Frammentazione di idrogel sfusi e lavorazione in idrogel granulari per applicazioni biomediche

Riepilogo

Questo lavoro descrive metodi semplici, adattabili e a basso costo per fabbricare microgel con frammentazione di estrusione, elaborare i microgel in idrogel granulari iniettabili e applicare gli idrogel granulari come inchiostri da stampa per estrusione per applicazioni biomediche.

Abstract

Gli idrogel granulari sono gruppi inceppati di microparticelle di idrogel (cioè "microgel"). Nel campo dei biomateriali, gli idrogel granulari hanno molte proprietà vantaggiose, tra cui iniettabilità, porosità su microscala e sintoniabilità mescolando più popolazioni di microgel. I metodi per fabbricare microgel spesso si basano su emulsioni acqua-in-olio (ad esempio, microfluidica, emulsioni batch, elettrospraying) o fotolitografia, che possono presentare elevate richieste in termini di risorse e costi e potrebbero non essere compatibili con molti idrogel. Questo lavoro descrive metodi semplici ma altamente efficaci per fabbricare microgel utilizzando la frammentazione dell'estrusione e per elaborarli in idrogel granulari utili per applicazioni biomediche (ad esempio, inchiostri per stampa 3D). In primo luogo, gli idrogel sfusi (utilizzando l'acido ialuronico fotocollegabile (HA) come esempio) vengono estrusi attraverso una serie di aghi con diametri sequenzialmente più piccoli per formare microgel frammentati. Questa tecnica di fabbricazione in microgel è rapida, a basso costo e altamente scalabile. Vengono descritti i metodi per inceppare i microgel in idrogel granulari mediante centrifugazione e filtrazione sotto vuoto, con post-reticolazione opzionale per la stabilizzazione dell'idrogel. Infine, gli idrogel granulari fabbricati da microgel frammentati sono dimostrati come inchiostri da stampa per estrusione. Mentre gli esempi qui descritti utilizzano HA fotocollegabile per la stampa 3D, i metodi sono facilmente adattabili per un'ampia varietà di tipi di idrogel e applicazioni biomediche.

Introduzione

Gli idrogel granulari sono fabbricati attraverso l'imballaggio di particelle di idrogel (cioè microgel) e sono una classe entusiasmante di biomateriali con molte proprietà vantaggiose per applicazioni biomediche ^1,2,3. A causa della loro struttura particolata, gli idrogel granulari sono diradamento del taglio e auto-guarigione, consentendo il loro uso come inchiostri per la stampa di estrusione (bio) inchiostri, supporti granulari per la stampa incorporata e terapie iniettabili ^4,5,6,7,8,9. Inoltre, lo spazio vuoto tra i microgel fornisce una porosità su microscala per il movimento cellulare e la diffusione molecolare ^8,10,11. Inoltre, più popolazioni di microgel possono essere combinate in un'unica formulazione per consentire una maggiore sintonizzazione e funzionalità del materiale 8,10,12,13. Queste importanti proprietà hanno motivato la rapida espansione dello sviluppo di idrogel granulare negli ultimi anni.

È disponibile una gamma di metodi per formare microgel verso la fabbricazione di idrogel granulari, ognuno con i propri vantaggi e svantaggi. Ad esempio, i microgel sono spesso formati da emulsioni acqua-in-olio che utilizzano microfluidica a goccia ^{4,11,13,14,15,16,17}, emulsioni batch ^{7,18,19,20,21,22} o elettrospruzzi ^{6,23, 24,25}. Questi metodi producono microgel sferici con diametri uniformi (microfluidici) o polidispersi (emulsioni batch, elettrosperatori). Esistono alcune limitazioni a questi metodi di fabbricazione di emulsioni acqua-in-olio, tra cui la produzione potenzialmente a bassa produttività, la necessità di soluzioni precursori di idrogel a bassa viscosità e l'elevato costo e le risorse per l'installazione. Inoltre, questi protocolli possono richiedere oli e tensioattivi aggressivi che devono essere lavati dai microgel utilizzando procedure che aggiungono fasi di lavorazione e possono essere difficili da tradurre in condizioni sterili per applicazioni biomediche in molti laboratori. Eliminando la necessità di emulsioni acqua-in-olio, può essere utilizzata anche la (foto)litografia, dove vengono utilizzati stampi o fotomaschere per controllare la polimerizzazione di microgel da soluzioni precursori di idrogel ^1,26,27. Come la microfluidica, questi metodi possono essere limitati nella loro produttività, il che rappresenta una grande sfida quando sono necessari grandi volumi.

