Biyomedikal Uygulamalar için Dökme Hidrojellerin Parçalanması ve Granüler Hidrojellere İşlenmesi

Özet

Bu çalışma, ekstrüzyon parçalanması ile mikrojelleri üretmek, mikrojelleri enjekte edilebilir granüler hidrojellere işlemek ve granüler hidrojelleri biyomedikal uygulamalar için ekstrüzyon baskı mürekkepleri olarak uygulamak için basit, uyarlanabilir ve düşük maliyetli yöntemleri açıklamaktadır.

Özet

Granüler hidrojeller, hidrojel mikropartiküllerinin (yani, "mikrojeller") sıkışmış montajlarıdır. Biyomalzemeler alanında, granüler hidrojeller, enjekte edilebilirlik, mikro ölçekli gözeneklilik ve çoklu mikrojel popülasyonlarını karıştırarak ayarlanabilirlik gibi birçok avantajlı özelliğe sahiptir. Mikrojelleri üretme yöntemleri genellikle yağda su emülsiyonlarına (örneğin, mikroakışkanlar, toplu emülsiyonlar, elektropüskürtme) veya fotolitografiye dayanır, bu da kaynaklar ve maliyetler açısından yüksek talepler sunabilir ve birçok hidrojelle uyumlu olmayabilir. Bu çalışma, ekstrüzyon parçalanması kullanarak mikrojelleri üretmek ve bunları biyomedikal uygulamalar için yararlı granüler hidrojellere (örneğin, 3D baskı mürekkepleri) işlemek için basit ama oldukça etkili yöntemleri detaylandırmaktadır. İlk olarak, dökme hidrojeller (örnek olarak fotokrolinklenebilir hyaluronik asit (HA) kullanılarak), parçalanmış mikrojeller oluşturmak için sırayla daha küçük çaplara sahip bir dizi iğne yoluyla ekstrüde edilir. Bu mikrojel üretim tekniği hızlı, düşük maliyetli ve yüksek oranda ölçeklenebilir. Santrifüjleme ve vakumla çalışan filtreleme yoluyla mikrojelleri granüler hidrojellere sıkıştırma yöntemleri, hidrojel stabilizasyonu için isteğe bağlı çapraz bağlama sonrası ile açıklanmaktadır. Son olarak, parçalanmış mikrojellerden imal edilen granüler hidrojeller, ekstrüzyon baskı mürekkepleri olarak gösterilmektedir. Burada açıklanan örnekler 3D baskı için fotokros bağlanabilir HA kullanırken, yöntemler çok çeşitli hidrojel türleri ve biyomedikal uygulamalar için kolayca uyarlanabilir.

Giriş

Granüler hidrojeller, hidrojel partiküllerinin (yani mikrojellerin) paketlenmesiyle üretilir ve biyomedikal uygulamalar için birçok avantajlı özelliğe sahip heyecan verici bir biyomalzeme sınıfıdır ^1,2,3. Partikül yapıları nedeniyle, granüler hidrojeller kesme inceltici ve kendi kendini iyileştiricidir, ekstrüzyon baskı (biyo) mürekkepleri, gömülü baskı için granüler destekler ve enjekte edilebilir terapötikler 4,5,6,7,8,9 olarak kullanılmalarına izin verir. Ek olarak, mikrojeller arasındaki boşluk, hücre hareketi ve moleküler difüzyon^8,10,11 için mikro ölçekli bir gözeneklilik sağlar. Ayrıca, çoklu mikrojel popülasyonları, gelişmiş ayarlanabilirlik ve malzeme işlevselliği^sağlamak için tek bir formülasyonda birleştirilebilir 8,10,12,13. Bu önemli özellikler, son yıllarda granüler hidrojel gelişiminin hızlı genişlemesini motive etmiştir.

Granüler hidrojel üretimine yönelik mikrojeller oluşturmak için, her biri kendi avantaj ve dezavantajlarına sahip bir dizi yöntem mevcuttur. Örneğin, mikrojeller genellikle damlacık mikroakışkanları 4,11,13,14,15,16,17, toplu emülsiyonlar 7,18,19,20,21,22 veya elektropüskürtme ^6,23 kullanılarak yağda su emülsiyonlarından oluşturulur. ^24,25. Bu yöntemler, üniform (mikroakışkanlar) veya polidispers (toplu emülsiyonlar, elektropüskürtme) çaplara sahip küresel mikrojeller verir. Bu yağda su emülsiyonu üretim yöntemlerinde, potansiyel olarak düşük verimli üretim, düşük viskoziteli hidrojel öncü çözümlerine duyulan ihtiyaç ve kurulum için yüksek maliyet ve kaynaklar dahil olmak üzere bazı sınırlamalar vardır. Ek olarak, bu protokoller, işleme adımları ekleyen prosedürler kullanılarak mikrojellerden yıkanması gereken sert yağlar ve yüzey aktif maddeler gerektirebilir ve birçok laboratuvarda biyomedikal uygulamalar için steril koşullara çevrilmesi zor olabilir. Yağda su emülsiyonlarına olan ihtiyacı ortadan kaldırarak, mikrojellerin hidrojel öncü çözeltilerinden kürlenmesini kontrol etmek için kalıpların veya fotomaskelerin kullanıldığı (foto) litografi de kullanılabilir 1,26,27. Mikroakışkanlar gibi, bu yöntemler de üretim çıktılarında sınırlı olabilir, bu da büyük hacimlere ihtiyaç duyulduğunda büyük bir zorluktur.

