Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف هذا العمل طرقا مباشرة وقابلة للتكيف ومنخفضة التكلفة لتصنيع الهلاميات الدقيقة مع تجزئة البثق ، ومعالجة الهلاميات الدقيقة في هيدروجيل حبيبي قابل للحقن ، وتطبيق الهلاميات المائية الحبيبية كأحبار طباعة البثق للتطبيقات الطبية الحيوية.

Abstract

الهلاميات المائية الحبيبية هي مجموعات محشورة من جزيئات الهيدروجيل الدقيقة (أي "microgels"). في مجال المواد الحيوية ، تتمتع الهلاميات المائية الحبيبية بالعديد من الخصائص المفيدة ، بما في ذلك الحقن ، والمسامية الدقيقة ، والقابلية عن طريق خلط مجموعات ميكروجيل متعددة. غالبا ما تعتمد طرق تصنيع الهلام الدقيق على مستحلبات الماء في الزيت (على سبيل المثال ، الموائع الدقيقة ، مستحلبات الدفعات ، الرش الكهربائي) أو الطباعة الحجرية الضوئية ، والتي قد تمثل متطلبات عالية من حيث الموارد والتكاليف ، وقد لا تكون متوافقة مع العديد من الهلاميات المائية. يفصل هذا العمل طرقا بسيطة ولكنها فعالة للغاية لتصنيع microgels باستخدام تجزئة البثق ومعالجتها في هيدروجيل حبيبي مفيد للتطبيقات الطبية الحيوية (على سبيل المثال ، أحبار الطباعة 3D). أولا ، يتم بثق الهيدروجيلات السائبة (باستخدام حمض الهيالورونيك القابل للربط الضوئي (HA) كمثال) من خلال سلسلة من الإبر ذات الأقطار الأصغر بالتتابع لتشكيل microgels مجزأة. تقنية تصنيع microgel هذه سريعة ومنخفضة التكلفة وقابلة للتطوير بدرجة كبيرة. يتم وصف طرق التشويش على المواد الهلامية الدقيقة في الهلاميات المائية الحبيبية عن طريق الطرد المركزي والترشيح المدفوع بالتفريغ ، مع ربط اختياري لاحق لتثبيت الهيدروجيل. وأخيرا ، يتم عرض الهلاميات المائية الحبيبية المصنعة من الهلاميات الدقيقة المجزأة كأحبار طباعة بثق. في حين أن الأمثلة الموضحة هنا تستخدم HA القابلة للربط الضوئي للطباعة 3D ، فإن الطرق قابلة للتكيف بسهولة مع مجموعة واسعة من أنواع الهيدروجيل والتطبيقات الطبية الحيوية.

Introduction

يتم تصنيع الهيدروجيل الحبيبي من خلال تعبئة جزيئات الهيدروجيل (أي الهلاميات الدقيقة) وهي فئة مثيرة من المواد الحيوية مع العديد من الخصائص المفيدة للتطبيقات الطبية الحيوية1،2،3. نظرا لبنيتها الجسيمية ، فإن الهلاميات المائية الحبيبية ترقق القص والشفاء الذاتي ، مما يسمح باستخدامها كأحبار طباعة البثق (الحيوية) ، والدعامات الحبيبية للطباعة المضمنة ، والعلاجات القابلة للحقن4،5،6،7،8،9. بالإضافة إلى ذلك ، توفر مساحة الفراغ بين microgels مسامية ميكروسكيل لحركة الخلايا والانتشار الجزيئي8،10،11. علاوة على ذلك ، يمكن دمج مجموعات microgel متعددة في تركيبة واحدة للسماح بتحسين القدرة على الضبط ووظائف المواد8،10،12،13. وقد حفزت هذه الخصائص الهامة التوسع السريع لتطوير هيدروجيل الحبيبات في السنوات الأخيرة.

