Sahada Toplanan Sivrisineklerden Sivrisinek İlişkili Virüs İzolasyonu

Özet

Dizileme teknolojilerinin yaygın kullanımı nedeniyle sivrisineklerde çok sayıda yeni virüs benzeri sekans bulunmuştur. Omurgalı ve sivrisinek hücre hatlarını kullanarak virüsleri izole etmek ve büyütmek için etkili bir prosedür sunuyoruz; bu, sivrisinek kaynaklı ve sivrisineğe özgü virüsler de dahil olmak üzere sivrisinekle ilişkili virüsler üzerine gelecekteki çalışmaların temelini oluşturabilir.

Özet

Dizileme teknolojilerinin geniş uygulamasıyla, sivrisinekler de dahil olmak üzere eklembacaklılarda birçok yeni virüs benzeri dizi keşfedilmiştir. Bu yeni sivrisinek ilişkili virüslerin iki ana kategorisi "sivrisinek kaynaklı virüsler (MBV'ler)" ve "sivrisineğe özgü virüsler (MSV'ler)" dir. Bu yeni virüsler hem omurgalılar hem de sivrisinekler için patojenik olabilir veya sadece sivrisineklerle simbiyotik olabilirler. Varlık virüsleri, bu virüslerin biyolojik karakterlerini doğrulamak için gereklidir. Bu nedenle, burada virüs izolasyonu ve sahada toplanan sivrisineklerden amplifikasyon için ayrıntılı bir protokol açıklanmıştır. İlk olarak, sivrisinek örnekleri sivrisinek homojenatlarının süpernatantları olarak hazırlandı. İki kez santrifüjlemeden sonra, süpernatanlar daha sonra virüs amplifikasyonu için sivrisinek hücre hattı C6/36 veya omurgalı hücre hattı BHK-21'e aşılandı. 7 gün sonra, süpernatantlar P1 süpernatantları olarak toplandı ve -80 ° C'de depolandı. Daha sonra, hücre durumu günlük olarak kontrol edilirken, P1 süpernatantları C6/36 veya BHK-21 hücrelerinde iki kez daha geçirildi. Hücreler üzerindeki sitopatojenik etki (CPE) keşfedildiğinde, bu süpernatanlar toplandı ve virüsleri tanımlamak için kullanıldı. Bu protokol, MBV'ler ve MSV'ler de dahil olmak üzere sivrisinek ile ilişkili virüsler hakkında gelecekteki araştırmaların temelini oluşturur.

Giriş

Sivrisinekler, önemli patojenik eklembacaklı vektörlerin bir grubudur. Culicidae ^1,2 familyasında yaklaşık 3.500 sivrisinek türü vardır. Yüksek verimli dizileme teknolojilerinin geliştirilmesi, dünyanın farklı yerlerinden gelen sivrisineklerde birçok yeni, virüs benzeri dizinin keşfedilmesine yol açmıştır³. Genel olarak, bu sivrisinek ile ilişkili virüsler iki ana gruba ayrılabilir: MBV'ler ve MSV'ler.

MBV'ler, sarı humma virüsü (YFV), dang virüsü (DENV), Japon ensefalit virüsü (JEV), Batı Nil virüsü (WNV) ve Rift Vadisi ateş virüsü (RVFV)⁴ gibi birçok insan veya hayvan hastalığının etken maddeleri olan çeşitli virüslerden oluşan bir gruptur. Tüm dünyada hem insanlarda hem de hayvanlarda ciddi morbidite ve mortaliteye neden olarak halk sağlığını ciddi şekilde tehdit etmişlerdir. MBV'ler, enfekte bir sivrisinekten naif bir konakçıya, ayrıca virüs bulaşmış bir konakçıdan ve beslenen bir sivrisineğe bulaşma yoluyla çeşitli konakçılar arasında doğal olarak bir yaşam döngüsünü sürdürür⁵. Bu nedenle, bu virüsler laboratuar^1'de hem sivrisinek hücre hatlarını hem de omurgalı hücre hatlarını enfekte edebilir.

Yichang virüsü (YCN), Culex flavivirüsü (CxFV) ve Chaoyang virüsü (CHAOV) içeren MSV'ler, böceklere özgü virüslerin bir alt grubudur ^1,6,7. Son yıllarda, yeni MSV'lerin keşfinde bir artış olmuştur ve bu MSV'lerin bazılarının MBV'lerin iletimi üzerinde bir etkisi olduğu bulunmuştur. Örneğin, Culex pipiens'te kalıcı bir enfeksiyon olabilen CxFV, WNV replikasyonunu erken bir aşama^8'de baskılayabilir. Başka bir böceğe özgü flavivirüs, hücre kaynaştırıcı ajan virüsü (CFAV), Aedes aegypti sivrisineklerinde DENV ve Zika virüsünün (ZIKV) yayılmasını inhibe ettiği bulunmuştur⁹. Bu nedenle, bu protokol sivrisinek ile ilişkili virüsleri izole etmek için yararlı bir yaklaşımdır ve sivrisineklerle ilgili patojenlerin dağılımı ve sivrisinek kaynaklı hastalıkların kontrolü konusunda daha fazla araştırmada yardımcı olabilir.