Bu yöntemlere alternatif olarak, dökme hidrojellerin mekanik parçalanması, düzensiz boyutlarda 19,28,29,30,31,32 mikrojellerin üretilmesinde kullanılmıştır. Örneğin, dökme hidrojeller önceden oluşturulabilir ve daha sonra parçalanmış mikrojeller oluşturmak için ağlardan veya eleklerden geçirilebilir, bu işlem mikrojel iplikçikleri içindeki hücrelerin varlığında bile yapılmıştır^33,34. Dökme hidrojeller ayrıca harç ve havaneli ile taşlama gibi teknikler kullanılarak veya ticari karıştırıcılar kullanılarak mekanik bozulma ile mikrojellere işlenmiştir^35,36,37. Diğerleri ayrıca parçalanmış mikrojelleri (yani sıvı jelleri) üretmek için hidrojel oluşumu sırasında mekanik ajitasyon ^{kullanmışlardır31}.

Buradaki yöntemler, bu mekanik parçalanma tekniklerini genişletmekte ve örnek olarak fotokrolinklenebilir hyaluronik asit (HA) hidrojelleri kullanarak, ekstrüzyon fragmanı ile mikrojellerin üretilmesi için basit bir yaklaşım sunmaktadır. Ekstrüzyon parçalanması, parçalanmış mikrojelleri çok çeşitli hidrojeller için uygun olan düşük maliyetli, yüksek verimli ve kolayca ölçeklenebilir bir yöntemle üretmek için yalnızca şırıngalar ve iğneler kullanır^19,32. Ayrıca, bu parçalanmış mikrojelleri granüler hidrojellere monte etme yöntemleri, santrifüjleme (düşük paketleme) veya vakum tahrikli filtreleme (yüksek paketleme) kullanılarak tanımlanmıştır. Son olarak, bu parçalanmış granüler hidrojellerin uygulanması, ekstrüzyon baskı mürekkebi olarak kullanılmak üzere tartışılmıştır. Bu protokolün amacı, çok çeşitli hidrojellere uyarlanabilen ve granüler hidrojellerle ilgilenen hemen hemen her laboratuvarda uygulanabilen basit yöntemler sunmaktır.

Protokol

1. Fotoçapraz bağlama kullanarak bir şırınganın içinde dökme hidrojellerin üretilmesi

NOT: Fotoçapraz bağlama kullanılarak bir şırınga içindeki dökme hidrojel imalatına genel bir bakış Şekil 1'de gösterilmiştir. Bu protokol, foto-aracılı tiol-en reaksiyonu kullanarak dökme hidrojelleri üretmek için norbornen modifiye hyaluronik asit (NorHA) kullanır. NorHA sentezi için ayrıntılı prosedürler başka bir yerde açıklanmıştır³⁸. Bununla birlikte, bu protokol herhangi bir fotoçapraz bağlanabilir hidrojele oldukça uyarlanabilir. Daha fazla bilgi için Tartışma bölümüne bakın.

