פיצול הידרוג'לים בתפזורת ועיבוד להידרוג'לים גרעיניים ליישומים ביו-רפואיים

Summary

עבודה זו מתארת שיטות פשוטות, ניתנות להתאמה ובעלות נמוכה לייצור מיקרוג'לים עם פיצול שחול, לעבד את המיקרוג'לים להידרוג'לים גרגיריים הניתנים להזרקה, וליישם את ההידרוג'לים הגרעיניים כדיו להדפסת שחול עבור יישומים ביו-רפואיים.

Abstract

הידרוג'לים גרעיניים הם מכלולים תקועים של מיקרו-חלקיקי הידרוג'ל (כלומר, "מיקרוג'לים"). בתחום הביו-חומרים, להידרוג'לים גרגיריים יש תכונות יתרון רבות, כולל יכולת הזרקה, נקבוביות בקנה מידה זעיר ויכולת כוונון על ידי ערבוב אוכלוסיות מיקרוג'ל מרובות. שיטות לייצור מיקרוג'לים מסתמכות לעתים קרובות על תחליבי מים בשמן (למשל, מיקרופלואידיקה, תחליב אצווה, אלקטרוספרייינג) או פוטוליתוגרפיה, אשר עשויים להציג דרישות גבוהות במונחים של משאבים ועלויות, וייתכן שאינם תואמים להידרוג'לים רבים. עבודה זו מפרטת שיטות פשוטות אך יעילות ביותר לייצור מיקרו-ג'לים באמצעות פיצול שחול ולעיבודם להידרוג'לים גרעיניים שימושיים ליישומים ביו-רפואיים (למשל, דיו להדפסה בתלת-ממד). ראשית, הידרוג'לים בתפזורת (תוך שימוש בחומצה היאלורונית ניתנת לפוטו-קרוסלינק (HA) כדוגמה) מובלטים באמצעות סדרה של מחטים בקטרים קטנים יותר ברצף כדי ליצור מיקרוג'לים מקוטעים. טכניקת ייצור מיקרו-ג'ל זו היא מהירה, בעלות נמוכה וניתנת להרחבה רבה. מתוארות שיטות לחסימת מיקרוג'לים להידרוג'לים גרגיריים על ידי צנטריפוגה וסינון מונחה ואקום, עם קישור פוסט-קרוסלינקינג אופציונלי לייצוב הידרוג'ל. לבסוף, הידרוג'לים גרגיריים המיוצרים ממיקרוג'לים מקוטעים מודגמים כדיו להדפסת שחול. בעוד שהדוגמאות המתוארות כאן משתמשות ב- HA הניתן לניתוק פוטו-קרוסלינק להדפסה תלת-ממדית, השיטות ניתנות להתאמה בקלות למגוון רחב של סוגי הידרוג'ל ויישומים ביו-רפואיים.

Introduction

הידרוג'לים גרעיניים מיוצרים באמצעות אריזה של חלקיקי הידרוג'ל (כלומר, מיקרוג'לים) והם סוג מרגש של ביו-חומרים עם תכונות יתרון רבות ליישומים ביו-רפואיים ^1,2,3. בשל המבנה החלקיקי שלהם, הידרוג'לים גרגיריים מדללים גזירה ומרפאים את עצמם, ומאפשרים את השימוש בהם כדיו בהדפסת שחול (ביו), תמיכות גרגיריות להדפסה משובצת וטיפולים הניתנים להזרקה ^4,5,6,7,8,9. בנוסף, החלל הריק בין מיקרוגלים מספק נקבוביות בקנה מידה זעיר לתנועת תאים ודיפוזיה מולקולרית ^8,10,11. יתר על כן, ניתן לשלב אוכלוסיות מיקרו-ג'ל מרובות לפורמולציה אחת כדי לאפשר כוונון משופר ופונקציונליות חומרית 8,10,12,13. תכונות חשובות אלה הניעו את ההתרחבות המהירה של פיתוח הידרוג'ל גרגירי בשנים האחרונות.

יש מגוון של שיטות זמינות ליצירת מיקרוג'לים לקראת ייצור הידרוג'ל גרעיני, כל אחד עם יתרונות וחסרונות משלו. לדוגמה, מיקרוג'לים נוצרים לעתים קרובות מתחלי מים בשמן באמצעות מיקרופלואידיקה של טיפות 4,11,13,14,15,16,17, תחליב אצווה ^{7,18,19,20,21,22}, או אלקטרוספרייינג ^6,23, ^24,25. שיטות אלה מניבות מיקרוג'לים כדוריים בקטרים אחידים (מיקרופלואידיים) או פולידיספראז (תחליבי אצווה, אלקטרוספרייינג). ישנן כמה מגבלות לשיטות ייצור תחליב מים בשמן אלה, כולל ייצור פוטנציאלי בתפוקה נמוכה, הצורך בפתרונות מבשרי הידרוג'ל בצמיגות נמוכה, והעלות והמשאבים הגבוהים להתקנה. בנוסף, פרוטוקולים אלה עשויים לדרוש שמנים וחומרים פעילי שטח קשים שיש לשטוף מהמיקרוגלים באמצעות נהלים המוסיפים שלבי עיבוד, וייתכן שיהיה קשה לתרגם אותם לתנאים סטריליים ליישומים ביו-רפואיים במעבדות רבות. הסרת הצורך בתחליב מים בשמן, ניתן להשתמש גם בליתוגרפיה (צילום), שבה תבניות או מסכות צילום משמשות לשליטה בריפוי של מיקרוג'לים מתמיסות מבשרי הידרוג'ל ^1,26,27. בדומה למיקרופלואידיקה, שיטות אלה עשויות להיות מוגבלות בתפוקת הייצור שלהן, וזהו אתגר גדול כאשר יש צורך בכמויות גדולות.

