Memorial Institute  medium (RPMI)	Gibco	C11875500BT	medium for mosiquto cell lines
Screw cap storage tubes (2 mL)	biofil	FCT010005
sterile pestles	Tiangen	OSE-Y004	Consumables  for grinding
TGrinder OSE-Y30 electric tissue grinder	Tiangen	OSE-Y30	Instrument for grinding
The dissecting microscope	ZEISS	stemi508
the light traps MXA-02	Maxttrac
The mosquito absorbing machine	Ningbo Bangning
The pipette tips	Axygen	TF
The QIAamp viral RNA mini kit	QIAGEN	52906
Tweezers	Dumont	0203-5-PO