Protokol

1. Sivrisinek örnekleme ve sıralama

1. Yetişkin sivrisinekleri ışık tuzakları MXA-02 veya sahadaki karbondioksit sivrisinek tuzaklarından yakalayın.
2. Toplanan sivrisinekleri sıvı azot^10,11'e batırarak öldürün. Soğuk zincir lojistik sistemi ile laboratuvara taşınması¹².
   NOT: Kuru buz öncelikle soğuk zincir lojistik sisteminde kullanılmıştır.
3. (İsteğe bağlı) Numune alanları laboratuvara yakınsa, ağ tuzaklarındaki canlı sivrisinekleri doğrudan laboratuvara gönderin ve 30 dakika boyunca ≤-20 ° C'de dondurarak ötenazi yapın⁴.
4. Sivrisineklerin sınıflandırılması ve tanımlanması için araç kitabı¹³ aracılığıyla toplanan sivrisineklerin morfolojik bir tanımlamasını yapın.
   NOT: Gerekirse, sivrisinekleri sınıflandırmak ve tanımlamak için DNA barkodlaması kullanılabilir^14,15.
5. Örnekleme tarihlerine ve alanlarına bağlı olarak, bunları farklı havuzlara atayın ve ardından 2-5 mL tüplerde saklayın.
6. Her tüpü sivrisinek türleri, sayısı, örnekleme kodu, tarihi ve yerleri ile kaydetmek için bir tablo çizin.
7. Etiketleri örnekleme kodlarıyla yazdırın ve tüplere yapıştırın.
8. Bir sonraki analize kadar sivrisinek numunelerinin bulunduğu tüpleri -80 ° C'de tutun.

2. Sivrisinek taşlama

1. % 2 Penisilin-Streptomisin-Amfoterisin B Çözeltisi içeren 1,5 mL Roswell Park Memorial Institute (RPMI) ortamı içeren 3 mm seramik boncuklu her 2 mL steril tüpe 20-50 sivrisinek yerleştirin.
   NOT: Tüpleri buz veya anice tepsisinde tutun.
2. Üç döngü¹⁶ için 4 °C'de 70 Hz'de 30 sn öğüterek sivrisinekleri düşük sıcaklıkta bir doku homojenizatörü ile homojenize edin.
3. Karışımları 15.000 × g'da 4 ° C'de 30 dakika boyunca santrifüj edin ve süpernatantları yeni tüplere aktarın.
4. Süpernatantları 15.000 × g'da 4 ° C'de 10 dakika boyunca tekrar santrifüj ederek sivrisinek kalıntılarını^12,17 olarak temizleyin.
   NOT: Gerekirse, süpernatantlar 0,22 μm filtreler kullanılarak filtrelenebilir.
5. Süpernatantları (P0) 2 mL vidalı kapaklı depolama tüplerine (tüp başına 200 μL) alın ve -80 ° C'de saklayın.

3. Hücrelerin hazırlanması ve hücre kültürü bakım ortamı

NOT: Virüs amplifikasyonu ve izolasyonu için sivrisinek hücre hattı C6/36 (Aedes albopictus RNAi eksikliği) ve omurgalı hücre hattı BHK-21 (bebek hamster böbreği) kullanılmıştır.

1. 1 × 10⁶ C6/36 hücrelerini, %5 CO 2_{nemlendirilmiş} inkübatörde 28 °C'de %10 fetal sığır serumu (FBS) ve %1 penisilin/streptomisin (P/S) ile desteklenmiş 10 mL RPMI ortamı ile 75^cm2'lik bir şişeye aşılayın.
2. 1 × 10⁶ BHK-21 hücrelerini, %5 CO₂ nemlendirilmiş inkübatörde 37 °C'de %10 FBS ve %1 P/S ile desteklenmiş 10 mL Dulbecco'nun modifiye Eagle besiyeri (DMEM) ile 75^cm2'lik bir şişeye aşılayın.
   NOT: Hücreler haftada iki veya üç kez^17,18 kez geçirildi.
3. 75^cm2'lik bir şişede (C6/36 veya BHK-21 hücreleri) kültürlenmiş hücreleri 24 delikli plakalara (kuyu başına C6/36: 1.4 × 10⁵; Kuyu başına BHK-21: 0,8 × 10⁵).
4. 24 delikli plakaları gece boyunca 28 °C veya 37 °C'ye yerleştirin.
5. Hücreleri mikroskop altında gözlemleyin ve her bir kuyucuktaki hücre akıcılığının% 80 -% 90 olup olmadığını doğrulayın.
6. Hücre kültürü bakım ortamını (500 mL) hazırlayın.
   NOT: C6/36 için ortam,% 2 FBS ve% 2 Penisilin-Streptomisin-Amfoterisin B Çözeltisi ile desteklenmiş RPMI ortamıydı. BHK-21 için besiyer,% 2 FBS ve% 2 Penisilin-Streptomisin-Amfoterisin B Çözeltisi ile desteklenmiş DMEM besiyeriydi.