In alternativa a questi metodi, la frammentazione meccanica di idrogel sfusi è stata utilizzata per fabbricare microgel con dimensioni irregolari 19,28,29,30,31,32. Ad esempio, gli idrogel sfusi possono essere preformati e successivamente passati attraverso reti o setacci per formare microgel frammentati, un processo che è stato fatto anche in presenza di cellule all'interno di filamenti di microgel^33,34. Gli idrogel sfusi sono stati anche trasformati in microgel con interruzione meccanica utilizzando tecniche come la macinazione con mortaio e pestello o attraverso l'uso di frullatori commerciali 35,36,37. Altri hanno anche usato l'agitazione meccanica durante la formazione di idrogel per fabbricare microgel frammentati (cioè gel fluidi)³¹.

I metodi qui descritti espandono queste tecniche di frammentazione meccanica e presentano un approccio semplice per fabbricare microgel con frammentazione di estrusione, utilizzando idrogel di acido ialuronico fototrasferibile (HA) come esempio. La frammentazione dell'estrusione utilizza solo siringhe e aghi per fabbricare microgel frammentati in un metodo a basso costo, ad alta produttività e facilmente scalabile che è appropriato per una vasta gamma di idrogel^19,32. Inoltre, i metodi per assemblare questi microgel frammentati in idrogel granulari sono descritti utilizzando la centrifugazione (imballaggio basso) o la filtrazione sottovuoto (imballaggio alto). Infine, l'applicazione di questi idrogel granulari frammentati viene discussa per l'uso come inchiostro da stampa per estrusione. L'obiettivo di questo protocollo è quello di introdurre metodi semplici che siano adattabili a un'ampia varietà di idrogel e possano essere implementati praticamente in qualsiasi laboratorio interessato agli idrogel granulari.

Protocollo

1. Fabbricazione di idrogel sfusi all'interno di una siringa utilizzando il photocrosslinking

NOTA: una panoramica della fabbricazione di idrogel sfuso all'interno di una siringa mediante fotocollegamento è mostrata nella Figura 1. Questo protocollo utilizza acido ialuronico modificato dal norbornene (NorHA) per fabbricare idrogel di massa utilizzando una reazione tiolo-ene foto-mediata. Le procedure dettagliate per la sintesi di NorHA sono descritte altrove³⁸. Tuttavia, questo protocollo è altamente adattabile a qualsiasi idrogel fotocollegabile. Per ulteriori informazioni, vedere Discussione.

1. Predeterminare le concentrazioni desiderate di polimero, reticolante e iniziatori per la formulazione di idrogel sfuso. In questo protocollo, la soluzione precursore dell'idrogel è costituita da NorHA (2 wt.%, ~25% grado di modificazione del norbornene), ditiotreitolo (DTT, 6 mM) e Irgacure D-2959 (I2959, 0,05 wt.%). Assicurarsi che i componenti (1 mL) siano completamente disciolti in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) all'interno di un tubo microcentrifuga.
   NOTA: Durante la preparazione della soluzione precursore dell'idrogel, è possibile aggiungere fitc-destrano ad alto peso molecolare (2 MDa, 0,1 wt.%) alla soluzione per visualizzare i microgel fabbricati successivamente nel protocollo utilizzando la microscopia fluorescente.
2. Caricare una siringa da 3 mL con la soluzione precursore dell'idrogel.
   1. Rimuovere lo stantuffo dal retro di una siringa vuota da 3 ml e aggiungere un tappo di punta alla parte superiore della canna della siringa.
   2. Utilizzare una pipetta da 1.000 μL per trasferire la soluzione precursore dell'idrogel nella canna della siringa con il tappo della punta.
   3. Tenere la canna della siringa con la soluzione precursore dell'idrogel in una mano, con il cappuccio della punta rivolto verso il basso e l'estremità aperta della canna rivolta verso l'alto. Con l'altra mano, riportare lo stantuffo della siringa all'apertura del retro della canna della siringa. Spingere delicatamente lo stantuffo della siringa nella canna, quanto basta per sigillare l'apertura sul retro della canna della siringa.
   4. Tenere insieme con attenzione lo stantuffo e la canna della siringa per assicurarsi che la parte posteriore della canna della siringa sia sigillata con lo stantuffo, capovolgere la siringa in modo tale che lo stantuffo sia rivolto verso il basso e il tappo della punta sia ora rivolto verso l'alto. Rimuovere il tappo della punta e spingere delicatamente lo stantuffo nella canna della siringa fino a quando tutta l'aria non viene rimossa dalla siringa (rimane solo la soluzione precursore dell'idrogel).
   5. Ricollegare il cappuccio della punta alla siringa. Assicurarsi che la soluzione precursore dell'idrogel sia fissata all'interno della siringa da 3 mL con un tappo a punta.
3. Formare un idrogel sfuso all'interno della siringa da 3 ml.
   1. Assicurarsi che vengano presi adeguati dispositivi di protezione individuale (DPI) e salvaguardie prima di accendere la lampada UV. Ciò include indossare occhiali protettivi contro i raggi UV e racchiudere l'area della lampada per proteggere gli altri dalla luce UV.
   2. Calibrare la lampada UV spot cure a un'intensità luminosa di 10 mW/cm² utilizzando un radiometro.
      NOTA: Ci sarà una leggera attenuazione attraverso il barilotto della siringa. Prima della fabbricazione, determinare la percentuale di attenuazione della luce presente utilizzando un radiometro. L'intensità luminosa emessa dal sistema di polimerizzazione spot deve essere regolata di conseguenza per tenere conto di tale attenuazione.
   3. Posizionare la siringa da 3 mL caricata con la soluzione precursore dell'idrogel sotto la lampada uv spot cure per un periodo di tempo desiderato per il fotocrosslink completo. Per il sistema qui descritto, la soluzione precursore di idrogel NorHA è esposta alla luce UV per 5 minuti ad un'intensità di 10 mW/cm², che, sulla base di studi precedenti³⁹, era sufficientemente tempo e intensità luminosa per garantire una reticolazione completa come determinato dal tempo di reologia oscillatoria di fotocollegamento.
      NOTA: per garantire il fotocrosslinking completo all'interno della siringa, la siringa può essere capovolta a metà del periodo di photocrosslinking.
   4. Spegnere la lampada UV e rimuovere la siringa. Assicurarsi che l'idrogel sia ora fotocollegato all'interno della siringa. Questo può essere fatto tirando indietro lo stantuffo e osservando l'idrogel muoversi come un blocco solido piuttosto che un liquido viscoso.