هناك مجموعة من الطرق المتاحة لتشكيل microgels نحو تصنيع هيدروجيل حبيبي ، لكل منها مزاياها وعيوبها. على سبيل المثال ، غالبا ما تتشكل الهلاميات الدقيقة من مستحلبات الماء في الزيت باستخدام الموائع الدقيقة القطيرات4،11،13،14،15،16،17 ، مستحلبات الدفعات7،18،19،20،21،22 ، أو الرش الكهربائي6،23 ، 24,25. تنتج هذه الطرق هلاميات كروية ذات أقطار موحدة (الموائع الدقيقة) أو polydisperse (مستحلبات الدفعات ، الرش الكهربائي). هناك بعض القيود على طرق تصنيع مستحلب الماء في الزيت هذه ، بما في ذلك الإنتاج المنخفض الإنتاجية المحتمل ، والحاجة إلى حلول سلائف هيدروجيل منخفضة اللزوجة ، وارتفاع التكلفة والموارد اللازمة للإعداد. بالإضافة إلى ذلك ، قد تتطلب هذه البروتوكولات زيوتا قاسية وخافضات للتوتر السطحي يجب غسلها من الهلاميات الدقيقة باستخدام إجراءات تضيف خطوات معالجة ، وقد يكون من الصعب ترجمتها إلى ظروف معقمة للتطبيقات الطبية الحيوية في العديد من المختبرات. إزالة الحاجة إلى مستحلبات الماء في الزيت ، يمكن أيضا استخدام الطباعة الحجرية (الصورة) ، حيث يتم استخدام القوالب أو الأقنعة الضوئية للتحكم في علاج microgels من حلول سلائف الهيدروجيل1،26،27. مثل الموائع الدقيقة ، قد تكون هذه الطرق محدودة في إنتاجية إنتاجها ، وهو تحد كبير عندما تكون هناك حاجة إلى كميات كبيرة.

كبديل لهذه الطرق ، تم استخدام التجزئة الميكانيكية للهيدروجيل السائب لتصنيع microgels بأحجام غير منتظمة19،28،29،30،31،32. على سبيل المثال ، يمكن تشكيل الهيدروجيل السائب مسبقا وتمريره لاحقا عبر الشبكات أو المناخل لتشكيل microgels مجزأة ، وهي عملية تم إجراؤها حتى في وجود خلايا داخل خيوط microgel33,34. كما تمت معالجة المواد الهلامية المائية السائبة إلى مواد هلامية دقيقة مع اضطراب ميكانيكي باستخدام تقنيات مثل الطحن باستخدام الملاط والمدقة أو من خلال استخدام الخلاطات التجارية35،36،37. كما استخدم آخرون التحريض الميكانيكي أثناء تكوين الهيدروجيل لتصنيع المواد الهلامية الدقيقة المجزأة (أي المواد الهلامية السائلة)31.

تتوسع الطرق الواردة هنا في تقنيات التجزئة الميكانيكية هذه وتقدم نهجا بسيطا لتصنيع المواد الهلامية الدقيقة مع تجزئة البثق ، باستخدام هيدروجيل حمض الهيالورونيك القابل للربط الضوئي (HA) كمثال. يستخدم تجزئة البثق المحاقن والإبر فقط لتصنيع microgels مجزأة بطريقة منخفضة التكلفة وعالية الإنتاجية وقابلة للتطوير بسهولة ومناسبة لمجموعة واسعة من الهيدروجيل19,32. علاوة على ذلك ، يتم وصف طرق تجميع هذه الهلاميات الدقيقة المجزأة في هيدروجيل حبيبي إما باستخدام الطرد المركزي (التعبئة المنخفضة) أو الترشيح المدفوع بالفراغ (التعبئة العالية). أخيرا ، تتم مناقشة تطبيق هذه المواد الهلامية المائية الحبيبية المجزأة لاستخدامها كحبر طباعة بثق. الهدف من هذا البروتوكول هو إدخال طرق بسيطة قابلة للتكيف مع مجموعة واسعة من الهيدروجيل ويمكن تنفيذها في أي مختبر تقريبا مهتم بالهلاميات المائية الحبيبية.

Protocol

1. تصنيع المواد الهلامية السائبة داخل حقنة باستخدام الربط الضوئي

ملاحظة: يبين الشكل 1 نظرة عامة على تصنيع الهيدروجيل السائب داخل حقنة باستخدام الربط الضوئي. يستخدم هذا البروتوكول حمض الهيالورونيك المعدل بالنوربورنين (NorHA) لتصنيع الهيدروجيل السائب باستخدام تفاعل ثيول-إيني بوساطة ضوئية. يتم وصف الإجراءات التفصيلية لتوليف NorHA في مكان آخر38. ومع ذلك ، فإن هذا البروتوكول قابل للتكيف بشكل كبير مع أي هيدروجيل قابل للربط الضوئي. راجع المناقشة لمزيد من المعلومات.