כחלופה לשיטות אלה, פיצול מכני של הידרוג'לים בתפזורת שימש לייצור מיקרוג'לים בגדלים לא סדירים 19,28,29,30,31,32. לדוגמה, הידרוג'לים בתפזורת יכולים להיווצר מראש ולאחר מכן לעבור דרך רשתות או מסננות כדי ליצור מיקרוג'לים מקוטעים, תהליך שאף נעשה בנוכחות תאים בתוך גדילי מיקרוג'ל^33,34. הידרוג'לים בתפזורת עובדו גם הם למיקרוג'לים עם הפרעה מכנית באמצעות טכניקות כגון השחזה עם טיט ומזיק או באמצעות שימוש בבלנדרים מסחריים 35,36,37. אחרים גם השתמשו בתסיסה מכנית במהלך היווצרות הידרוג'ל כדי לייצר מיקרוג'לים מקוטעים (כלומר, ג'לים נוזליים)³¹.

השיטות כאן מרחיבות את טכניקות הפיצול המכני הללו ומציגות גישה פשוטה לייצור מיקרוג'לים עם פיצול שחול, תוך שימוש בהידרוג'לים של חומצה היאלורונית (HA) הניתנת לפוטו-קרוסלינקינג כדוגמה. פיצול שחול משתמש רק במזרקים ובמחטים כדי לייצר מיקרוג'לים מקוטעים בשיטה זולה, בעלת תפוקה גבוהה וקלה להרחבה המתאימה למגוון רחב של הידרוג'לים^19,32. יתר על כן, שיטות להרכבת מיקרוג'לים מקוטעים אלה להידרוג'לים גרעיניים מתוארות באמצעות צנטריפוגה (אריזה נמוכה) או סינון מונחה ואקום (אריזה גבוהה). לבסוף, היישום של הידרוג'לים גרגיריים מקוטעים אלה נדון לשימוש כדיו להדפסת שחול. מטרת פרוטוקול זה היא להציג שיטות פשוטות הניתנות להתאמה למגוון רחב של הידרוג'לים וניתן ליישם אותן כמעט בכל מעבדה המעוניינת בהידרוג'לים גרעיניים.

Protocol

1. ייצור הידרוג'לים בתפזורת בתוך מזרק באמצעות פוטו-קרוסלינקינג

הערה: סקירה כללית של ייצור הידרוג'ל בתפזורת בתוך מזרק באמצעות פוטו-קרוסלינקינג מוצגת באיור 1. פרוטוקול זה משתמש בחומצה היאלורונית שעברה שינוי בנורבורן (NorHA) כדי לייצר הידרוג'לים בתפזורת באמצעות תגובת תיול-ene בתיווך פוטו. נהלים מפורטים לסינתזה של NorHA מתוארים במקום אחר³⁸. עם זאת, פרוטוקול זה הוא מותאם מאוד לכל הידרוג'ל photocrosslinkable. ראה דיון לקבלת מידע נוסף.