Figura 1: Panoramica della fabbricazione di idrogel sfusi all'interno di una siringa utilizzando il photocrosslinking. La figura raffigura (A) la rimozione dello stantuffo dalla siringa, (B) il fissaggio del cappuccio della punta alla canna della siringa, (C) l'aggiunta del precursore dell'idrogel alla canna della siringa, (D) il ritorno dello stantuffo alla siringa, (E) la rimozione dell'aria in eccesso e il fissaggio del cappuccio della punta e (F) l'idrogel sfuso fototrascollegante all'interno della siringa. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

2. Fabbricazione di microgel utilizzando la frammentazione dell'estrusione

NOTA: una panoramica della fabbricazione di microgel mediante frammentazione dell'estrusione è illustrata nella Figura 2.

1. Rimuovere lo stantuffo dal retro di una siringa vuota da 3 ml. Fissare un tappo di punta al Luer-Lock.
2. Rimuovere il tappo della punta dalla siringa contenente l'idrogel sfuso fotocollegato. Allineare la parte superiore della siringa idrogel con l'apertura della canna sulla siringa vuota.
3. Estrudere l'idrogel sfuso attraverso l'apertura della siringa (senza ago attaccato) nella canna della siringa vuota. Scartare correttamente la siringa che ora è vuota (precedentemente conteneva l'idrogel) nel flusso di rifiuti appropriato.
4. Tenere la siringa che contiene l'idrogel estruso in modo tale che il cappuccio della punta sia rivolto verso il basso e l'apertura della canna sia rivolta verso l'alto. Utilizzando una pipetta da 1.000 μL, aggiungere 1,5 mL di PBS alla canna della siringa.
5. Allineare lo stantuffo della siringa con l'apertura della canna, spingendo a malapena lo stantuffo abbastanza da creare una guarnizione. Capovolgere la siringa in modo che lo stantuffo sia ora rivolto verso il basso e il cappuccio della punta sia rivolto verso l'alto, assicurandosi di tenere insieme lo stantuffo e la canna della siringa in posizione in modo che non fuoriesca idrogel o PBS. Invertire più volte per mescolare l'idrogel frammentato con il PBS aggiunto.
6. Tenere la siringa in modo che il cappuccio della punta sia rivolto verso l'alto e lo stantuffo sia rivolto verso il basso. Rimuovere il tappo della punta. Spingere delicatamente lo stantuffo verso l'alto per rimuovere l'aria dall'interno della siringa.
   NOTA: Ci sarà probabilmente una scanalatura nella parte posteriore della siringa da 3 ml che richiederà una forza extra per spingere lo stantuffo. Spingere con molta attenzione lo stantuffo sopra la scanalatura. Qualsiasi quantità improvvisa o dura di forza farà sì che lo stantuffo si muova troppo velocemente e possibilmente espelle la sospensione di idrogel frammentata.
7. Estrudere la sospensione di idrogel frammentata attraverso una serie di aghi per creare microgel frammentati.
   1. Fissare un ago da 18 G a punta smussata sulla parte superiore della siringa contenente l'idrogel frammentato e PBS. Rimuovere lo stantuffo da una siringa fresca da 3 mL e fissare un tappo di punta al cilindro vuoto della siringa.
   2. Estrudere la sospensione di idrogel frammentata attraverso l'ago da 18 G nella parte posteriore della canna della siringa vuota. Gettare la siringa vuota e l'ago nel flusso di rifiuti taglienti appropriato.
   3. Tenere la siringa che contiene la sospensione di idrogel frammentata in modo tale che il cappuccio della punta sia rivolto verso il basso e l'apertura della canna sia rivolta verso l'alto. Allineare lo stantuffo della siringa con l'apertura della canna, spingendo a malapena lo stantuffo abbastanza da creare una guarnizione.