1. Dökme hidrojel formülasyonu için istenen polimer, çapraz bağlayıcı ve başlatıcı konsantrasyonlarını önceden belirleyin. Bu protokolde, hidrojel öncü çözeltisi NorHA (ağırlıkça% 2, ~% 25 norbornen modifikasyonu derecesi), dithiothreitol (DTT, 6 mM) ve Irgacure D-2959'dan (I2959, ağırlıkça% 0.05) oluşur. Bileşenlerin (1 mL) bir mikrosantrifüj tüpü içinde fosfat tamponlu salin (PBS) içinde tamamen çözündüğünden emin olun.
   NOT: Hidrojel öncü çözeltisini hazırlarken, floresan mikroskopi kullanılarak protokolde daha sonra üretilen mikrojelleri görselleştirmek için çözeltiye yüksek moleküler ağırlıklı FITC-dextran (2 MDa, ağırlıkça% 0.1) eklenebilir.
2. Hidrojel öncü çözeltisi ile 3 mL'lik bir şırınga yükleyin.
   1. Pistonu boş bir 3 mL şırınganın arkasından çıkarın ve şırınga namlusunun üstüne bir uç kapağı ekleyin.
   2. Hidrojel öncü çözeltisini uç kapağıyla şırınga namlusuna aktarmak için 1.000 μL'lik bir pipet kullanın.
   3. Şırınga namlusunu bir elinizde hidrojel öncü çözeltisi ile, uç kapağı aşağı bakacak ve namlunun açık ucu yukarı bakacak şekilde tutun. Öte yandan, şırınga pistonunu şırınga namlusunun arkasının açıklığına geri getirin. Şırınga pistonunu yavaşça namluya itin, şırınga namlusunun arkasındaki açıklığı kapatacak kadar.
   4. Şırınga namlusunun arkasının pistonla kapatıldığından emin olmak için pistonu ve şırınga namlusunu dikkatlice bir arada tutarak, şırıngayı piston aşağı bakacak şekilde ters çevirin ve uç kapağı şimdi yukarı bakacak şekilde ters çevirin. Uç kapağını çıkarın ve tüm hava şırıngadan çıkarılana kadar pistonu yavaşça şırınga namlusuna itin (sadece hidrojel öncü çözeltisi kalır).
   5. Uç kapağını şırıngaya yeniden takın. Hidrojel öncü çözeltisinin, 3 mL şırınga içinde bir uç kapağı ile sabitlendiğinden emin olun.
3. 3 mL şırınga içinde toplu bir hidrojel oluşturun.
   1. UV lambasını açmadan önce uygun kişisel koruyucu ekipman (KKD) ve önlemlerin alındığından emin olun. Bu, UV koruyucu gözlükler takmayı ve başkalarını UV ışığından korumak için lamba alanını kapatmayı içerir.
   2. UV spot kür lambasını bir radyometre kullanarak 10 mW/^cm2 ışık yoğunluğuna kalibre edin.
      NOT: Şırınga namlusu boyunca hafif zayıflama olacaktır. Üretimden önce, bir radyometre kullanarak mevcut ışık zayıflama yüzdesini belirleyin. Spot kürleme sisteminden gelen ışık yoğunluğu çıkışı, bu zayıflamayı hesaba katmak için buna göre ayarlanmalıdır.
   3. Hidrojel öncü çözeltisi ile yüklenen 3 mL şırıngayı UV spot kür lambasının altına tamamen fotokros bağlamak için istenen süre boyunca yerleştirin. Burada açıklanan sistem için, NorHA hidrojel öncü çözeltisi, 10 mW /^cm2'lik bir yoğunlukta 5 dakika boyunca UV ışığına maruz bırakılır; bu, önceki çalışmalara^{dayanarak 39}, fotoçapraz bağlama salınımlı kesme reolojisi zaman taramaları ile belirlenen tam çapraz bağlamayı sağlamak için yeterli zaman ve ışık yoğunluğudur.
      NOT: Şırınga içinde tam fotoçapraz bağlama sağlamak için, şırınga fotoçapraz bağlama süresinin yarısına kadar çevrilebilir.
   4. UV lambasını kapatın ve şırıngayı çıkarın. Hidrojelin artık şırınga içinde fotokros bağlantılı olduğundan emin olun. Bu, pistonu geri çekerek ve hidrojelin viskoz bir sıvı yerine katı bir blok olarak hareket ettiğini gözlemleyerek yapılabilir.

Resim 1: Fotoçapraz bağlama kullanarak bir şırınga içinde dökme hidrojellerin üretilmesine genel bakış. Şekil, (A) pistonu şırıngadan çıkarmayı, (B) uç kapağını şırınga namlusuna sabitlemeyi, (C) şırınga namlusuna hidrojel öncüsü eklemeyi, (D) pistonu şırıngaya geri döndürmeyi, (E) fazla havayı çıkarmayı ve uç kapağını sabitlemeyi ve (F) şırınganın içindeki toplu hidrojeli fotoçapraz bağlamayı göstermektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

2. Ekstrüzyon parçalanması kullanarak mikrojellerin üretilmesi

NOT: Ekstrüzyon parçalanması kullanılarak mikrojel üretimine genel bir bakış Şekil 2'de gösterilmiştir.