  1. حدد مسبقا التركيزات المطلوبة من البوليمر ، و crosslink ، والبادئين لصياغة الهيدروجيل السائب. في هذا البروتوكول ، يتكون محلول سلائف الهيدروجيل من NorHA (2 wt. ، ~ 25٪ من درجة تعديل النوربورنين) ، dithiothreitol (DTT ، 6 mM) ، و Irgacure D-2959 (I2959 ، 0.05 wt.٪). تأكد من إذابة المكونات (1 مل) بالكامل في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) داخل أنبوب جهاز طرد مركزي دقيق.
    ملاحظة: عند تحضير محلول سلائف الهيدروجيل ، يمكن إضافة FITC-dextran عالي الوزن الجزيئي (2 MDa ، 0.1 wt.٪) إلى المحلول لتصور المواد الهلامية الدقيقة المصنعة لاحقا في البروتوكول باستخدام المجهر الفلوري.
  2. قم بتحميل حقنة 3 مل بمحلول سلائف الهيدروجيل.
    1. قم بإزالة المكبس من الجزء الخلفي من حقنة فارغة سعة 3 مل وأضف غطاء طرف إلى الجزء العلوي من برميل المحقنة.
    2. استخدم ماصة 1000 ميكرولتر لنقل محلول سلائف الهيدروجيل إلى برميل المحقنة مع غطاء الطرف.
    3. امسك برميل المحقنة بمحلول سلائف هيدروجيل في يد واحدة ، مع توجيه غطاء الطرف لأسفل والطرف المفتوح للبرميل متجها لأعلى. من ناحية أخرى ، أعد مكبس المحقنة إلى فتحة الجزء الخلفي من برميل المحقنة. ادفع مكبس المحقنة برفق إلى البرميل ، وهو ما يكفي فقط لإغلاق الفتحة الموجودة في الجزء الخلفي من برميل المحقنة.
    4. قم بإمساك المكبس وبرميل المحقنة معا بعناية لضمان إغلاق الجزء الخلفي من برميل المحقنة باستخدام المكبس ، وعكس المحقنة بحيث يكون المكبس متجها لأسفل ، وغطاء الطرف متجها الآن لأعلى. قم بإزالة غطاء الطرف وادفع المكبس برفق إلى برميل المحقنة حتى تتم إزالة كل الهواء من المحقنة (يبقى فقط محلول سلائف الهيدروجيل).
    5. أعد توصيل غطاء الطرف بالحقنة. تأكد من تأمين محلول سلائف الهيدروجيل داخل حقنة 3 مل مع غطاء طرف.
  3. تشكيل هيدروجيل السائبة داخل حقنة 3 مل.
    1. تأكد من أخذ معدات الحماية الشخصية المناسبة (PPE) والضمانات قبل تشغيل مصباح الأشعة فوق البنفسجية. ويشمل ذلك ارتداء نظارات واقية من الأشعة فوق البنفسجية وإحاطة منطقة المصباح لحماية الآخرين من الأشعة فوق البنفسجية.
    2. قم بمعايرة مصباح علاج البقع بالأشعة فوق البنفسجية إلى شدة ضوء تبلغ 10 mW / cm2 باستخدام مقياس إشعاع.
      ملاحظة: سيكون هناك توهين خفيف من خلال برميل المحقنة. قبل التصنيع، أوجد النسبة المئوية لتوهين الضوء الموجود باستخدام مقياس إشعاعي. وينبغي تعديل خرج شدة الضوء من نظام المعالجة الموضعية وفقا لذلك لمراعاة هذا التوهين.
    3. ضع المحقنة سعة 3 مل المحملة بمحلول السلائف الهيدروجيلية تحت مصباح علاج البقع بالأشعة فوق البنفسجية لفترة زمنية مطلوبة للربط الضوئي بالكامل. بالنسبة للنظام الموصوف هنا ، يتعرض محلول سلائف الهيدروجيل NorHA للأشعة فوق البنفسجية لمدة 5 دقائق بكثافة 10 mW / cm2 ، والتي ، استنادا إلى الدراسات السابقة39 ، كانت كافية من الوقت وشدة الضوء لضمان الربط الكامل على النحو الذي تحدده عمليات مسح ريولوجيا القص المتذبذبة الضوئية.
      ملاحظة: لضمان الربط الضوئي الكامل داخل المحقنة، يمكن قلب المحقنة في منتصف الطريق خلال فترة الربط الضوئي.
    4. أطفئ مصباح الأشعة فوق البنفسجية وأزل المحقنة. تأكد من أن الهيدروجيل الآن مرتبط ضوئيا داخل المحقنة. يمكن القيام بذلك عن طريق سحب المكبس ومراقبة حركة الهيدروجيل ككتلة صلبة بدلا من سائل لزج.