   4. Capovolgere la siringa in modo tale che lo stantuffo sia ora rivolto verso il basso e il cappuccio della punta sia rivolto verso l'alto, assicurandosi di tenere insieme lo stantuffo e la canna della siringa in modo che non fuoriesca idrogel o PBS.
   5. Tenere la siringa in modo che il cappuccio della punta sia rivolto verso l'alto e lo stantuffo sia rivolto verso il basso. Rimuovere il tappo della punta. Spingere delicatamente lo stantuffo verso l'alto per rimuovere l'aria dall'interno della siringa. Vedere la NOTA sopra relativa alla spinta delicata dello stantuffo della siringa verso l'interno per evitare l'espulsione indesiderata del materiale idrogel.
   6. Ripetere i passaggi 2.7.1-2.7.5 con un ago da 23 G, 27 G e 30 G. All'ultima fase di estrusione (ago da 30 G), estrudere la sospensione di idrogel frammentata in tubi di microcentrifuga. Per i volumi qui descritti, il volume finale della sospensione di idrogel frammentato sarà di ~ 2,5 ml, richiedendo due tubi microcentrifuga da 1,5 mL (volume diviso equamente).
      NOTA: non deve essere richiesta alcuna forza eccessiva per estrudere la sospensione di idrogel frammentata attraverso gli aghi. Per le migliori pratiche di sicurezza, si consiglia di eseguire tutte le fasi di frammentazione dell'estrusione all'interno di una cappa chimica per fornire protezione in caso di sovrapressurizzazione della siringa durante l'estrusione. Inoltre, questo processo può essere facilmente eseguito in un armadio di biosicurezza / cappa a flusso laminare per mantenere la sterilità durante la fabbricazione. Vedere Discussione per ulteriori suggerimenti per la risoluzione dei problemi.
8. Lavare e isolare la sospensione di idrogel frammentata.
   NOTA: il lavaggio di microgel frammentati aiuterà a rimuovere qualsiasi polimero e reticolante non reagito. Inoltre, la centrifugazione aiuterà a isolare i microgel dalla sospensione formando un pellet.
   1. Usando una microcentrifuga, ruotare la sospensione di microgel frammentata a 5.000 x g per 5 minuti.
   2. Utilizzare una pipetta per rimuovere il surnatante. Aggiungere 1 mL di PBS a ciascun tubo microcentrifuga contenente microgel frammentati e vortice per 5-10 s.
   3. Ripetere la centrifugazione e il lavaggio con PBS 3x.

Figura 2: Panoramica della fabbricazione di microgel utilizzando la frammentazione dell'estrusione. La figura raffigura (A) l'estrusione di idrogel sfuso in un barile di siringa vuoto e l'aggiunta di PBS, (B) il fissaggio di uno stantuffo nella siringa con idrogel frammentato, (C) il fissaggio di un ago da 18 G e l'estrusione di una sospensione di idrogel frammentata in un barile di siringa vuoto e (D) la ripetizione delle fasi di frammentazione dell'estrusione con aghi da 23 G, 27 G e 30 G, raccolta di sospensione di idrogel frammentata in tubi di microcentrifuga all'estrusione finale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. Caratterizzazione di microgel frammentati utilizzando ImageJ

NOTA: una panoramica della caratterizzazione dei microgel frammentati utilizzando ImageJ è mostrata nella Figura 3, nonché i risultati rappresentativi per descrivere le distribuzioni dimensionali e le forme all'interno di un lotto di microgel frammentati. I microgel devono essere etichettati in modo fluorescente prima della visualizzazione. Ad esempio, il FITC-destrano (2 MDa) ad alto peso molecolare può essere incapsulato nell'idrogel sfuso prima della frammentazione per creare microgel marcati con fluoresceina.