1. נקבעו מראש ריכוזים רצויים של פולימר, קרוסלינקר ויוזמים לפורמולציה של הידרוג'ל בתפזורת. בפרוטוקול זה, תמיסת מבשר ההידרוג'ל מורכבת מנורHA (2 wt.%, ~25% מעלה של שינוי נורבורן), דיתיותריאטול (DTT, 6 mM) ו- Irgacure D-2959 (I2959, 0.05 wt.%). ודא שהרכיבים (1 מ"ל) מומסים במלואם במי מלח עם מאגר פוספט (PBS) בתוך צינור מיקרוצנטריפוגה.
   הערה: בעת הכנת תמיסת מבשר ההידרוג'ל, ניתן להוסיף FITC-dextran בעל משקל מולקולרי גבוה (2 MDa, 0.1 wt.%) לתמיסה כדי לדמיין מיקרוג'לים שיוצרו מאוחר יותר בפרוטוקול באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
2. טען מזרק 3 מ"ל עם תמיסת מבשר הידרוג'ל.
   1. הסר את הבוכנה מגבו של מזרק ריק בגודל 3 מ"ל והוסף מכסה קצה לחלק העליון של חבית המזרק.
   2. השתמש בפיפטה של 1,000 μL כדי להעביר את תמיסת מבשר ההידרוג'ל לתוך חבית המזרק עם מכסה הקצה.
   3. החזק את חבית המזרק עם תמיסת מבשר הידרוג'ל ביד אחת, כאשר מכסה הקצה פונה כלפי מטה והקצה הפתוח של הקנה פונה כלפי מעלה. עם היד השנייה, להחזיר את בוכנת המזרק לפתח של החלק האחורי של חבית המזרק. דוחפים בעדינות את בוכנת המזרק לתוך הקנה, מספיק כדי לאטום את הפתח בחלק האחורי של חבית המזרק.
   4. מחזיקים בזהירות את הבוכנה ואת חבית המזרק יחד כדי להבטיח שהגב של חבית המזרק אטום עם הבוכנה, הופכים את המזרק כך שהבוכנה פונה כלפי מטה, וכובע הקצה פונה כעת כלפי מעלה. הסר את מכסה הקצה ודחף בעדינות את הבוכנה לתוך קנה המזרק עד שכל האוויר מוסר מהמזרק (רק תמיסת מבשר הידרוג'ל נשארת).
   5. חברו מחדש את מכסה הקצה למזרק. ודא כי תמיסת מבשר ההידרוג'ל מאובטחת בתוך מזרק 3 מ"ל עם מכסה קצה.
3. ליצור הידרוג'ל בתפזורת בתוך מזרק 3 מ"ל.
   1. ודא שציוד מגן אישי תקין (PPE) ואמצעי הגנה נלקחים לפני הפעלת מנורת ה- UV. זה כולל הרכבת משקפיים מגנים מפני UV וסגירת אזור המנורה כדי להגן על אחרים מפני אור UV.
   2. כייל את מנורת ריפוי הכתמים UV לעוצמת אור של 10 mW/cm² באמצעות רדיומטר.
      הערה: תהיה הנחתה קלה דרך חבית המזרק. לפני הייצור, קבעו את אחוז הנחתת האור הקיים באמצעות רדיומטר. יש להתאים את תפוקת עוצמת האור ממערכת ריפוי הכתמים בהתאם כדי לקחת בחשבון הנחתה כזו.
   3. הניחו את מזרק ה-3 מ"ל העמוס בתמיסת מבשר ההידרוג'ל מתחת למנורת ריפוי הכתמים UV למשך פרק זמן רצוי לצורך פוטו-קרוסלינק מלא. עבור המערכת המתוארת כאן, תמיסת מבשר ההידרוג'ל NorHA נחשפת לאור UV למשך 5 דקות בעוצמה של 10 mW/cm², אשר, בהתבסס על מחקרים קודמים³⁹, היה מספיק זמן ועוצמת אור כדי להבטיח הצלבה מלאה כפי שנקבע על ידי ריאולוגיה של גזירה מתנדת פוטו-קרוסלינקינג טאטוא זמן.
      הערה: כדי להבטיח פוטו-קרוסלינקינג מלא בתוך המזרק, ניתן להפוך את המזרק באמצע תקופת הפוטו-קרוסלינקינג.
   4. כבו את מנורת ה-UV והסירו את המזרק. ודא כי ההידרוג'ל הוא עכשיו photocrosslinked בתוך המזרק. ניתן לעשות זאת על ידי משיכת הבוכנה לאחור והתבוננות בתנועה ההידרוג'לית כגוש מוצק ולא כנוזל צמיג.

איור 1: סקירה כללית של ייצור הידרוג'לים בתפזורת בתוך מזרק באמצעות פוטו-קרוסלינקינג. האיור מתאר (A) הסרת הבוכנה מהמזרק, (B) אבטחת מכסה הקצה לקנה המזרק, (C) הוספת מבשר הידרוג'ל לקנה המזרק, (D) החזרת הבוכנה למזרק, (E) הסרת עודפי אוויר ואבטחת מכסה הקצה, ו-(F) פוטו-קרוסלינקינג של הידרוג'ל בתפזורת בתוך המזרק. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

2. ייצור מיקרוג'לים באמצעות פיצול שחול

הערה: סקירה כללית של ייצור מיקרו-ג'ל באמצעות פיצול שחול מוצגת באיור 2.