figure-protocol-3647
الشكل 1: نظرة عامة على تصنيع المواد الهلامية السائبة داخل حقنة باستخدام الربط الضوئي. ويصور الشكل (أ) إزالة المكبس من المحقنة، (ب) تثبيت غطاء الطرف إلى برميل المحقنة، (ج) إضافة سلائف هيدروجيل إلى برميل المحقنة، (د) إعادة المكبس إلى المحقنة، (ه) إزالة الهواء الزائد وتأمين غطاء الطرف، و (و) هيدروجيل سائب ضوئي داخل المحقنة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

2. تصنيع microgels باستخدام تجزئة البثق

ملاحظة: يبين الشكل 2 نظرة عامة على تصنيع الميكروجيل باستخدام تجزئة البثق.

  1. قم بإزالة المكبس من الجزء الخلفي من حقنة فارغة سعة 3 مل. قم بتأمين غطاء طرف إلى Luer-Lock.
  2. قم بإزالة غطاء الطرف من المحقنة التي تحتوي على الهيدروجيل السائب المتقاطع ضوئيا. اصطف الجزء العلوي من حقنة الهيدروجيل مع فتح البرميل على المحقنة الفارغة.
  3. قم بقذف الهيدروجيل السائب من خلال فتحة المحقنة (بدون إبرة مرفقة) في برميل المحقنة الفارغة. تخلص بشكل صحيح من المحقنة الفارغة الآن (التي كانت تحتوي سابقا على الهيدروجيل) في تيار النفايات المناسب.
  4. امسك المحقنة التي تحتوي على الهيدروجيل المبثوق بحيث يكون غطاء الطرف متجها لأسفل ، وتكون فتحة البرميل متجهة لأعلى. باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر ، أضف 1.5 مل من PBS إلى برميل المحقنة.
  5. قم بمحاذاة مكبس المحقنة مع فتحة البرميل ، وبالكاد دفع المكبس إلى الداخل بما يكفي لإنشاء ختم. قم بعكس المحقنة بحيث يكون المكبس الآن متجها لأسفل وغطاء الطرف متجها لأعلى ، مع التأكد من تثبيت المكبس وبرميل المحقنة معا في مكانه بحيث لا يتسرب أي هيدروجيل أو PBS. عكس عدة مرات لخلط هيدروجيل مجزأة مع PBS المضافة.
  6. أمسك المحقنة بحيث يكون غطاء الطرف متجها لأعلى والمكبس متجها لأسفل. قم بإزالة غطاء الحافة. ادفع المكبس بلطف شديد لأعلى لإزالة أي هواء من داخل المحقنة.
    ملاحظة: من المحتمل أن يكون هناك أخدود في الجزء الخلفي من حقنة 3 مل التي تتطلب قوة إضافية لدفع المكبس إلى الداخل. ادفع المكبس بعناية فائقة فوق الأخدود. أي كمية مفاجئة أو قاسية من القوة ستؤدي إلى تحرك المكبس بسرعة كبيرة وربما طرد تعليق الهيدروجيل المجزأ.
  7. قذف تعليق الهيدروجيل المجزأ من خلال سلسلة من الإبر لإنشاء microgels مجزأة.
    1. قم بتثبيت إبرة حادة بطرف 18 جم في الجزء العلوي من المحقنة التي تحتوي على الهيدروجيل المجزأ و PBS. قم بإزالة المكبس من حقنة جديدة سعة 3 مل وقم بتثبيت غطاء طرف على برميل المحقنة الفارغ.
    2. بثق تعليق الهيدروجيل المجزأ من خلال إبرة 18 G في الجزء الخلفي من برميل المحقنة الفارغ. تخلص من المحقنة والإبرة الفارغة في تيار نفايات الأدوات الحادة المناسب.