1. Combinare 20 μL di sospensione di microgel frammentata con 180 μL di PBS per creare una sospensione di microgel frammentata diluita. Vortice per mescolare accuratamente.
2. Trasferire 50 μL di sospensione di microgel frammentata diluita su un vetrino per microscopio.
3. Utilizzare un microscopio epifluorescente per acquisire immagini di microgel marcati fluorescenti con zoom 4x o 10x.
   NOTA: La sospensione di microgel deve essere diluita abbastanza in modo tale che i microgel vicini non siano in contatto tra loro, ma abbastanza concentrati in modo tale che dozzine di microgel siano visibili nel viewport. La diluizione della sospensione di microgel può essere regolata di conseguenza per raggiungere questo obiettivo.
4. Utilizzo di ImageJ per analizzare particelle di microgel frammentate. Ulteriori informazioni sull'utilizzo della funzionalità Analizza particelle in ImageJ sono disponibili nel collegamento fornito nella Tabella dei materiali.
   1. Apri le immagini dei microgel in sospensione in ImageJ.
   2. Selezionate Analizza > Imposta misure (Set Measurements), Check Area, Shape Descriptors e Feret's Diameter .. Fare clic su OK.
   3. Selezionare Immagine > Tipo > 8 bit.
   4. Selezionare Immagine > Regolare > soglia. Regola la soglia in modo che i microgel siano coperti da una maschera rossa e lo sfondo rimanga nero. Fare clic su Applica.
      NOTA: se alcuni microgel sono leggermente sovrapposti, utilizzare lo strumento matita per disegnare una sottile linea nera (<5 pixel) tra i microgel per separarli nell'immagine in bianco e nero.
   5. Selezionare Analizza > analizza particelle. Impostare Dimensioni (pixel²) da 50-Infinito per ridurre il rumore di fondo. Impostare Circolarità su 0,00-1,00. Selezionare Mostra contorni dal menu a discesa. Selezionate Visualizza risultati (Display Results), Escludi (Exclude on Edges) e Includi fori (Include fori). Lasciare deselezionate le caselle rimanenti. Fare clic su OK.
   6. Si aprirà una visualizzazione dei risultati, che include l'area, i descrittori di forma e le informazioni sul diametro di Feret per ogni microgel identificato. Copia e incolla i risultati in un foglio di calcolo.
   7. Determinare il diametro circolare equivalente per ogni particella.
      1. Ottenere la scala dell'immagine in μm/pixel dalla barra della scala o dalle informazioni sullo strumento. Crea una colonna nel foglio di calcolo che converta l'area di ogni microgel da pixel² a μm².
      2. Usa l'area in μm² per determinare il diametro circolare equivalente del microgel in μm (cioè, prendi la radice quadrata dell'area divisa per pi, quindi raddoppiala).
   8. Usa la scala μm/pixel per convertire i diametri di Feret (cioè la distanza più lunga tra due punti qualsiasi sul confine delle particelle) per ogni microgel in un'unità di μm.
   9. Circolarità ("Circ."), proporzioni ("AR"), rotondità ("Round") e valori di solidità per ogni microgel possono essere utilizzati come direttamente da ImageJ.
   10. Analizzare la popolazione di microgel come desiderato, considerando la distribuzione dei diametri (circolari equivalenti e di Feret), circolarità, proporzioni, rotondità e solidità.

Figura 3: Panoramica della caratterizzazione di particelle di microgel frammentate utilizzando ImageJ. La figura raffigura (A) la creazione di una sospensione diluita di particelle di microgel frammentate e l'utilizzo di un microscopio epifluorescente o confocale per l'immagine di microgel in sospensione (barra di scala = 500 μm), (B) la conversione in un'immagine binaria in ImageJ e l'analisi di particelle (conteggio, descrittori di forma, ecc.) e (C) risultati rappresentativi. Le barre di errore rappresentano min e max con intervalli di quartili interni delimitati. Viene mostrata una dimensione della popolazione di n = 100 microgel. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

4. Assemblaggio di microgel frammentati in idrogel granulari

NOTA: Vengono presentati due metodi per la formulazione di idrogel granulari da microgel frammentati, utilizzando la centrifugazione e la filtrazione. Il metodo utilizzato dipenderà dall'imballaggio di microgel desiderato (cioè particelle di pacchetti di filtrazione più densamente) e se i componenti biologici sono inclusi (ad esempio, la centrifugazione manterrà i componenti tra le particelle, mentre nella filtrazione questi potrebbero essere persi). Il lavoro precedente⁴⁰ descrive accuratamente i risultati comparativi (cioè meccanica, porosità) per idrogel granulari formati da centrifuga o filtrazione sottovuoto.