4. Virüs izolasyonu

NOT: Tüm adımlar biyogüvenlik seviye 2 (BSL-2) laboratuvarında gerçekleştirilmiştir. Biyogüvenlik laboratuvarının güvenlik seviyesi gereksinimi, farklı ülke ve bölgelerin yönetmeliklerine dayanan biyogüvenlik risk değerlendirmesi ile belirlenmiştir. İşlem bir biyogüvenlik kabininde yapılmalıdır.

1. Hücre kültürü ortamını 24 delikli plakalardan çıkarın ve her bir kuyucuğa 100 μL hücre kültürü bakım ortamı ve 100 μL sivrisinek homojenatının (P0) süpernatantını ekleyin.
2. Plakaları 28 ° C veya 37 ° C'de 60 dakika boyunca inkübe edin ve hücre kurumasını önlemek için her 15 dakikada bir hafifçe sallayın.
3. Süpernatantı çıkarın ve kalıntıları tamamen gidermek için her birini 600 μL hücre kültürü bakım ortamı ile nazikçe durulayın.
4. Her bir oyuğa 800 μL hücre kültürü bakım ortamı ekleyin ve plakaları 7 gün boyunca 28 ° C veya 37 ° C'de% 5 CO₂ nemlendirilmiş bir inkübatörde tutun.
5. Her bir kuyucuğun hücre durumunu mikroskop altında günlük¹⁵ izleyin.
6. 7^{. günde} hücrelerin süpernatantlarını (P1 süpernatantları) toplayın ve süpernatantları -80 ° C'de saklayın.
7. P2 ve P3 süpernatantlarını almak için 4.1-4.6 2x arasındaki adımları yineleyin.
   NOT: Adım 4.3'te, P2 ve P3 için her bir kuyucuğun 600 μL hücre kültürü bakım ortamı ile nazikçe durulanması isteğe bağlıydı.
8. Hangi kuyunun sitopatojenik etkiyi (CPE) gösterdiğine bağlı olarak - hücreler ölür, piknoz ve yüzeyden ayrılır; sinsiti oluşturmak için bitişik hücrelerle füzyon; veya nükleer veya sitoplazmik inklüzyon cisimlerinin ortaya çıkması - virüsleri büyük ölçüde büyütmek için hücreleri içeren yeni 6 delikli plakaların her bir kuyucuğuna (hücre akıntısı% 80-90 idi) bu CPE'nin süpernatantının 300-400 μL'sini ekleyin.
9. Süpernatantları toplayın ve bunları 2 mL vidalı kapaklı depolama tüplerine (tüp başına 500 μL) ayırın. Bunları -80 °C'de saklayın.
   NOT: Hücrelerde üç nesil ardışık geçişten sonra, CPE'yi indüklemeyen örnekler atıldı. Gerekirse, hücrelerde ardışık geçiş nesilleri arttırılabilir.