    3. أمسك المحقنة التي تحتوي على تعليق هيدروجيل مجزأ بحيث يكون غطاء الطرف متجها لأسفل وفتحة البرميل متجهة لأعلى. قم بمحاذاة مكبس المحقنة مع فتحة البرميل ، وبالكاد دفع المكبس إلى الداخل بما يكفي لإنشاء ختم.
    4. اقلب المحقنة بحيث يكون المكبس متجها الآن لأسفل ، وغطاء الطرف متجها لأعلى ، مع التأكد من تثبيت المكبس وبرميل المحقنة معا حتى لا يتسرب أي هيدروجيل أو PBS.
    5. أمسك المحقنة بحيث يكون غطاء الطرف متجها لأعلى والمكبس متجها لأسفل. قم بإزالة غطاء الحافة. ادفع المكبس بلطف شديد لأعلى لإزالة أي هواء من داخل المحقنة. انظر الملاحظة أعلاه فيما يتعلق بدفع مكبس المحقنة بلطف إلى الداخل لمنع الطرد غير المرغوب فيه لمادة الهيدروجيل.
    6. كرر الخطوات 2.7.1-2.7.5 باستخدام إبرة 23 جم و27 جم و30 جم. عند خطوة البثق الأخيرة (إبرة 30 جم) ، قم ببثق تعليق الهيدروجيل المجزأ في أنابيب الطرد المركزي الدقيق. بالنسبة للأحجام الموضحة هنا ، سيكون حجم تعليق الهيدروجيل النهائي المجزأ ~ 2.5 مل ، مما يتطلب أنبوبين لأجهزة الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل (تقسيم الحجم بالتساوي).
      ملاحظة: لا ينبغي أن تكون هناك حاجة إلى قوة مفرطة لبثق تعليق هيدروجيل مجزأ من خلال الإبر. للحصول على أفضل ممارسات السلامة ، يوصى بإجراء جميع خطوات تجزئة البثق داخل غطاء محرك السيارة الكيميائي لتوفير الحماية في حالة الإفراط في ضغط المحقنة أثناء البثق. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تنفيذ هذه العملية بسهولة في خزانة السلامة الأحيائية / غطاء التدفق الرقائقي للحفاظ على العقم أثناء التصنيع. راجع المناقشة للحصول على اقتراحات إضافية لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها.
  8. اغسل وعزل تعليق الهيدروجيل المجزأ.
    ملاحظة: غسل المواد الهلامية الدقيقة المجزأة سيساعد على إزالة أي بوليمر غير متفاعل ورابط متقاطع. بالإضافة إلى ذلك ، سيساعد الطرد المركزي على عزل microgels من التعليق عن طريق تشكيل بيليه.
    1. باستخدام جهاز طرد مركزي دقيق ، قم بتدوير تعليق microgel المجزأ عند 5000 × g لمدة 5 دقائق.
    2. استخدم ماصة لإزالة السوبرناتانت. أضف 1 مل من PBS إلى كل أنبوب طرد مركزي صغير يحتوي على ميكروجيل مجزأ ودوامة لمدة 5-10 ثوان.
    3. كرر الطرد المركزي والغسيل باستخدام PBS 3x.

figure-protocol-8469
الشكل 2: نظرة عامة على تصنيع الميكروجيل باستخدام تجزئة البثق. يصور الشكل (أ) بثق هيدروجيل سائب في برميل حقنة فارغ وإضافة PBS ، (ب) تأمين مكبس في المحقنة بهيدروجيل مجزأ ، (ج) ربط إبرة 18 جم وبثق تعليق هيدروجيل مجزأ في برميل حقنة فارغ ، و (د) تكرار خطوات تجزئة البثق مع إبر 23 جم و 27 جم و 30 جم ، جمع تعليق هيدروجيل مجزأ في أنابيب الطرد المركزي الدقيق على البثق النهائي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