1. Opzione 1: Microgel frammentati di marmellata utilizzando la centrifugazione.
   1. Dopo aver rimosso il surnatante PBS dall'ultima fase di lavaggio, aggiungere 1 mL di PBS a ciascun tubo di microcentrifuga e risospese i microgel.
   2. Abbassare la sospensione di idrogel frammentata a 18.000 x g per 5 minuti.
      NOTA: velocità di centrifuga più lente possono essere utilizzate per l'inceppamento di microgel in idrogel granulari con imballaggio meno denso, se lo si desidera.
   3. Rimuovere il surnatante PBS.
   4. Ottenere una siringa fresca da 3 ml e rimuovere lo stantuffo. Utilizzare una spatola metallica per estrarre l'idrogel granulare frammentato dal tubo della microcentrifuga e trasferirlo nella parte posteriore del barilotto della siringa vuota. Una punta di pipetta può essere utilizzata per aiutare a trasferire l'idrogel granulare nella siringa. Riportare lo stantuffo sulla siringa. Ora carica l'idrogel granulare frammentato nella siringa ed è pronto per l'uso.
2. Opzione 2: Microgel frammentati di marmellata utilizzando la filtrazione sottovuoto. Una panoramica dell'inceppamento mediante filtrazione sotto vuoto è illustrata nella Figura 4.
   1. Assemblare e testare l'apparato di filtrazione sottovuoto.
      1. Fissare un imbuto Buchner all'interno di un pallone filtrante, posizionando l'adattatore del filtro tra l'imbuto e l'apertura del pallone.
      2. Utilizzare tubi per collegare il pallone filtrante a una linea di vuoto.
      3. Posizionare un filtro a membrana (0,22 μm) nella coppa a imbuto Buchner.
      4. Accendere la linea del vuoto aprendo la valvola del quadrante. Testare la connessione pipettando ~ 0,5 ml di PBS sul filtro a membrana e osservare che tutto il PBS passa attraverso il filtro e si raccoglie sul fondo del pallone filtrante.
   2. Accendere la linea del vuoto e assicurarsi una tenuta completa. Vortice la sospensione di idrogel frammentata in modo che i microgel siano sospesi in PBS.
   3. Utilizzando una pipetta da 1.000 μL, trasferire la sospensione di idrogel frammentata sul filtro a membrana (0,22 μm). Dopo aver trasferito l'intera sospensione di microgel, attendere ~ 30 s affinché il vuoto estragga PBS dalla sospensione di idrogel frammentata. Spegnere la linea del vuoto.
      NOTA: Il tempo in cui la sospensione di idrogel frammentata si trova sul filtro a membrana mentre tira il vuoto può essere variato. Vedere Discussione per ulteriori informazioni e suggerimenti per la risoluzione dei problemi.
   4. Ottenere una siringa fresca da 3 ml e rimuovere lo stantuffo. Utilizzare una spatola metallica per prelevare l'idrogel granulare frammentato dal filtro e trasferirlo nella parte posteriore del barilotto della siringa vuota. Una punta di pipetta può essere utilizzata per aiutare a trasferire l'idrogel granulare nella siringa. Riportare lo stantuffo sulla siringa. Caricare l'idrogel granulare frammentato nella siringa ed è ora pronto per l'uso.

Figura 4: Panoramica dell'inceppamento dei microgel mediante filtrazione sotto vuoto per fabbricare idrogel granulari frammentati strettamente imballati. La figura raffigura (A) posizionando un filtro a membrana sull'apparato di filtrazione sotto vuoto, (B) usando una pipetta per trasferire la sospensione di microgel frammentata sul filtro, (C) tirando il vuoto e aspettando che i microgel si inceppino e formino un idrogel granulare, (D) spegnendo il vuoto e rimuovendo l'idrogel granulare frammentato usando una spatola metallica e (E) usando una spatola metallica per trasferire l'idrogel granulare alla siringa. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

