Isolement du virus associé aux moustiques à partir de moustiques collectés sur le terrain

Résumé

De nombreuses nouvelles séquences pseudo-virales ont été trouvées chez les moustiques en raison de l’utilisation intensive des technologies de séquençage. Nous fournissons une procédure efficace pour isoler et amplifier les virus à l’aide de lignées cellulaires de vertébrés et de moustiques, qui pourrait servir de base à de futures études sur les virus associés aux moustiques, y compris les virus transmis par les moustiques et les virus spécifiques aux moustiques.

Résumé

Grâce à la vaste application des technologies de séquençage, de nombreuses nouvelles séquences virales ont été découvertes chez les arthropodes, y compris les moustiques. Les deux principales catégories de ces nouveaux virus associés aux moustiques sont les « virus transmis par les moustiques » et les « virus spécifiques aux moustiques (MSV) ». Ces nouveaux virus pourraient être pathogènes à la fois pour les vertébrés et les moustiques, ou ils pourraient simplement être symbiotiques avec les moustiques. Les virus d’entité sont essentiels pour confirmer les caractéristiques biologiques de ces virus. Ainsi, un protocole détaillé a été décrit ici pour l’isolement et l’amplification du virus à partir de moustiques collectés sur le terrain. Tout d’abord, les échantillons de moustiques ont été préparés en tant que surnageants d’homogénats de moustiques. Après une centrifugation à deux reprises, les surnageants ont ensuite été inoculés dans la lignée cellulaire de moustiques C6/36 ou la lignée cellulaire de vertébrés BHK-21 pour l’amplification du virus. Après 7 jours, les surnageants ont été collectés en tant que surnageants P1 et stockés à -80 °C. Ensuite, les surnageants P1 ont été passés deux fois de plus dans les cellules C6/36 ou BHK-21 pendant que l’état de la cellule était vérifié quotidiennement. Lorsque l’effet cytopathogène (ECP) sur les cellules a été découvert, ces surnageants ont été recueillis et utilisés pour identifier les virus. Ce protocole sert de base à la recherche future sur les virus associés aux moustiques, y compris les MBV et les MSV.

Introduction

Les moustiques sont un groupe d’arthropodes vecteurs pathogènes importants. Il existe environ 3 500 espèces de moustiques dans la famille Culicidae ^1,2. Le développement de technologies de séquençage à haut débit a conduit à la découverte de nombreuses séquences nouvelles ressemblant à des virus chez des moustiques de différentes parties du monde³. En général, ces virus associés aux moustiques peuvent être classés en deux groupes principaux : les MBV et les MSV.

Les MBV sont un groupe de virus divers qui sont les agents responsables de nombreuses maladies hum....

Protocole

1. Échantillonnage et tri des moustiques

1. Piègez les moustiques adultes à travers les pièges lumineux MXA-02 ou les pièges à moustiques au dioxyde de carbone sur le terrain.
2. Tuez les moustiques collectés en trempant dans de l’azote liquide^10,11. Les transporter au laboratoire par le système logistique de la chaîne du froid¹².
   NOTE: La glace sèche était principalement utilisée dans le système logistique de la chaîne du froid.
3. (Facultatif) Si les sites d’échantillonnage se trouvaient à proximité du laboratoire, envoyer directement les moust....

Résultats

Après inoculation avec les surnageants des homogénats de moustiques (P0), les cellules C6/36 présentaient un large espace intercellulaire, et des cellules exfoliées ont été observées à 120 h (Figure 1A) par rapport aux cellules non inoculées (témoin) en même temps (Figure 1B). Après incubation des cellules BHK-21 avec les surnageants P3, une CPE visible a été observée dans les cellules BHK-21 à 48 h (Figure 1C) contr.......

Discussion

L’objectif de cette méthode était d’offrir un moyen pratique d’isoler les virus associés aux moustiques à l’aide de diverses lignées cellulaires. Il est essentiel d’ajouter l’antibiotique-antimycotique (pénicilline-streptomycine-amphotéricine) aux surnageants des homogénats de moustiques pour éviter la contamination par des bactéries ou des champignons. Les moustiques et les surnageants viraux obtenus sur le terrain doivent être réfrigérés à -80 °C pour éviter les cycles répétés de gel-dé.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm membrane filter	Millipore	SLGP033RB	Polymer films with specific pore ratings.To remove cell debris and bacteria.
24-well plates	CORNING	3524	Containers for cell
75 cm2 flasks	CORNING	430641	Containers for cell
a sterile 2 mL tube with 3 mm ceramic beads
Antibiotic-Antimycotic	Gibco	15240-062	Antibiotic in the medium to prevent contamination from bacteria and fungi
Automated nucleic acid extraction system	NanoMagBio	S-48
BHK-21 cells	National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology
C6/36 cells	National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology
Centrifugal machine	Himac	CF16RN	Instrument for centrifugation of mosquito samples
CO2
Dulbecco’s minimal essential medium (DMEM)	Gibco	C11995500BT	medium for vertebrate cell lines
Ebinur Lake virus			Cu20-XJ isolation
Feta Bovine Serum (FBS)	Gibco	10099141C	Provide nutrition for cells
high-speed low-temperature tissue homogenizer	servicebio	KZ-III-F	Instrument for grinding
incubator (28 °C)	Panasonic	MCO-18AC	Instrument for cell culture
incubator (37 °C)	Panasonic	MCO-18AC	Instrument for cell culture
PCR tube
penicillin-streptomycin	Gibco	15410-122	Antibiotic in the medium to prevent contamination from bacteria
Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B Solution	Gibco	15240096
Refrigerator (-80 °C)	sanyo	MDF-U54V
Roswell Park Memorial Institute  medium (RPMI)	Gibco	C11875500BT	medium for mosiquto cell lines
Screw cap storage tubes (2 mL)	biofil	FCT010005
sterile pestles	Tiangen	OSE-Y004	Consumables  for grinding
TGrinder OSE-Y30 electric tissue grinder	Tiangen	OSE-Y30	Instrument for grinding
The dissecting microscope	ZEISS	stemi508
the light traps MXA-02	Maxttrac
The mosquito absorbing machine	Ningbo Bangning
The pipette tips	Axygen	TF
The QIAamp viral RNA mini kit	QIAGEN	52906
Tweezers	Dumont	0203-5-PO