1. הסר את הבוכנה מהחלק האחורי של מזרק ריק של 3 מ"ל. הצמידו מכסה קצה ל-Luer-Lock.
2. הסר את מכסה הקצה מהמזרק המכיל את ההידרוג'ל בתפזורת הפוטו-קרוסלינקית. יישרו את החלק העליון של מזרק ההידרוג'ל עם פתיחת החבית על המזרק הריק.
3. מוציאים את ההידרוג'ל בתפזורת דרך פתח המזרק (ללא מחט מחוברת) לתוך חבית המזרק הריק. השליכו כראוי את המזרק שכעת ריק (הכיל בעבר את ההידרוג'ל) לתוך זרם הפסולת המתאים.
4. החזיקו את המזרק המכיל את ההידרוג'ל המובלט כך שמכסה הקצה פונה כלפי מטה, ופתח הקנה פונה כלפי מעלה. באמצעות פיפטה של 1,000 μL, יש להוסיף 1.5 מ"ל של PBS לקנה המזרק.
5. יישמו את בוכנת המזרק עם פתח הקנה, רק בקושי דחפו את הבוכנה פנימה מספיק כדי ליצור אטימה. הופכים את המזרק כך שהבוכנה פונה כעת כלפי מטה ומכסה הקצה פונה כלפי מעלה, תוך הקפדה להחזיק את הבוכנה ואת חבית המזרק יחד במקומם כך ששום הידרוג'ל או PBS לא ידלוף החוצה. הפוך מספר פעמים כדי לערבב את ההידרוג'ל המקוטע עם ה- PBS שנוסף.
6. החזיקו את המזרק כך שמכסה הקצה פונה כלפי מעלה והבוכנה פונה כלפי מטה. הסר את מכסה הטיפ. דחפו בעדינות רבה את הבוכנה כלפי מעלה כדי להסיר כל אוויר מהחלק הפנימי של המזרק.
   הערה: סביר להניח שיהיה חריץ בחלק האחורי של מזרק 3 מ"ל שידרוש כוח נוסף כדי לדחוף את הבוכנה פנימה. בזהירות רבה לדחוף את הבוכנה מעל החריץ. כל כמות פתאומית או קשה של כוח תגרום לבוכנה לנוע מהר מדי ואולי לגרש את מתלה ההידרוג'ל המקוטע.
7. הוציאו את תרחיף ההידרוג'ל המקוטע באמצעות סדרה של מחטים כדי ליצור מיקרוג'לים מקוטעים.
   1. הצמידו מחט 18 G בעלת קצה קהה לראש המזרק המכילה את ההידרוג'ל המקוטע ואת ה-PBS. מסירים את הבוכנה ממזרק טרי של 3 מ"ל ומצמידים מכסה קצה לחבית המזרק הריקה.
   2. הוציאו את תרחיף ההידרוג'ל המקוטע דרך מחט 18 G לתוך החלק האחורי של חבית המזרק הריקה. השליכו את המזרק הריק ואת המחט לזרם הפסולת החדות המתאים.
   3. החזק את המזרק המכיל את מתלה ההידרוג'ל המקוטע כך שמכסה הקצה פונה כלפי מטה ופתח הקנה פונה כלפי מעלה. יישמו את בוכנת המזרק עם פתח הקנה, רק בקושי דחפו את הבוכנה פנימה מספיק כדי ליצור אטימה.
   4. הופכים את המזרק כך שהבוכנה פונה כעת כלפי מטה, ומכסה הקצה פונה כלפי מעלה, תוך הקפדה להחזיק את הבוכנה ואת חבית המזרק יחד כך ששום הידרוג'ל או PBS לא ידלוף החוצה.
   5. החזיקו את המזרק כך שמכסה הקצה פונה כלפי מעלה והבוכנה פונה כלפי מטה. הסר את מכסה הטיפ. דחפו בעדינות רבה את הבוכנה כלפי מעלה כדי להסיר כל אוויר מהחלק הפנימי של המזרק. ראה את ההערה לעיל לגבי דחיפה עדינה של בוכנת המזרק פנימה כדי למנוע גירוש לא רצוי של חומר הידרוג'ל.
   6. חזור על שלבים 2.7.1-2.7.5 עם מחט של 23 G, 27 G ו- 30 G. עם שלב השחול האחרון (מחט 30 G), שחררו את תרחיף ההידרוג'ל המקוטע לתוך צינורות מיקרוצנטריפוגה. עבור הנפחים המתוארים כאן, נפח ההשעיה הסופי של ההידרוג'ל המקוטע יהיה ~ 2.5 מ"ל, וידרוש שני צינורות מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל (נפח מפוצל באופן שווה).
      הערה: אין צורך בכוח מופרז כדי להוציא תרחיף הידרוג'ל מקוטע דרך המחטים. עבור שיטות הבטיחות הטובות ביותר, מומלץ לבצע את כל שלבי פיצול ההבלטה בתוך מכסה המנוע הכימי כדי לספק הגנה במקרה של לחץ יתר של מזרק במהלך שחול. בנוסף, ניתן לבצע תהליך זה בקלות בארון בטיחות ביולוגית/מכסה מנוע זרימה למינרי כדי לשמור על סטריליות במהלך הייצור. ראה דיון לקבלת הצעות נוספות לפתרון בעיות.
8. לשטוף ולבודד את מתלה ההידרוג'ל המקוטע.
   הערה: שטיפת מיקרו-ג'לים מקוטעים תסייע בהסרת כל פולימר והצלבה שלא טופלו. בנוסף, צנטריפוגה תסייע לבודד את המיקרוג'לים מהתרחיף על ידי יצירת כדור.
   1. באמצעות microcentrifuge, סובבו את תרחיף המיקרוג'ל המקוטע ברזולוציה של 5,000 x g למשך 5 דקות.
   2. השתמש בפיפטה כדי להסיר את supernatant. הוסף 1 מ"ל של PBS לכל צינור microcentrifuge המכיל מיקרוג'לים מקוטעים ומערבולת עבור 5-10 שניות.
   3. חזור על צנטריפוגה ושטיפה עם PBS 3x.