5. Stampa di estrusione con inchiostri idrogel granulari

NOTA: una panoramica del processo di stampa per estrusione è mostrata nella Figura 5, inclusa una stampa rappresentativa di un costrutto a forma di stella che utilizza idrogel granulari frammentati inceppati con filtrazione sottovuoto. Il flusso di lavoro di stampa consiste nella formulazione di un inchiostro, nella pianificazione del progetto di stampa e quindi nella stampa dell'inchiostro in base al^{progetto desiderato 41}. Se lo si desidera, i costrutti di idrogel granulare stampati possono essere stabilizzati utilizzando il fotocrosslinking post-estrusione aggiungendo DTT in eccesso (5 mM) e I2959 (0,05 wt.%) alla sospensione di microgel frammentata prima dell'inceppamento. Ciò si tradurrà in legami covalenti fotocollegati formati tra i microgel, portando alla stabilizzazione permanente del costrutto di idrogel granulare.

1. Formulazione dell'inchiostro
   1. Durante il processo di pianificazione, tenere presente le proprietà dell'inchiostro da utilizzare. Per caratterizzare l'inchiostro, completare l'analisi reologica degli idrogel frammentati per aiutare a informare il processo di progettazione della stampa. I metodi che descrivono la caratterizzazione reologica degli idrogel granulari sono descritti altrove e possono essere adattati per questo studio⁴⁰.
   2. Dall'analisi reologica, selezionare una piattaforma di stampa e una serie di parametri di stampa iniziali.
      NOTA: a causa dell'elevata viscosità complessiva e delle proprietà di assottigliamento al taglio degli inchiostri idrogel granulari, vengono in genere utilizzate stampanti per estrusione a vite.
2. Stampa design
   NOTA: il software Repetier Host (d'ora in poi denominato software di stampa 3D) viene utilizzato per le applicazioni di stampa 3D (passaggi 5.2-5.3).
   1. Creare i progetti di stampa tramite software CAD (Computer-Aided Design). Gli utenti possono creare nuovi disegni da zero o modificare progetti preesistenti, ad esempio da scansioni di tessuti di pazienti o da altri utenti. Per ulteriori informazioni sulla creazione di progetti CAD, fare riferimento ai seguenti riferimenti 41,42,43.
   2. Per elaborare i modelli CAD in G-Code, assicurarsi che il file CAD sia salvato in formato ".stl" (File supplementare 1) e caricato sul software di stampa 3D selezionando il pulsante di caricamento nel pannello superiore o selezionando File > Carica nella barra dei menu. Questo codice G definisce il percorso di stampa per la deposizione dell'inchiostro. Un esempio di file .stl di un cilindro cavo è stato incluso nei file supplementari.
   3. Una volta che un file STL è stato caricato nel software di stampa 3D, vai al pannello Slicer e seleziona Slic3r come opzione slicer. Qui, impostazioni come il diametro dell'ugello, l'altezza dello strato, la velocità di stampa e la velocità di estrusione possono essere regolate in base alla caratterizzazione dell'inchiostro e ai risultati di stampa desiderati. In questo protocollo viene utilizzato un ago da 18 G (diametro interno di 838 μm). L'altezza dello strato è impostata su 1 mm, la velocità di stampa è impostata su 8 mm/s e la portata è impostata su 9 μL/s, in base all'ottimizzazione precedente³⁹. I valori numerici dei parametri possono essere regolati ± 20% per tenere conto delle variazioni delle proprietà degli inchiostri idrogel granulari.
      NOTA: è importante notare che queste impostazioni e il design di stampa potrebbero dover essere regolati tramite test sperimentali iterativi, a seconda delle regolazioni della formulazione dell'inchiostro, della risoluzione di stampa desiderata o della piattaforma di stampa utilizzata. Per ulteriori informazioni su questi parametri, nonché sulla caratterizzazione delle impostazioni di stampa con una nuova formulazione di inchiostro, fare riferimento ad altri riferimenti 40,44,45,46.
3. Stampa per estrusione con idrogel granulari frammentati
   1. Per il caricamento di siringhe con idrogel granulari frammentati, vedere 4.2.4, nonché Figura 4 e Figura 5.
   2. Rimuovere il cappuccio della punta e sostituirlo con un ago a scelta.
   3. Caricare la siringa nella piattaforma di stampa scelta. Qui viene utilizzata una stampante di estrusione a vite personalizzata.
      NOTA: Per informazioni sulla costruzione di bioprinter personalizzate, vedere altri riferimenti^44,47.
   4. Carica il file G-Code preparato dalla fase di pianificazione nel software di stampa 3D. Passare al pannello Anteprima di stampa e premere Stampa.
   5. Non appena la deposizione di stampa è completa, esporre i costrutti di idrogel granulare frammentati alla luce UV per il fotocrosslinking e la stabilizzazione.
   6. Una volta completata la reticolazione, elaborare il campione lavandolo in PBS tre volte.