1. Pistonu boş bir 3 mL şırınganın arkasından çıkarın. Luer-Lock'a bir uç kapağı takın.
2. Uç kapağını, fotoçapraz bağlı dökme hidrojeli içeren şırıngadan çıkarın. Hidrojel şırınganın üst kısmını, namlunun boş şırınga üzerindeki açıklığı ile hizalayın.
3. Toplu hidrojeli şırınga açıklığından (iğne takılı değil) boş şırınganın namlusuna ekstrüde edin. Şimdi boş olan (eskiden hidrojeli içeren) şırıngayı uygun atık akışına uygun şekilde atın.
4. Ekstrüde hidrojeli içeren şırıngayı, uç kapağı aşağı bakacak ve namlu açıklığı yukarı bakacak şekilde tutun. 1.000 μL'lik bir pipet kullanarak şırınga namlusuna 1,5 mL PBS ekleyin.
5. Şırınga pistonunu namlunun açıklığıyla hizalayın, sadece pistonu bir conta oluşturacak kadar zar zor itin. Şırıngayı, piston şimdi aşağı bakacak ve uç kapağı yukarı bakacak şekilde ters çevirin, pistonu ve şırınga namlusunu bir arada tuttuğunuzdan emin olun, böylece hiçbir hidrojel veya PBS sızmaz. Parçalanmış hidrojeli eklenen PBS ile karıştırmak için birkaç kez ters çevirin.
6. Şırıngayı, uç kapağı yukarı bakacak ve piston aşağı bakacak şekilde tutun. Uç kapağını çıkarın. Şırınganın içindeki havayı çıkarmak için pistonu çok nazikçe yukarı doğru itin.
   NOT: 3 mL şırınganın arkasında, pistonu içeri itmek için ekstra kuvvet gerektiren bir oluk olması muhtemeldir. Pistonu oluğun üzerine çok dikkatli bir şekilde itin. Herhangi bir ani veya sert kuvvet miktarı, pistonun çok hızlı hareket etmesine ve muhtemelen parçalanmış hidrojel süspansiyonunu dışarı atmasına neden olacaktır.
7. Parçalanmış mikrojeller oluşturmak için parçalanmış hidrojel süspansiyonunu bir dizi iğneden ekstrüzyon yapın.
   1. Parçalanmış hidrojel ve PBS içeren şırınganın üstüne künt uçlu 18 G iğne sabitleyin. Pistonu taze bir 3 mL şırıngadan çıkarın ve boş şırınga namlusuna bir uç kapağı sabitleyin.
   2. Parçalanmış hidrojel süspansiyonunu 18 G iğneden boş şırınga namlusunun arkasına ekstrüzyon yapın. Boş şırıngayı ve iğneyi uygun keskin atık akışına atın.
   3. Parçalanmış hidrojel süspansiyonu içeren şırıngayı, uç kapağı aşağı bakacak ve namlu açıklığı yukarı bakacak şekilde tutun. Şırınga pistonunu namlunun açıklığıyla hizalayın, sadece pistonu bir conta oluşturacak kadar zar zor itin.
   4. Şırıngayı, piston şimdi aşağı bakacak şekilde ters çevirin ve uç kapağı yukarı bakacak şekilde, pistonu ve şırınga namlusunu bir arada tuttuğunuzdan emin olun, böylece hiçbir hidrojel veya PBS sızmaz.
   5. Şırıngayı, uç kapağı yukarı bakacak ve piston aşağı bakacak şekilde tutun. Uç kapağını çıkarın. Şırınganın içindeki havayı çıkarmak için pistonu çok nazikçe yukarı doğru itin. Hidrojel malzemenin istenmeyen şekilde dışarı atılmasını önlemek için şırınga pistonunu yavaşça içeri doğru itmekle ilgili yukarıdaki nota bakın.
   6. 2.7.1-2.7.5 arasındaki adımları 23 G, 27 G ve 30 G iğneyle tekrarlayın. Son ekstrüzyon adımında (30 G iğne), parçalanmış hidrojel süspansiyonunu mikrosantrifüj tüplerine ekstrüzyon yapın. Burada açıklanan hacimler için, son parçalanmış hidrojel süspansiyon hacmi, iki adet 1,5 mL mikrosantrifüj tüpü gerektiren ~ 2,5 mL olacaktır (hacim eşit olarak bölünür).
      NOT: Parçalanmış hidrojel süspansiyonu iğnelerden ekstrüzyon yapmak için aşırı kuvvet gerekmemelidir. En iyi güvenlik uygulamaları için, ekstrüzyon sırasında şırınganın aşırı basınçlandırılması durumunda koruma sağlamak için tüm ekstrüzyon parçalanma adımlarının bir kimyasal davlumbazın içinde gerçekleştirilmesi önerilir. Ek olarak, bu işlem imalat sırasında steriliteyi korumak için bir biyogüvenlik kabininde / laminer akış davlumbazında kolayca gerçekleştirilebilir. Ek sorun giderme önerileri için Tartışma'ya bakın.
8. Parçalanmış hidrojel süspansiyonunu yıkayın ve izole edin.
   NOT: Parçalanmış mikrojellerin yıkanması, reaksiyona girmemiş polimer ve çapraz bağlayıcıların çıkarılmasına yardımcı olacaktır. Ek olarak, santrifüjleme, bir pelet oluşturarak mikrojellerin süspansiyondan izole edilmesine yardımcı olacaktır.
   1. Bir mikrosantrifüj kullanarak, parçalanmış mikrojel süspansiyonunu 5 dakika boyunca 5.000 x g'de döndürün.
   2. Süper nantantı çıkarmak için bir pipet kullanın. Parçalanmış mikrojeller ve 5-10 s vorteks içeren her bir mikrosantrifüj tüpüne 1 mL PBS ekleyin.
   3. Santrifüj ve yıkamayı PBS 3x ile tekrarlayın.

Şekil 2: Ekstrüzyon parçalanması kullanılarak mikrojel üretimine genel bakış. Şekil, (A) dökme hidrojelin boş bir şırınga namlusuna ekstrüzyon yapılması ve PBS eklenmesi, (B) parçalanmış hidrojel ile şırıngadaki bir pistonun sabitlenmesi, (C) 18 G'lik bir iğnenin takılması ve parçalanmış hidrojel süspansiyonunun boş bir şırınga namlusuna ekstrüzyon edilmesinin ve (D) 23 G, 27 G ve 30 G iğneleriyle ekstrüzyon parçalanma adımlarının tekrarlanması, nihai ekstrüzyon üzerinde mikrosantrifüj tüplerinde parçalanmış hidrojel süspansiyonun toplanması. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

3. ImageJ kullanarak parçalanmış mikrojellerin karakterize edilmesi

NOT: ImageJ kullanarak parçalanmış mikrojellerin karakterize edilmesine genel bir bakış, Şekil 3'te ve parçalanmış mikrojeller grubu içindeki boyut dağılımlarını ve şekilleri tanımlamak için temsili sonuçlar gösterilmiştir. Mikrojeller, görselleştirmeden önce floresan olarak etiketlenmelidir. Örneğin, yüksek molekül ağırlıklı FITC-dekstran (2 MDa), floresein etiketli mikrojeller oluşturmak için parçalanmadan önce dökme hidrojel içinde kapsüllenebilir.