3. توصيف الهلاميات الدقيقة المجزأة باستخدام ImageJ

ملاحظة: تظهر نظرة عامة على توصيف الهلاميات الدقيقة المجزأة باستخدام ImageJ في الشكل 3 ، بالإضافة إلى نتائج تمثيلية لوصف توزيعات الحجم والأشكال داخل مجموعة من الهلاميات الدقيقة المجزأة. يجب وضع علامة على المواد الهلامية الدقيقة بشكل فلوري قبل التصور. على سبيل المثال ، يمكن تغليف وزن الجزيء العالي FITC-dextran (2 MDa) في الهيدروجيل السائب قبل التجزئة لإنشاء microgels تحمل علامة الفلوريسين.

  1. اجمع بين 20 ميكرولتر من تعليق ميكروجيل مجزأ مع 180 ميكرولتر من PBS لإنشاء تعليق ميكروجيل مجزأ مخفف. دوامة لخلط جيدا.
  2. نقل 50 ميكرولتر من تعليق ميكروجيل مجزأ مخفف إلى شريحة مجهر زجاجية.
  3. استخدم مجهرا epifluorescent للحصول على صور للهلام المجهري الموسوم بالفلورسنت عند تكبير/تصغير 4x أو 10x.
    ملاحظة: يجب تخفيف تعليق microgel بما فيه الكفاية بحيث لا تكون microgels المجاورة على اتصال مع بعضها البعض ، ولكنها مركزة بما فيه الكفاية بحيث تكون العشرات من microgels مرئية في إطار العرض. يمكن تعديل تخفيف تعليق microgel وفقا لذلك لتحقيق ذلك.
  4. استخدام ImageJ لتحليل جزيئات ميكروجيل مجزأة. يمكن العثور على معلومات إضافية حول استخدام وظيفة تحليل الجسيمات في ImageJ في الرابط المتوفر في جدول المواد.
    1. افتح صور microgels المعلقة في ImageJ.
    2. حدد تحليل > تعيين القياسات، والتحقق من المساحة، واصفات الأشكال، وقطر فيريت. انقر فوق موافق.
    3. حدد نوع الصورة > > 8 بت.
    4. حدد صورة > ضبط عتبة >. اضبط العتبة بحيث يتم تغطية microgels بقناع أحمر ، وتظل الخلفية سوداء. انقر على تطبيق.
      ملاحظة: إذا كانت أي هلاميات دقيقة متداخلة قليلا، فاستخدم أداة القلم الرصاص لرسم خط أسود رفيع (<5 بكسل) بين الهلاميات الدقيقة لفصلها في الصورة بالأبيض والأسود.
    5. حدد تحليل > تحليل الجسيمات. اضبط الحجم (بكسل2) من 50 إلى ما لا نهاية لتقليل ضوضاء الخلفية. اضبط التعميم على 0.00-1.00. حدد إظهار الخطوط العريضة من القائمة المنسدلة. تحقق من عرض النتائج، واستبعد على الحواف، وقم بتضمين الثقوب. اترك المربعات المتبقية دون تحديد. انقر فوق موافق.
    6. سيتم فتح عرض النتائج ، بما في ذلك المساحة ، واصفات الشكل ، ومعلومات قطر Feret لكل ميكروجيل تم تحديده. انسخ النتائج والصقها في جدول بيانات.
    7. أوجد القطر الدائري المكافئ لكل جسيم.
      1. احصل على مقياس الصورة بالميكرومتر/البكسل من شريط المقياس أو معلومات الأداة. قم بإنشاء عمود في جدول البيانات يحول مساحة كل ميكروجيل من pixel 2 إلى μm2.
      2. استخدم المساحة بالميكرومتر2 لتحديد القطر الدائري المكافئ للميكروجيل بالميكروجيل بالميكرومتر (أي خذ الجذر التربيعي للمساحة مقسوما على pi ، ثم ضاعفه).
    8. استخدم مقياس μm/pixel لتحويل أقطار Feret (أي أطول مسافة بين أي نقطتين على حدود الجسيمات) لكل ميكروجيل إلى وحدة ميكرومتر.
    9. يمكن استخدام الدائرية ("الدائرية") ونسبة العرض إلى الارتفاع ("AR") والاستدارة ("الجولة") وقيم الصلابة لكل ميكروجيل كما هو مباشر من ImageJ.
    10. قم بتحليل مجموعة microgel حسب الرغبة ، مع مراعاة توزيع الأقطار (الدائرية المكافئة و Feret) ، والدائرية ، ونسبة العرض إلى الارتفاع ، والاستدارة ، والصلابة.