איור 2: סקירה כללית של ייצור מיקרוג'ל באמצעות פיצול שחול. האיור מתאר (A) הבלטת הידרוג'ל בתפזורת לתוך חבית מזרק ריקה והוספת PBS, (B) אבטחת בוכנה במזרק עם הידרוג'ל מקוטע, (C) חיבור מחט 18 G והוצאת תרחיף הידרוג'ל מקוטע לתוך חבית מזרק ריקה, ו-(D) חזרה על צעדי פיצול שחול עם מחטים של 23 G, 27 G ו-30 G, איסוף תרחיף הידרוג'ל מקוטע בצינורות מיקרוצנטריפוגה על שחול סופי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

3. אפיון מיקרו-ג'לים מקוטעים באמצעות ImageJ

הערה: סקירה כללית של אפיון המיקרוג'לים המקוטעים באמצעות ImageJ מוצגת באיור 3, כמו גם תוצאות מייצגות לתיאור התפלגויות גודל וצורות בתוך קבוצה של מיקרוג'לים מקוטעים. מיקרוג'לים צריכים להיות מסומנים באופן פלואורסצנטי לפני ההדמיה. לדוגמה, ניתן לעטוף את FITC-dextran במשקל מולקולה גבוה (2 MDa) בהידרוג'ל בתפזורת לפני הפיצול כדי ליצור מיקרו-ג'לים בעלי תווית פלואורסצין.

1. שלב 20 μL של תרחיף מיקרוג'ל מקוטע עם 180 μL של PBS כדי ליצור מתלה מיקרוג'ל מקוטע מדולל. מערבולת כדי לערבב ביסודיות.
2. מעבירים 50 μL של תרחיף מיקרו-ג'ל מקוטע מדולל לשקופית מיקרוסקופ זכוכית.
3. השתמש במיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי כדי לרכוש תמונות של מיקרוג'לים בעלי תווית פלואורסצנטית בזום של 4x או 10x.
   הערה: יש לדלל את תרחיף המיקרוגל מספיק כך שהמיקרוג'לים השכנים אינם באים במגע זה עם זה, ובכל זאת מרוכזים מספיק כך שעשרות מיקרוג'לים ייראו בנקודת התצפית. דילול ההשעיה של מיקרוג'ל יכול להיות מותאם בהתאם כדי להשיג זאת.
4. שימוש ב-ImageJ כדי לנתח חלקיקי מיקרו-ג'ל מקוטעים. מידע נוסף על השימוש בפונקציונליות Analyze Particles ב- ImageJ ניתן למצוא בקישור המופיע בטבלת החומרים.
   1. פתח את התמונות של מיקרוג'לים בהשעיה ב- ImageJ.
   2. בחר נתח > להגדיר מדידות, לבדוק את האזור, מתארי הצורה וקוטר ה-Feret. לחץ על אישור.
   3. בחר תמונה > הקלד > 8 סיביות.
   4. בחר תמונה > התאם את סף >. התאימו את הסף כך שהמיקרו-ג'לים יכוסו במסכה אדומה, והרקע יישאר שחור. לחץ על החל.
      הערה: אם מיקרו-ג'לים כלשהם חופפים מעט, השתמש בכלי העיפרון כדי לצייר קו שחור דק (<5 פיקסלים) בין מיקרו-ג'לים כדי להפריד ביניהם בתמונה בשחור-לבן.
   5. בחר נתח > נתח חלקיקים. הגדר גודל (פיקסל²) מ- 50-Infinity כדי להפחית את רעשי הרקע. הגדר מעגליות ל- 0.00-1.00. בחר הצג קווי מתאר מהתפריט הנפתח. בדוק את תוצאות התצוגה, אל תכלול בקצוות וכלול חורים. השאר את התיבות הנותרות ללא סימון. לחץ על אישור.
   6. תצוגת תוצאות תיפתח, כולל השטח, מתארי הצורה ומידע הקוטר של Feret עבור כל מיקרו-ג'ל שזוהה. העתק והדבק את התוצאות בגיליון אלקטרוני.
   7. קבע את הקוטר המעגלי המקביל עבור כל חלקיק.
      1. קבל את קנה המידה של התמונה ב- μm/pixel מסרגל קנה המידה או ממידע המכשיר. צור עמודה בגיליון האלקטרוני הממירה את האזור של כל מיקרו-ג'ל מפיקסל² ל- μm².
      2. השתמש בשטח ב- μm² כדי לקבוע את הקוטר המעגלי המקביל של המיקרוג'ל ב- μm (כלומר, קח את השורש הריבועי של השטח המחולק ב- pi, ואז הכפל אותו).
   8. השתמש בסולם μm/pixel כדי להמיר את הקטרים של ה-Feret (כלומר, המרחק הארוך ביותר בין כל שתי נקודות על גבול החלקיק) עבור כל מיקרו-ג'ל ליחידת מיקרומטר.
   9. ניתן להשתמש במעגליות ("Circ."), יחס גובה-רוחב ("AR"), עגולות ("עגול") וערכי מוצקות עבור כל מיקרו-ג'ל כפי שהוא ישיר מ-ImageJ.
   10. נתחו את אוכלוסיית המיקרוג'ל כרצונך, תוך התחשבות בהתפלגות הקטרים (מעגליים מקבילים ו-Feret's), מעגליות, יחס גובה-רוחב, עגולות ומוצקות.

