현장에서 채취한 모기로부터 모기 관련 바이러스 분리

요약

수많은 새로운 바이러스 유사 서열이 시퀀싱 기술의 광범위한 사용으로 인해 모기에서 발견되었습니다. 우리는 척추동물 및 모기 세포주를 사용하여 바이러스를 분리하고 증폭하는 효과적인 절차를 제공하며, 이는 모기 매개 및 모기 특이적 바이러스를 포함한 모기 관련 바이러스에 대한 향후 연구의 기초가 될 수 있습니다.

초록

시퀀싱 기술의 광범위한 적용으로 모기를 포함한 절지동물에서 많은 새로운 바이러스 유사 서열이 발견되었습니다. 이러한 새로운 모기 관련 바이러스의 두 가지 주요 범주는 "모기 매개 바이러스(MBV)"와 "모기 특이 바이러스(MSV)"입니다. 이 새로운 바이러스는 척추동물과 모기 모두에 병원성일 수도 있고 모기와 공생할 수도 있습니다. 엔티티 바이러스는 이러한 바이러스의 생물학적 특성을 확인하는 데 필수적입니다. 따라서, 현장에서 채취한 모기로부터 바이러스 분리 및 증폭을 위한 상세한 프로토콜이 여기에 설명되었다. 먼저, 모기 샘플을 모기 균질액의 상청액으로 제조하였다. 2회 원심분리 후, 상층액을 바이러스 증폭을 위해 모기 세포주 C6/36 또는 척추동물 세포주 BHK-21에 접종하였다. 7일 후, 상청액을 P1 상청액으로서 수집하고, -80°C에서 보관하였다. 다음으로, P1 상청액을 C6/36 또는 BHK-21 세포에 2회 더 계대배양하면서 세포 상태를 매일 확인했습니다. 세포에 대한 세포병리학적 효과(CPE)가 발견되었을 때, 이러한 상청액을 수집하여 바이러스를 식별하는 데 사용했습니다. 이 프로토콜은 MBV 및 MSV를 포함한 모기 관련 바이러스에 대한 향후 연구의 기초 역할을 합니다.

서문

모기는 중요한 병원성 절지 동물 벡터 그룹입니다. Culicidae ^1,2과에는 약 ^3,500 종의 모기가 있습니다. 고처리량 염기서열 분석 기술의 개발로 인해 세계 여러 지역의 모기에서 바이러스와 유사한 새로운 염기서열이 많이 발견되었습니다³. 일반적으로 이러한 모기 관련 바이러스는 MBV와 MSV의 두 가지 주요 그룹으로 분류할 수 있습니다.

MBV는 황열병 바이러스(YFV), 뎅기열 바이러스(DENV), 일본 뇌염 바이러스(JEV), 웨스트 나일 바이러스(WNV) 및 리프트 밸리 열병 바이러스(RVFV^)와 같은 많은 인간 또는 동물 질병의 원인 물질인 다양한 바이러스 그룹입니다4. 그들은 전 세계의 인간과 동물 모두에게 심각한 이환율과 사망률을 유발하여 공중 보건을 심각하게 위협했습니다. MBV는 감염된 모기에서 순진한 숙주로, 바이러스에 감염된 숙주와 먹이를 먹는 모기로 전염됨으로써 다양한 숙주 간의 수명 주기를 자연적으로 유지한다⁵. 따라서 이러한 바이러스는 실험실에서 모기 세포주와 척추동물 세포주를 모....