1. Seyreltik parçalanmış mikrojel süspansiyonu oluşturmak için 20 μL parçalanmış mikrojel süspansiyonunu 180 μL PBS ile birleştirin. İyice karıştırmak için vorteks.
2. 50 μL seyreltik parçalanmış mikrojel süspansiyonunu bir cam mikroskop slaydına aktarın.
3. 4x veya 10x zoom'da floresan etiketli mikrojellerin görüntülerini elde etmek için bir epifloresan mikroskop kullanın.
   NOT: Mikrojel süspansiyonu, komşu mikrojellerin birbirleriyle temas halinde olmayacağı şekilde yeterince seyreltilmeli, ancak görüş alanında düzinelerce mikrojelin görülebileceği şekilde konsantre edilmelidir. Mikrojel süspansiyonun seyreltilmesi, bunu başarmak için buna göre ayarlanabilir.
4. Parçalanmış mikrojel parçacıklarını analiz etmek için ImageJ'yi kullanma. ImageJ'deki Parçacıkları Analiz Et işlevini kullanma hakkında ek bilgi, Malzeme Tablosu'nda sağlanan bağlantıda bulunabilir.
   1. Süspansiyondaki mikrojellerin görüntülerini ImageJ'de açın.
   2. Analiz Et> Ölçümleri Ayarla, Alanı Kontrol Et, Şekil Tanımlayıcıları ve Feret'in Çapı'nı seçin. Tamam'ı tıklatın.
   3. Image (Görüntü > Türü > 8 bit) öğesini seçin.
   4. Image (Görüntü) > Adjust > Threshold (Eşik Değerini) seçin. Eşiği, mikrojeller kırmızı bir maske ile kaplanacak ve arka plan siyah kalacak şekilde ayarlayın. Uygula'ya tıklayın.
      NOT: Herhangi bir mikrojel hafifçe üst üste biniyorsa, siyah beyaz görüntüde ayırmak üzere mikrojeller arasında ince (<5 piksel) siyah bir çizgi çizmek için Kalem Aracı'nı kullanın.
   5. Parçacıkları Analiz Et > Analiz Et'i seçin. Arka plan gürültüsünü azaltmak için Boyut'u (piksel²) 50-Sonsuz'dan ayarlayın. Döngüselliği 0,00-1,00 olarak ayarlayın. Açılır menüden Anahatları Göster'i seçin. Sonuçları görüntüle'yi işaretleyin, kenarları hariç tutun ve delikleri dahil edin. Kalan kutuları işaretlemeden bırakın. Tamam'a tıklayın.
   6. Tanımlanan her mikrojel için alan, şekil tanımlayıcıları ve Feret'in çap bilgilerini içeren bir sonuç ekranı açılacaktır. Sonuçları kopyalayıp bir e-tabloya yapıştırın.
   7. Her parçacık için eşdeğer dairesel çapı belirleyin.
      1. Görüntü ölçeğini ölçek çubuğundan veya cihaz bilgilerinden μm/piksel cinsinden elde edin. E-tabloda, her mikrojelin alanını piksel^2'den μm^2'ye dönüştüren bir sütun oluşturun.
      2. Mikrojelin μm'deki eşdeğer dairesel çapını belirlemek için μm^2'deki alanı kullanın (yani, pi ile bölünmüş alanın karekökünü alın, sonra iki katına çıkarın).
   8. Her mikrojel için Feret'in çaplarını (yani, parçacık sınırındaki herhangi iki nokta arasındaki en uzun mesafeyi) bir μm birimine dönüştürmek için μm / piksel ölçeğini kullanın.
   9. Her mikrojel için dairesellik ("Dairesel"), en boy oranı ("AR"), yuvarlaklık ("Yuvarlak") ve sağlamlık değerleri doğrudan ImageJ'den olduğu gibi kullanılabilir.
   10. Mikrojel popülasyonunu, çapların dağılımını (eşdeğer dairesel ve Feret'in), daireselliği, en boy oranını, yuvarlaklığı ve katılığı göz önünde bulundurarak istediğiniz gibi analiz edin.