איור 3: סקירה כללית של אפיון חלקיקי מיקרו-ג'ל מקוטעים באמצעות ImageJ. האיור מתאר (A) יצירת תרחיף מדולל של חלקיקי מיקרו-ג'ל מקוטעים ושימוש במיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי או קונפוקלי כדי לצלם מיקרוג'לים בתרחיף (סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר), (B) המרה לתמונה בינארית ב-ImageJ וניתוח חלקיקים (ספירה, מתארי צורה וכו'), ו-(C) תוצאות מייצגות. פסי שגיאה מתארים מינימום ומקסימום עם טווחי הרבעון הפנימיים המסומנים. מוצג גודל אוכלוסייה של n = 100 מיקרוג'לים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

4. הרכבת מיקרוג'לים מקוטעים להידרוג'לים גרעיניים

הערה: מוצגות שתי שיטות לניסוח של הידרוג'לים גרעיניים ממיקרוג'לים מקוטעים, תוך שימוש בצנטריפוגה וסינון. השיטה שבה נעשה שימוש תהיה תלויה באריזת המיקרו-ג'ל הרצויה (כלומר, סינון אורז חלקיקים בצפיפות רבה יותר) ואם מרכיבים ביולוגיים נכללים (כלומר, צנטריפוגה תשמור על רכיבים בין חלקיקים, בעוד שבסינון הם עלולים ללכת לאיבוד). עבודה קודמת⁴⁰ מתארת ביסודיות תוצאות השוואתיות (כלומר, מכניקה, נקבוביות) עבור הידרוג'לים גרגיריים שנוצרו מצנטריפוגות או מסינון מונחה ואקום.

1. אפשרות 1: מיקרו-ג'לים מקוטעים באמצעות צנטריפוגה.
   1. לאחר הסרת supernatant PBS משלב הכביסה האחרון, להוסיף 1 מ"ל של PBS לכל צינור microcentrifuge ולהחיות את המיקרוג'לים.
   2. סובבו את מתלה ההידרוג'ל המקוטע ב-18,000 x גרם למשך 5 דקות.
      הערה: ניתן להשתמש במהירויות צנטריפוגה איטיות יותר לחסימת מיקרוג'לים להידרוג'לים גרעיניים עם אריזה פחות צפופה אם תרצה בכך.
   3. הסר את ה- PBS supernatant.
   4. השג מזרק טרי של 3 מ"ל והסר את הבוכנה. השתמשו במרית מתכת כדי להוציא את ההידרוג'ל הגרעיני המקוטע מתוך צינור המיקרו-צנטריפוג ולהעביר אותו לחלק האחורי של חבית המזרק הריקה. קצה פיפטה יכול לשמש כדי לסייע בהעברת ההידרוג'ל הגרעיני לתוך המזרק. החזירו את הבוכנה למזרק. עכשיו לטעון את הידרוג'ל גרגיר מקוטע לתוך המזרק, והוא מוכן לשימוש.
2. אפשרות 2: פקק מיקרו-ג'לים מקוטעים באמצעות סינון מונחה ואקום. סקירה כללית של חסימה על ידי סינון מונחה ואקום מתוארת באיור 4.
   1. הרכיבו ובדקו את מנגנון הסינון מונחה הוואקום.
      1. אבטחו משפך בוכנר בתוך בקבוקון מסנן, והניחו את מתאם המסנן בין המשפך לפתח הבקבוקון.
      2. השתמש בצינורות כדי לחבר את בקבוקון המסנן לקו ואקום.
      3. מניחים מסנן ממברנה (0.22 מיקרומטר) בכוס המשפך של בוכנר.
      4. הפעל את קו הוואקום על ידי פתיחת שסתום החוגה. בדקו את החיבור על ידי צנרת של כ-0.5 מ"ל PBS על מסנן הממברנה ותראו שכל ה-PBS עובר דרך המסנן ונאסף בתחתית בקבוקון המסנן.
   2. הפעילו את קו הוואקום והבטיחו אטימה מלאה. מערבולת את תרחיף ההידרוג'ל המקוטע כך שמיקרוג'לים תלויים ב- PBS.
   3. באמצעות פיפטה של 1,000 μL, העבר את תרחיף ההידרוג'ל המקוטע למסנן הממברנה (0.22 מיקרומטר). לאחר העברת כל מתלי המיקרוג'ל, המתן עד כ-30 שניות עד שהוואקום ימשוך את PBS מתוך מתלה ההידרוג'ל המקוטע. כבה את קו הוואקום.
      הערה: הזמן שבו מתלה ההידרוג'ל המקוטע יושב על מסנן הממברנה תוך משיכת ואקום יכול להיות מגוון. ראה דיון לקבלת מידע נוסף והצעות לפתרון בעיות.
   4. השג מזרק טרי של 3 מ"ל והסר את הבוכנה. השתמשו במרית מתכת כדי להוציא את ההידרוג'ל הגרעיני המקוטע מהמסנן ולהעביר אותו לחלק האחורי של חבית המזרקים הריקה. קצה פיפטה יכול לשמש כדי לסייע בהעברת ההידרוג'ל הגרעיני לתוך המזרק. החזירו את הבוכנה למזרק. טען את ההידרוג'ל הגרעיני המקוטע לתוך המזרק, וכעת הוא מוכן לשימוש.