프로토콜

1. 모기 샘플링 및 분류

1. 가벼운 함정 MXA-02 또는 현장의 이산화탄소 모기 함정을 통해 성인 모기를 잡으십시오.
2. 액체 질소^10,11에 담궈 수집 된 모기를 죽입니다. 콜드 체인 물류 시스템¹²에 의해 실험실로 운송합니다.
   참고: 드라이아이스는 주로 콜드체인 물류 시스템에 사용되었습니다.
3. (선택 사항) 샘플 사이트가 실험실 근처에 있는 경우 그물 덫에 있는 살아있는 모기를 실험실로 직접 보내고 ≤-20°C에서 30분 동안 동결하여 안락사시킵니다⁴.
4. 모기의 분류 및 식별을 위해 도구 책¹³ 을 통해 수집 된 모기의 형태 학적 식별을하십시오.
   참고: 필요하다면, DNA 바코드를 사용하여 모기를 분류하고 식별할 수 있다^14,15.
5. 샘플링 날짜와 부위에 따라 다른 풀에 할당한 다음 2-5mL 튜브에 보관합니다.
6. 모기 종, 수, 샘플링 코드, 날짜 및 장소로 각 튜브를 기록하는 표를 그립니다.
....

결과

모기 균질액(P0)의 상층액을 접종한 후, C6/36 세포는 넓은 세포간 공간을 나타내었고, 박리된 세포는 접종되지 않은 세포(대조군)에 비해 120시간(그림 1A)에서 동시에 관찰되었습니다(그림 1B). BHK-21 세포를 P3 상층액과 함께 배양한 후, 대조군 세포(도 1D)와 대조적으로 48시간(그림 1C)에 BHK-21 세포에서 가시적인 .......

토론

이 방법의 목적은 다양한 세포주를 사용하여 모기 관련 바이러스를 분리하는 실용적인 방법을 제공하는 것이었습니다. 박테리아나 곰팡이에 의한 오염을 피하기 위해 모기 균질액의 상층액에 항생제-항진균제(페니실린-스트렙토마이신-암포테리신)를 첨가하는 것이 중요합니다. 현장에서 얻은 모기와 바이러스 상층액은 반복되는 동결-해동 주기를 피하기 위해 -80°C에서 냉장 보관해야 합니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm membrane filter	Millipore	SLGP033RB	Polymer films with specific pore ratings.To remove cell debris and bacteria.
24-well plates	CORNING	3524	Containers for cell
75 cm2 flasks	CORNING	430641	Containers for cell
a sterile 2 mL tube with 3 mm ceramic beads
Antibiotic-Antimycotic	Gibco	15240-062	Antibiotic in the medium to prevent contamination from bacteria and fungi
Automated nucleic acid extraction system	NanoMagBio	S-48
BHK-21 cells	National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology
C6/36 cells	National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology
Centrifugal machine	Himac	CF16RN	Instrument for centrifugation of mosquito samples
CO2
Dulbecco’s minimal essential medium (DMEM)	Gibco	C11995500BT	medium for vertebrate cell lines
Ebinur Lake virus			Cu20-XJ isolation
Feta Bovine Serum (FBS)	Gibco	10099141C	Provide nutrition for cells
high-speed low-temperature tissue homogenizer	servicebio	KZ-III-F	Instrument for grinding
incubator (28 °C)	Panasonic	MCO-18AC	Instrument for cell culture
incubator (37 °C)	Panasonic	MCO-18AC	Instrument for cell culture
PCR tube
penicillin-streptomycin	Gibco	15410-122	Antibiotic in the medium to prevent contamination from bacteria
Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B Solution	Gibco	15240096
Refrigerator (-80 °C)	sanyo	MDF-U54V
Roswell Park Memorial Institute  medium (RPMI)	Gibco	C11875500BT	medium for mosiquto cell lines
Screw cap storage tubes (2 mL)	biofil	FCT010005
sterile pestles	Tiangen	OSE-Y004	Consumables  for grinding
TGrinder OSE-Y30 electric tissue grinder	Tiangen	OSE-Y30	Instrument for grinding
The dissecting microscope	ZEISS	stemi508
the light traps MXA-02	Maxttrac
The mosquito absorbing machine	Ningbo Bangning
The pipette tips	Axygen	TF
The QIAamp viral RNA mini kit	QIAGEN	52906
Tweezers	Dumont	0203-5-PO