Şekil 3: ImageJ kullanarak parçalanmış mikrojel parçacıklarını karakterize etmeye genel bakış. Şekil, (A) parçalanmış mikrojel parçacıklarının seyreltik bir süspansiyonunu oluşturmayı ve süspansiyondaki mikrojelleri görüntülemek için bir epifloresan veya konfokal mikroskop kullanmayı (ölçek çubuğu = 500 μm), (B) ImageJ'de ikili bir görüntüye dönüştürmeyi ve parçacıkları analiz etmeyi (sayım, şekil tanımlayıcıları, vb.) ve (C) temsili sonuçları göstermektedir. Hata çubukları, minimum ve maksimumu, iç çeyrek aralıkları ayrılmış olarak gösterir. N = 100 mikrojel popülasyon büyüklüğü gösterilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

4. Parçalanmış mikrojellerin granüler hidrojellere montajı

NOT: Parçalanmış mikrojellerden granüler hidrojellerin formülasyonu için santrifüjleme ve filtreleme kullanılarak iki yöntem sunulmaktadır. Kullanılan yöntem, istenen mikrojel ambalajına (yani, filtrasyon paketleri parçacıklarını daha yoğun) ve biyolojik bileşenlerin dahil edilip edilmediğine (yani, santrifüjleme parçacıklar arasındaki bileşenleri koruyacak, oysa filtrasyonda bunlar kaybolabilir) bağlı olacaktır. Önceki çalışma⁴⁰ , santrifüj veya vakumla çalışan filtrasyondan oluşan granüler hidrojeller için karşılaştırmalı sonuçları (yani mekanik, gözeneklilik) ayrıntılı olarak açıklamaktadır.

1. Seçenek 1: Santrifüjleme kullanarak parçalanmış mikrojelleri reçel haline getirin.
   1. PBS süpernatantını son yıkama adımından çıkardıktan sonra, her bir mikrosantrifüj tüpüne 1 mL PBS ekleyin ve mikrojelleri yeniden askıya alın.
   2. Parçalanmış hidrojel süspansiyonunu 5 dakika boyunca 18.000 x g'de döndürün.
      NOT: İstenirse mikrojellerin daha az yoğun ambalaja sahip granüler hidrojellere sıkışması için daha yavaş santrifüj hızları kullanılabilir.
   3. PBS süpernatantını çıkarın.
   4. Taze bir 3 mL şırınga alın ve pistonu çıkarın. Parçalanmış granüler hidrojeli mikrosantrifüj tüpünden çıkarmak ve boş şırınga namlusunun arkasına aktarmak için metal bir spatula kullanın. Granüler hidrojelin şırıngaya aktarılmasına yardımcı olmak için bir pipet ucu kullanılabilir. Pistonu şırıngaya geri döndürün. Şimdi parçalanmış granüler hidrojeli şırıngaya yükleyin ve kullanıma hazır.
2. Seçenek 2: Vakumla çalışan filtreleme kullanarak parçalanmış mikrojelleri reçel haline getirin. Vakumla çalışan filtreleme ile sıkışmaya genel bir bakış Şekil 4'te gösterilmiştir.
   1. Vakumla çalışan filtreleme aparatını monte edin ve test edin.
      1. Bir Buchner hunisini bir filtre şişesinin içine sabitleyin ve filtre adaptörünü huni ile şişe açıklığı arasına yerleştirin.
      2. Filtre şişesini bir vakum hattına bağlamak için boru kullanın.
      3. Buchner huni kabına bir membran filtre (0,22 μm) yerleştirin.
      4. Kadran valfini açarak vakum hattını açın. Membran filtreye ~0,5 mL PBS pipetleyerek bağlantıyı test edin ve tüm PBS'nin filtreden geçtiğini ve filtre şişesinin dibinde toplandığını gözlemleyin.
   2. Vakum hattını açın ve tam bir sızdırmazlık sağlayın. Parçalanmış hidrojel süspansiyonunu vorteksleyin, böylece mikrojeller PBS'de askıya alınır.
   3. 1.000 μL'lik bir pipet kullanarak, parçalanmış hidrojel süspansiyonu membran filtresine (0,22 μm) aktarın. Tüm mikrojel süspansiyonunu aktardıktan sonra, vakumun PBS'yi parçalanmış hidrojel süspansiyonundan çekmesi için ~ 30 s bekleyin. Vakum hattını kapatın.
      NOT: Parçalanmış hidrojel süspansiyonun, vakum çekerken membran filtresine oturduğu süre değişebilir. Daha fazla bilgi ve sorun giderme önerileri için Tartışma'ya bakın.
   4. Taze bir 3 mL şırınga alın ve pistonu çıkarın. Parçalanmış granüler hidrojeli filtreden çıkarmak ve boş şırınga varilinin arkasına aktarmak için metal bir spatula kullanın. Granüler hidrojelin şırıngaya aktarılmasına yardımcı olmak için bir pipet ucu kullanılabilir. Pistonu şırıngaya geri döndürün. Parçalanmış granüler hidrojeli şırıngaya yükleyin ve şimdi kullanıma hazırdır.