איור 4: סקירה כללית של מיקרו-ג'לים תקועים על-ידי סינון מונחה ואקום כדי לייצר הידרוג'לים גרגיריים צפופים. האיור מתאר (A) הצבת מסנן ממברנה על מנגנון סינון הוואקום, (B) שימוש בפיפטה להעברת תרחיף מיקרוג'ל מקוטע על המסנן, (C) משיכת הוואקום והמתנה למיקרוג'לים שייתקעו וייצרו הידרוג'ל גרגירי, (D) כיבוי הוואקום והסרת הידרוג'ל גרגירי מקוטע באמצעות מרית מתכת, ו-(E) שימוש במרית מתכת להעברת הידרוג'ל גרגירי למזרק. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

5. הדפסת שחול עם דיו הידרוג'ל גרגירי

הערה: סקירה כללית של תהליך הדפסת השחול מוצגת באיור 5, כולל הדפסה מייצגת של מבנה בצורת כוכב באמצעות הידרוג'לים גרגיריים מקוטעים עם סינון מונחה ואקום. זרימת העבודה של ההדפסה מורכבת מגיבוש דיו, תכנון עיצוב ההדפסה ולאחר מכן הדפסת הדיו בהתבסס על העיצוב הרצוי⁴¹. אם תרצה, ניתן לייצב מבני הידרוג'ל גרגיריים מודפסים באמצעות פוטו-קרוסלינקינג לאחר ההבלטה על ידי הוספת עודפי DTT (5 mM) ו- I2959 (0.05 wt.%) למתלה המיקרוג'ל המקוטע לפני החסימה. כתוצאה מכך ייווצרו קשרים קוולנטיים פוטו-קרוסליים בין המיקרוג'לים, מה שיוביל לייצוב קבוע של מבנה ההידרוג'ל הגרגירי.

1. ניסוח דיו
   1. במהלך תהליך התכנון, זכור את תכונות הדיו שיש להשתמש בו. כדי לאפיין את הדיו, השלימו את הניתוח הריאולוגי של ההידרוג'לים המקוטעים כדי לסייע בתכנון ההדפסה. שיטות המתארות את האפיון הריאולוגי של הידרוג'לים גרגיריים מתוארות במקום אחר וניתן להתאים אותן למחקר זה⁴⁰.
   2. מתוך הניתוח הריאולוגי, בחר פלטפורמת הדפסה וסדרה של פרמטרי הדפסה ראשוניים.
      הערה: בשל הצמיגות הגבוהה הכוללת ותכונות דילול הגזירה של דיו הידרוג'ל גרגירי, מדפסות שחול מבוססות בורג משמשות בדרך כלל.
2. עיצוב הדפסה
   הערה: תוכנת Repetier Host (המכונה מעתה תוכנת הדפסה בתלת-ממד) משמשת ליישומי הדפסה בתלת-ממד (שלבים 5.2-5.3).
   1. צור את עיצובי ההדפסה באמצעות תוכנת תכנון בעזרת מחשב (CAD). משתמשים יכולים ליצור עיצובים חדשניים מאפס או לשנות עיצובים קיימים מראש, כגון מסריקות רקמות של מטופלים או ממשתמשים אחרים. לקבלת מידע נוסף על יצירת עיצובי CAD, עיין בהפניות הבאות 41,42,43.
   2. כדי לעבד דגמי CAD לתוך G-Code, ודא שקובץ ה- CAD נשמר בתבנית ".stl" (קובץ משלים 1) ומועלה לתוכנת ההדפסה התלת-ממדית על-ידי בחירת לחצן הטעינה בחלונית העליונה או בחירה ב - File > Load בשורת התפריטים. קוד G זה מגדיר את נתיב ההדפסה לתצהיר הדיו. קובץ .stl לדוגמה של גליל חלול נכלל בקבצים המשלימים.
   3. לאחר שקובץ STL הועלה לתוכנת ההדפסה התלת-ממדית, נווט אל החלונית Slicer ובחר ב- Slic3r כאפשרות slicer. כאן, ניתן לכוונן הגדרות כגון קוטר הזרבובית, גובה השכבה, מהירות ההדפסה וקצב ההבלטה בהתבסס על אפיון דיו ותוצאות הדפסה רצויות. בפרוטוקול זה נעשה שימוש במחט של 18 גרם (קוטר פנימי של 838 מיקרומטר). גובה השכבה מוגדר ל-1 מ"מ, מהירות ההדפסה מוגדרת ל-8 מ"מ לשנייה וקצב הזרימה מוגדר ל-9 μL/s, בהתבסס על אופטימיזציה קודמת³⁹. ערכים מספריים של פרמטרים עשויים להיות מותאמים על ידי ± 20% כדי להסביר וריאציות בתכונות של דיו הידרוג'ל גרגירי.
      הערה: חשוב לציין כי ייתכן שיהיה צורך להתאים הגדרות אלה ואת עיצוב ההדפסה באמצעות בדיקות ניסיוניות איטרטיביות, בהתאם להתאמות לניסוח הדיו, רזולוציית ההדפסה הרצויה או פלטפורמת ההדפסה שבה נעשה שימוש. לקבלת מידע נוסף על פרמטרים אלה, כמו גם על אפיון הגדרות הדפסה עם ניסוח דיו חדשני, עיין בהפניות אחרות 40,44,45,46.
3. הדפסת שחול עם הידרוג'לים גרגיריים מקוטעים
   1. להעמסת מזרקים עם הידרוג'לים גרגיריים מקוטעים, ראו 4.2.4, וכן איור 4 ואיור 5.
   2. הסר את מכסה הקצה והחלף אותו במחט לפי בחירה.
   3. טען את המזרק לתוך פלטפורמת ההדפסה המועדפת. כאן, נעשה שימוש במדפסת שחול מבוססת בורג שנבנתה בהתאמה אישית.
      הערה: לקבלת מידע על בניית מדפיסים ביולוגיים מותאמים אישית, ראה הפניות אחרות^44,47.
   4. טען את קובץ ה- G-Code המוכן משלב התכנון לתוכנת ההדפסה התלת-ממדית. נווט אל החלונית 'תצוגה מקדימה של הדפסה ' והקש על הדפס.
   5. ברגע שתצהיר ההדפסה הושלם, חשוף את מבני ההידרוג'ל הגרעיניים המקוטעים לאור UV לצורך פוטו-קרוסלינקינג וייצוב.
   6. לאחר השלמת הקישור ההצלבה, עבדו את הדגימה על ידי שטיפתה ב-PBS שלוש פעמים.