5. RT-PCR ile viral sekansların tespiti

1. Bir viral RNA mini kiti¹⁶ kullanarak viral süpernatantın 200 μL'sinden toplam RNA'yı çıkarın.
   NOT: Burada, cihaz üreticisinin talimatlarını izleyerek toplam RNA'yı çıkarmak için otomatik nükleik asit ekstraksiyon sistemi kullanılmıştır.
2. Bir PCR cihazı kullanarak RT-PCR kiti talimatlarını izleyerek RNA'yı cDNA'ya dönüştürün.
   1. PCR tüpüne 1 μL rastgele primer ile karıştırılmış 15 μL RNA ekleyin. Tüpü 5 dakika boyunca 70 ° C'de yerleştirin ve ardından 5 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin.
   2. Tüpe 5 μL 5x tampon ve 25 μL karışım (10 mM dNTP, 40 U/μL RNaz inhibitörü ve 200 U/μL M-MLV) ekleyin ve tüpü 60 dakika boyunca 42 °C'de ve 10 dakika boyunca 95 °C'de yerleştirin.
   3. Tüpü -20 °C'de saklayın.
3. PCR ile virüsleri tespit etmek için bir PCR kiti ve evrensel primerler (Tablo 1) kullanın.
   1. Arbovirüsler için, PCR reaksiyon sistemini (toplam 30 μL) aşağıdaki bileşenlerle kurun: 3 μL 10x Taq tamponu, 3 μL dNTP (1mM), 1 μL ileri astar (10 μm), 1 μL ters astar (10 μm), 0,3 μL Taq (10 U / μL), 19,7 μL ddH 2 O ve₂μL cDNA.
   2. Flavivirüslerin tespiti için, reaksiyon sürecini şu şekilde ayarlayın: aşama 1: 30 s için 94 °C, 30 s için 52 °C ve 30 s için 72 °C'lik 35 döngü; 2. aşama: 10 dakika boyunca 72 ° C.
   3. Alfavirüslerin tespiti için, reaksiyon sürecini şu şekilde ayarlayın: aşama 1: 30 s için 94 °C, 30 s için 50 °C ve 30 s için 72 °C'lik 35 döngü; 2. aşama: 10 dakika boyunca 72 ° C.
   4. Bunyavirüslerin tespiti için, reaksiyon sürecini şu şekilde ayarlayın: aşama 1: 30 s için 94 °C, 30 s için 50 °C ve 30 s için 72 °C'lik 35 döngü; 2. aşama: 10 dakika boyunca 72 ° C.
4. PCR amplifikasyon ürünlerini %1 agaroz jel elektroforezi ile tespit edin ve sekanslama analizine gönderin.
   NOT: Koşullar izin verirse, süpernatantlar yeni virüsleri tanımlamak ve tüm viral genom sekeunceslerini elde etmek için yeni nesil dizileme analizine tabi tutulabilir.

Sonuçlar

Sivrisinek homojenatlarının süpernatantları (P0) ile aşılamadan sonra, C6/36 hücreleri geniş bir hücreler arası boşluk sergiledi ve pul pul dökülmüş hücreler 120 saatte (Şekil 1A) aynı anda aşılanmamış hücrelere (kontrol) kıyasla gözlendi (Şekil 1B). BHK-21 hücrelerini P3 süpernatantları ile inkübe ettikten sonra, BHK-21 hücrelerinde kontrol hücrelerinin aksine 48 saatte (Şekil 1C) görünür CPE gö...

Tartışmalar

Bu yöntemin amacı, çeşitli hücre hatlarını kullanarak sivrisinek ile ilişkili virüsleri izole etmek için pratik bir yol sunmaktı. Bakteri veya mantarların kontaminasyonunu önlemek için sivrisinek homojenatlarının süpernatantlarına Antibiyotik-Antimikotik (Penisilin-Streptomisin-Amfoterisin) eklemek çok önemlidir. Sahada elde edilen sivrisinekler ve viral süpernatantlar, tekrarlanan donma-çözülme döngülerini önlemek için -80 ° C'de soğutulmalıdır.

Protokoldeki bi...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm membrane filter	Millipore	SLGP033RB	Polymer films with specific pore ratings.To remove cell debris and bacteria.
24-well plates	CORNING	3524	Containers for cell
75 cm2 flasks	CORNING	430641	Containers for cell
a sterile 2 mL tube with 3 mm ceramic beads
Antibiotic-Antimycotic	Gibco	15240-062	Antibiotic in the medium to prevent contamination from bacteria and fungi
Automated nucleic acid extraction system	NanoMagBio	S-48
BHK-21 cells	National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology
C6/36 cells	National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology
Centrifugal machine	Himac	CF16RN	Instrument for centrifugation of mosquito samples
CO2
Dulbecco’s minimal essential medium (DMEM)	Gibco	C11995500BT	medium for vertebrate cell lines
Ebinur Lake virus			Cu20-XJ isolation
Feta Bovine Serum (FBS)	Gibco	10099141C	Provide nutrition for cells
high-speed low-temperature tissue homogenizer	servicebio	KZ-III-F	Instrument for grinding
incubator (28 °C)	Panasonic	MCO-18AC	Instrument for cell culture
incubator (37 °C)	Panasonic	MCO-18AC	Instrument for cell culture
PCR tube
penicillin-streptomycin	Gibco	15410-122	Antibiotic in the medium to prevent contamination from bacteria
Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B Solution	Gibco	15240096
Refrigerator (-80 °C)	sanyo	MDF-U54V
Roswell Park Memorial Institute  medium (RPMI)	Gibco	C11875500BT	medium for mosiquto cell lines
Screw cap storage tubes (2 mL)	biofil	FCT010005
sterile pestles	Tiangen	OSE-Y004	Consumables  for grinding
TGrinder OSE-Y30 electric tissue grinder	Tiangen	OSE-Y30	Instrument for grinding
The dissecting microscope	ZEISS	stemi508
the light traps MXA-02	Maxttrac
The mosquito absorbing machine	Ningbo Bangning
The pipette tips	Axygen	TF
The QIAamp viral RNA mini kit	QIAGEN	52906
Tweezers	Dumont	0203-5-PO