Şekil 4: Sıkıca paketlenmiş parçalanmış granüler hidrojelleri imal etmek için vakumla çalışan filtreleme ile mikrojellerin sıkışmasına genel bakış. Şekil, (A) vakum filtrasyon aparatına bir membran filtre yerleştirmeyi, (B) parçalanmış mikrojel süspansiyonunu filtreye aktarmak için bir pipet kullanmayı, (C) vakumu çekmeyi ve mikrojellerin sıkışmasını ve granüler bir hidrojel oluşturmasını beklemeyi, (D) vakumu kapatmayı ve metal bir spatula kullanarak parçalanmış granüler hidrojeli çıkarmayı ve (E) granüler hidrojeli şırıngaya aktarmak için metal bir spatula kullanmayı göstermektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

5. Granül hidrojel mürekkeplerle ekstrüzyon baskısı

NOT: Ekstrüzyon baskı işlemine genel bir bakış, vakumla çalışan filtrasyonla sıkışmış parçalanmış granüler hidrojeller kullanılarak yıldız şeklindeki bir yapının temsili baskısı da dahil olmak üzere Şekil 5'te gösterilmiştir. Yazdırma iş akışı, bir mürekkebin formüle edilmesinden, baskı tasarımının planlanmasından ve ardından mürekkebin istenen tasarıma göre yazdırılmasından oluşur⁴¹. İstenirse, baskılı granüler hidrojel yapılar, sıkışmadan önce parçalanmış mikrojel süspansiyonuna fazla DTT (5 mM) ve I2959 (ağırlıkça% 0.05) eklenerek ekstrüzyon sonrası fotoçapraz bağlama kullanılarak stabilize edilebilir. Bu, mikrojeller arasında oluşan fotoçapraz bağlı kovalent bağlarla sonuçlanacak ve granüler hidrojel yapısının kalıcı stabilizasyonuna yol açacaktır.

1. Mürekkep formülasyonu
   1. Planlama sürecinde, kullanılacak mürekkebin özelliklerini aklınızda bulundurun. Mürekkebi karakterize etmek için, baskı tasarım sürecini bilgilendirmeye yardımcı olmak için parçalanmış hidrojellerin reolojik analizini tamamlayın. Granüler hidrojellerin reolojik karakterizasyonunu tanımlayan yöntemler başka bir yerde tanımlanmıştır ve bu çalışma için uyarlanabilir⁴⁰.
   2. Reolojik analizden, bir baskı platformu ve bir dizi ilk baskı parametresi seçin.
      NOT: Granüler hidrojel mürekkeplerin genel yüksek viskozitesi ve kesme inceltme özellikleri nedeniyle, tipik olarak vida bazlı ekstrüzyon yazıcılar kullanılır.
2. Baskı tasarımı
   NOT: Repetier Host yazılımı (bundan böyle 3D baskı yazılımı olarak anılacaktır) 3D baskı uygulamaları için kullanılmaktadır (adım 5.2-5.3).
   1. Bilgisayar destekli tasarım (CAD) yazılımı aracılığıyla baskı tasarımları oluşturun. Kullanıcılar sıfırdan yeni tasarımlar oluşturabilir veya hasta doku taramaları veya diğer kullanıcılar gibi önceden var olan tasarımları değiştirebilir. CAD tasarımları oluşturma hakkında daha fazla bilgi için lütfen aşağıdaki^41,42,43 referanslarına bakın.
   2. CAD modellerini G-Koduna işlemek için, CAD dosyasının ".stl" formatında (Ek Dosya 1) kaydedildiğinden ve üst paneldeki yükle düğmesini seçerek veya menü çubuğunda Dosya > Yükle'yi seçerek 3B baskı yazılımına yüklendiğinden emin olun. Bu G kodu, mürekkebin birikmesi için yazdırma yolunu tanımlar. İçi boş bir silindirin örnek bir .stl dosyası ek dosyalara eklenmiştir.
   3. Bir STL dosyası 3B baskı yazılımına yüklendikten sonra, Dilimleyici paneline gidin ve dilimleyici seçeneği olarak Slic3r'yi seçin. Burada, nozul çapı, katman yüksekliği, baskı hızı ve ekstrüzyon hızı gibi ayarlar mürekkep karakterizasyonuna ve istenen baskı sonuçlarına göre ayarlanabilir. Bu protokolde, 18 G'lik bir iğne (838 μm iç çap) kullanılır. Önceki optimizasyon^39'a göre katman yüksekliği 1 mm, baskı hızı 8 mm/sn ve akış hızı 9 μL/sn olarak ayarlanmıştır. Parametrelerin sayısal değerleri, granüler hidrojel mürekkeplerin özelliklerindeki değişiklikleri hesaba katmak için ± %20 oranında ayarlanabilir.
      NOT: Bu ayarların ve baskı tasarımının, mürekkep formülasyonundaki, istenen baskı çözünürlüğündeki veya kullanılan baskı platformundaki ayarlamalara bağlı olarak yinelemeli deneysel testlerle ayarlanması gerekebileceğini unutmayın. Bu parametreler ve baskı ayarlarının yeni bir mürekkep formülasyonu ile karakterizasyonu hakkında daha fazla bilgi için lütfen diğer referanslara bakın^40,44,45,46.
3. Parçalanmış granüler hidrojellerle ekstrüzyon baskısı
   1. Şırıngaları parçalanmış granüler hidrojellerle yüklemek için, bakınız 4.2.4, ayrıca Şekil 4 ve Şekil 5.
   2. Uç kapağını çıkarın ve seçtiğiniz bir iğneyle değiştirin.
   3. Şırıngayı tercih ettiğiniz baskı platformuna yükleyin. Burada, özel yapım vida tabanlı bir ekstrüzyon yazıcı kullanılır.
      NOT: Özel biyoyazıcılar oluşturma hakkında bilgi için lütfen diğer referanslara bakın^44,47.
   4. Hazırlanan G-Code dosyasını planlama aşamasından 3D baskı yazılımına yükleyin. Baskı Önizleme paneline gidin ve Print (Yazdır) düğmesine basın.
   5. Baskı biriktirme işlemi tamamlanır tamamlanmaz, parçalanmış granüler hidrojel yapılarını fotoçapraz bağlama ve stabilizasyon için UV ışığına maruz bırakın.
   6. Çapraz bağlama tamamlandıktan sonra, numuneyi PBS'de üç kez yıkayarak işleyin.