איור 5: סקירה כללית של הדפסת שחול עם הידרוג'לים גרגיריים מקוטעים. האיור מתאר את (A) שימוש במרית להעברת הידרוג'ל גרגירי מקוטע לקנה מזרק, (B) חיבור מחט קהה בעלת קצה קהה (18 G מוצג) ודחיפת הדגימה למעלה, (C) גרפיקה המייצגת את החיבור לתוכנת מחשב להדפסה, ו-(D) השלמת הדפסת מבנה בצורת כוכב עם הידרוג'ל גרגירי מקוטע. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

תוצאות

תוצאות מייצגות מפרוטוקולים אלה מוצגות באיור 3 ובאיור 6. פיצול שחול מניב מיקרוג'לים בעלי צורות מצולע משוננות בקטרים הנעים בין 10-300 מיקרומטר (איור 3). יתר על כן, מעגליות נעה בין 0.2 (לא מעגלי) לכמעט 1 (מעגל מושלם), ויחס הגובה-רוחב נע בין 1-3 (...

Discussion

כאן מתוארות שיטות לייצור הידרוג'לים גרעיניים באמצעות מיקרוג'לים מקוטעים של שחול ואריזה על ידי צנטריפוגה או סינון מונחה ואקום. בהשוואה לשיטות אחרות לייצור מיקרוג'ל (כלומר, מיקרופלואידיקה, תחליב אצווה, אלקטרוספרייינג, פוטוליתוגרפיה), ייצור מיקרו-ג'ל של פיצול שחול הוא מהיר מאוד, בעלות נמוכה, ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL Plastic Conical Centrifuge Tube	Corning	430766
30 G NT Premium Series Dispensing Tip	Jensen Global	JG30-0.5HPX	Catalog Number listed here is for 30 G, 0.5" needle. Various sizes are available.
BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips (3 mL)	Fisher Scientific	14-823-435	Catalog Number listed here is for 3 mL syringe. Various sizes are available (14-823-XXX).
Black folders	Various Vendors
Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines (18 G, 0.5")	Grainger	5FVH5	Catalog Number listed here is for 18 G, 0.5" needle. Various sizes are available.
Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines (23 G, 0.5")	Grainger	5FVJ3
Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines (27 G, 1.5")	Grainger	5FVL0
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Fisher Scientific	14190-250	Catalog Number listed here is for a case of 10 x 500 mL bottles.
Durapore Membrane Filter, 0.22 µm	Millipore	GVWP04700
Epifluorescent or confocal microscope	Various Vendors		To visualize microgels and granular hydrogels
Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Safe-Lock Tubes	Fisher Scientific	05-402-25
Extrusion printer	Custom-built		Other extrusion printers can be use,d such as commercially available BIOX.
Filter Adapters	Fisher Scientific	05-888-107	Catalog Number listed here is for a set of multiple sizes. Various sizes are available (05-888-XXX).
Filter Flask	Various Vendors
Fluorescein isothiocyanate-dextran (2 MDa)	Sigma-Aldrich	52471
Glass microscope slide	Various Vendors
ImageJ	National Institutes of Health		"Analyze Particles" information link: https://imagej.nih.gov/ij/docs/menus/analyze.html
Laptop	Various Vendors
Luer-Lock Tip Caps	Integrated Dispensin g Solutions	9991329
Metal spatula for scooping	Various Vendors
Microcentrifuge	Various Vendors		Capable of speed up to 18,000 x g
Microscoft Execl	Microsoft		Other programs can be used, such as Google Slides.
OmniCure S2000 Spot UV Curing System	Excelitas Technologies	S2000	Different light systems may be used to fabricate bulk hydrogels if desired.
Porcelain Buchner Funnel with Fixed Perforated Plate	Fisher Scientific	FB966C	Catalog Number listed here is for 56mm diameter plate. Various sizes are available.
Radiometer	Various Vendors
Repetier Host	Hot-World GmbH & Co. KG		3D printing software
Screw-based extrusion printer	Various Vendors		This study used a custom-modified 3D FDM printer (Velleman K8200). Many alternatives are available.
Solidworks/CAD software	Dassault Systèmes SolidWorks Corporation		Other programs can be used, such as Blender or TinkerCAD.
Tubing to Connect Filter Flask to Vacuum Line	Various Vendors
UV Eye Protection (i.e., safety glasses)	Various Vendors