figure-protocol-12653
الشكل 3: نظرة عامة على توصيف جزيئات ميكروجيل مجزأة باستخدام ImageJ. يصور الشكل (أ) إنشاء تعليق مخفف لجزيئات ميكروجيل مجزأة واستخدام مجهر فوق فلوري أو متحد البؤرة لتصوير المواد الهلامية الدقيقة في التعليق (شريط المقياس = 500 ميكرومتر) ، (ب) التحويل إلى صورة ثنائية في ImageJ وتحليل الجسيمات (العد ، واصفات الشكل ، إلخ) ، و (C) النتائج التمثيلية. تصور أشرطة الخطأ الحد الأدنى والحد الأقصى مع ترسيم نطاقات الربع الداخلي. يظهر حجم السكان n = 100 microgels. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

4. تجميع الهلاميات الدقيقة المجزأة في هيدروجيل حبيبي

ملاحظة: يتم تقديم طريقتين لصياغة الهلاميات المائية الحبيبية من الهلاميات الدقيقة المجزأة ، باستخدام الطرد المركزي والترشيح. تعتمد الطريقة المستخدمة على تعبئة microgel المطلوبة (أي أن حزم الترشيح تحزم الجسيمات بشكل أكثر كثافة) وما إذا كانت المكونات البيولوجية مدرجة (أي أن الطرد المركزي سيحتفظ بالمكونات بين الجسيمات ، بينما في الترشيح قد يتم فقدانها). يصف العمل السابق40 بدقة النتائج المقارنة (أي الميكانيكا والمسامية) للهيدروجيل الحبيبي المتكون إما من أجهزة الطرد المركزي أو الترشيح المدفوع بالفراغ.

  1. الخيار 1: مربى الهلاميات الدقيقة المجزأة باستخدام الطرد المركزي.
    1. بعد إزالة PBS supernatant من خطوة الغسيل الأخيرة ، أضف 1 مل من PBS إلى كل أنبوب طرد مركزي دقيق وأعد تعليق المواد الهلامية الدقيقة.
    2. قم بتدوير تعليق الهيدروجيل المجزأ عند 18000 × g لمدة 5 دقائق.
      ملاحظة: يمكن استخدام سرعات أجهزة الطرد المركزي الأبطأ للتشويش على المواد الهلامية الدقيقة في الهلاميات المائية الحبيبية مع تعبئة أقل كثافة إذا رغبت في ذلك.
    3. قم بإزالة السوبرناتانت PBS.
    4. احصل على حقنة جديدة سعة 3 مل وقم بإزالة المكبس. استخدم ملعقة معدنية لإخراج الهيدروجيل الحبيبي المجزأ من أنبوب جهاز الطرد المركزي الدقيق ونقله إلى الجزء الخلفي من برميل المحقنة الفارغ. يمكن استخدام طرف ماصة للمساعدة في نقل الهيدروجيل الحبيبي إلى المحقنة. أعد المكبس إلى المحقنة. الآن قم بتحميل الهيدروجيل الحبيبي المجزأ في المحقنة ، وهو جاهز للاستخدام.
  2. الخيار 2: مربى الهلاميات الدقيقة المجزأة باستخدام الترشيح القائم على الفراغ. ويبين الشكل 4 لمحة عامة عن التشويش عن طريق الترشيح المدفوع بالفراغ.
    1. قم بتجميع واختبار جهاز الترشيح المدفوع بالفراغ.
      1. قم بتأمين قمع Buchner داخل قارورة مرشح ، مع وضع محول المرشح بين القمع وفتحة القارورة.
      2. استخدم الأنابيب لتوصيل قارورة المرشح بخط فراغ.
      3. ضع مرشح غشاء (0.22 ميكرومتر) في كوب قمع Buchner.
      4. قم بتشغيل خط التفريغ عن طريق فتح صمام الطلب. اختبر الاتصال عن طريق سحب ~ 0.5 مل من PBS على مرشح الغشاء ولاحظ أن جميع PBS تمر عبر المرشح وتتجمع في الجزء السفلي من قارورة المرشح.
    2. قم بتشغيل خط التفريغ وتأكد من وجود ختم كامل. دوامة تعليق هيدروجيل مجزأة بحيث يتم تعليق microgels في PBS.
    3. باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر ، انقل تعليق الهيدروجيل المجزأ إلى مرشح الغشاء (0.22 ميكرومتر). بعد نقل تعليق microgel بالكامل ، انتظر ~ 30 ثانية حتى يسحب الفراغ PBS من تعليق الهيدروجيل المجزأ. قم بإيقاف تشغيل خط التفريغ.
      ملاحظة: يمكن أن يختلف الوقت الذي يجلس فيه تعليق الهيدروجيل المجزأ على مرشح الغشاء أثناء سحب الفراغ. راجع المناقشة للحصول على مزيد من المعلومات واقتراحات استكشاف الأخطاء وإصلاحها.
    4. احصل على حقنة جديدة سعة 3 مل وقم بإزالة المكبس. استخدم ملعقة معدنية لسحب الهيدروجيل الحبيبي المجزأ من المرشح ونقله إلى الجزء الخلفي من برميل المحقنة الفارغ. يمكن استخدام طرف ماصة للمساعدة في نقل الهيدروجيل الحبيبي إلى المحقنة. أعد المكبس إلى المحقنة. قم بتحميل الهيدروجيل الحبيبي المجزأ في المحقنة ، وهو الآن جاهز للاستخدام.