Figura 5: Panoramica della stampa di estrusione con idrogel granulari frammentati. La figura raffigura (A) l'uso di una spatola per trasferire l'idrogel granulare frammentato in un barile di siringa, (B) l'attacco di un ago a punta smussata (18 G mostrato) e la spinta del campione verso l'alto, (C) un grafico che rappresenta la connessione al software del computer per la stampa e (D) il completamento della stampa di un costrutto a forma di stella con idrogel granulare frammentato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Risultati

I risultati rappresentativi di questi protocolli sono mostrati nella Figura 3 e nella Figura 6. La frammentazione dell'estrusione produce microgel con forme poligonali frastagliate con diametri compresi tra 10 e 300 μm (Figura 3). Inoltre, la circolarità varia da 0,2 (non circolare) a quasi 1 (cerchio perfetto) e le proporzioni vanno da 1 a 3 (Figura 3). Questi parametri descrivono le forme irregolari...

Discussione

Qui vengono descritti i metodi per fabbricare idrogel granulari utilizzando microgel frammentati per estrusione e imballaggio mediante centrifugazione o filtrazione sotto vuoto. Rispetto ad altri metodi di fabbricazione di microgel (ad esempio, microfluidica, emulsioni batch, elettrospruzzi, fotolitografia), la fabbricazione di microgel a frammentazione di estrusione è altamente rapida, a basso costo, facilmente scalabile e suscettibile di un'ampia varietà di sistemi di idrogel. Inoltre, questo protocollo è altamente ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL Plastic Conical Centrifuge Tube	Corning	430766
30 G NT Premium Series Dispensing Tip	Jensen Global	JG30-0.5HPX	Catalog Number listed here is for 30 G, 0.5" needle. Various sizes are available.
BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips (3 mL)	Fisher Scientific	14-823-435	Catalog Number listed here is for 3 mL syringe. Various sizes are available (14-823-XXX).
Black folders	Various Vendors
Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines (18 G, 0.5")	Grainger	5FVH5	Catalog Number listed here is for 18 G, 0.5" needle. Various sizes are available.
Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines (23 G, 0.5")	Grainger	5FVJ3
Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines (27 G, 1.5")	Grainger	5FVL0
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Fisher Scientific	14190-250	Catalog Number listed here is for a case of 10 x 500 mL bottles.
Durapore Membrane Filter, 0.22 µm	Millipore	GVWP04700
Epifluorescent or confocal microscope	Various Vendors		To visualize microgels and granular hydrogels
Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Safe-Lock Tubes	Fisher Scientific	05-402-25
Extrusion printer	Custom-built		Other extrusion printers can be use,d such as commercially available BIOX.
Filter Adapters	Fisher Scientific	05-888-107	Catalog Number listed here is for a set of multiple sizes. Various sizes are available (05-888-XXX).
Filter Flask	Various Vendors
Fluorescein isothiocyanate-dextran (2 MDa)	Sigma-Aldrich	52471
Glass microscope slide	Various Vendors
ImageJ	National Institutes of Health		"Analyze Particles" information link: https://imagej.nih.gov/ij/docs/menus/analyze.html
Laptop	Various Vendors
Luer-Lock Tip Caps	Integrated Dispensin g Solutions	9991329
Metal spatula for scooping	Various Vendors
Microcentrifuge	Various Vendors		Capable of speed up to 18,000 x g
Microscoft Execl	Microsoft		Other programs can be used, such as Google Slides.
OmniCure S2000 Spot UV Curing System	Excelitas Technologies	S2000	Different light systems may be used to fabricate bulk hydrogels if desired.
Porcelain Buchner Funnel with Fixed Perforated Plate	Fisher Scientific	FB966C	Catalog Number listed here is for 56mm diameter plate. Various sizes are available.
Radiometer	Various Vendors
Repetier Host	Hot-World GmbH & Co. KG		3D printing software
Screw-based extrusion printer	Various Vendors		This study used a custom-modified 3D FDM printer (Velleman K8200). Many alternatives are available.
Solidworks/CAD software	Dassault Systèmes SolidWorks Corporation		Other programs can be used, such as Blender or TinkerCAD.
Tubing to Connect Filter Flask to Vacuum Line	Various Vendors
UV Eye Protection (i.e., safety glasses)	Various Vendors