Şekil 5: Parçalanmış granüler hidrojellerle ekstrüzyon baskısına genel bakış. Şekil, (A) parçalanmış granüler hidrojeli bir şırınga namlusuna aktarmak için bir spatula kullanmak, (B) künt uçlu bir iğne (18 G gösterilmiştir) ve numuneyi üste itmek, (C) baskı için bilgisayar yazılımına bağlantıyı temsil eden bir grafik ve (D) parçalanmış granüler hidrojel ile yıldız şeklindeki bir yapının baskısını tamamlamak. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Sonuçlar

Bu protokollerden elde edilen temsili sonuçlar Şekil 3 ve Şekil 6'da gösterilmiştir. Ekstrüzyon parçalanması, çapları 10-300 μm arasında değişen pürüzlü, çokgen şekillere sahip mikrojeller verir (Şekil 3). Ayrıca, dairesellik 0,2 (dairesel değil) ile neredeyse 1 (mükemmel daire) arasında değişir ve en boy oranı 1-3 arasında değişir (Şekil 3). Bu parametreler, parçalanma i...

Tartışmalar

Burada, ekstrüzyon parçalı mikrojeller kullanılarak granüler hidrojellerin üretilmesi ve santrifüjleme veya vakum tahrikli filtrasyon yoluyla ambalajlanması yöntemleri açıklanmaktadır. Diğer mikrojel üretim yöntemleriyle (yani, mikroakışkanlar, toplu emülsiyonlar, elektropüskürtme, fotolitografi) karşılaştırıldığında, ekstrüzyon parçalanması mikrojel üretimi oldukça hızlı, düşük maliyetli, kolayca ölçeklenebilir ve çok çeşitli hidrojel sistemlerine uygundur. Ayrıca, bu protokol...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL Plastic Conical Centrifuge Tube	Corning	430766
30 G NT Premium Series Dispensing Tip	Jensen Global	JG30-0.5HPX	Catalog Number listed here is for 30 G, 0.5" needle. Various sizes are available.
BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips (3 mL)	Fisher Scientific	14-823-435	Catalog Number listed here is for 3 mL syringe. Various sizes are available (14-823-XXX).
Black folders	Various Vendors
Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines (18 G, 0.5")	Grainger	5FVH5	Catalog Number listed here is for 18 G, 0.5" needle. Various sizes are available.
Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines (23 G, 0.5")	Grainger	5FVJ3
Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines (27 G, 1.5")	Grainger	5FVL0
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Fisher Scientific	14190-250	Catalog Number listed here is for a case of 10 x 500 mL bottles.
Durapore Membrane Filter, 0.22 µm	Millipore	GVWP04700
Epifluorescent or confocal microscope	Various Vendors		To visualize microgels and granular hydrogels
Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Safe-Lock Tubes	Fisher Scientific	05-402-25
Extrusion printer	Custom-built		Other extrusion printers can be use,d such as commercially available BIOX.
Filter Adapters	Fisher Scientific	05-888-107	Catalog Number listed here is for a set of multiple sizes. Various sizes are available (05-888-XXX).
Filter Flask	Various Vendors
Fluorescein isothiocyanate-dextran (2 MDa)	Sigma-Aldrich	52471
Glass microscope slide	Various Vendors
ImageJ	National Institutes of Health		"Analyze Particles" information link: https://imagej.nih.gov/ij/docs/menus/analyze.html
Laptop	Various Vendors
Luer-Lock Tip Caps	Integrated Dispensin g Solutions	9991329
Metal spatula for scooping	Various Vendors
Microcentrifuge	Various Vendors		Capable of speed up to 18,000 x g
Microscoft Execl	Microsoft		Other programs can be used, such as Google Slides.
OmniCure S2000 Spot UV Curing System	Excelitas Technologies	S2000	Different light systems may be used to fabricate bulk hydrogels if desired.
Porcelain Buchner Funnel with Fixed Perforated Plate	Fisher Scientific	FB966C	Catalog Number listed here is for 56mm diameter plate. Various sizes are available.
Radiometer	Various Vendors
Repetier Host	Hot-World GmbH & Co. KG		3D printing software
Screw-based extrusion printer	Various Vendors		This study used a custom-modified 3D FDM printer (Velleman K8200). Many alternatives are available.
Solidworks/CAD software	Dassault Systèmes SolidWorks Corporation		Other programs can be used, such as Blender or TinkerCAD.
Tubing to Connect Filter Flask to Vacuum Line	Various Vendors
UV Eye Protection (i.e., safety glasses)	Various Vendors