figure-protocol-16560
الشكل 4: نظرة عامة على التشويش على الهلاميات الدقيقة عن طريق الترشيح المدفوع بالتفريغ لتصنيع الهلاميات المائية الحبيبية المجزأة المعبأة بإحكام. يصور الشكل (أ) وضع مرشح غشاء على جهاز الترشيح الفراغي ، (ب) استخدام ماصة لنقل تعليق ميكروجيل مجزأ إلى المرشح ، (ج) سحب الفراغ وانتظار الميكروجيل للتشويش وتشكيل هيدروجيل حبيبي ، (د) إيقاف تشغيل الفراغ وإزالة هيدروجيل حبيبي مجزأ باستخدام ملعقة معدنية ، و (ه) باستخدام ملعقة معدنية لنقل هيدروجيل حبيبي إلى المحقنة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

5. طباعة البثق مع أحبار هيدروجيل حبيبية

ملاحظة: يبين الشكل 5 نظرة عامة على عملية طباعة البثق، بما في ذلك طباعة تمثيلية لبنية على شكل نجمة باستخدام هلاميات هيدروجيلية حبيبية مجزأة محشورة بالترشيح المدفوع بالفراغ. يتكون سير عمل الطباعة من صياغة حبر، وتخطيط تصميم الطباعة، ثم طباعة الحبر استنادا إلى التصميم المطلوب41. إذا رغبت في ذلك ، يمكن تثبيت تركيبات الهيدروجيل الحبيبية المطبوعة باستخدام الربط الضوئي بعد البثق عن طريق إضافة DTT الزائد (5 mM) و I2959 (0.05 wt.٪) إلى تعليق microgel المجزأ قبل التشويش. سيؤدي ذلك إلى روابط تساهمية متقاطعة ضوئيا تتشكل بين الهلاميات الدقيقة ، مما يؤدي إلى استقرار دائم في بنية الهيدروجيل الحبيبية.

  1. صياغة الحبر
    1. أثناء عملية التخطيط ، ضع في اعتبارك خصائص الحبر المراد استخدامه. لتوصيف الحبر، أكمل التحليل الريولوجي للهيدروجيل المجزأ للمساعدة في إثراء عملية تصميم الطباعة. يتم وصف الطرق التي تصف التوصيف الريولوجي للهيدروجيل الحبيبي في مكان آخر ويمكن تكييفها لهذه الدراسة40.
    2. من التحليل الريولوجي، حدد منصة طباعة وسلسلة من معلمات الطباعة الأولية.
      ملاحظة: نظرا للزوجة العالية بشكل عام وخصائص ترقق القص لأحبار الهيدروجيل الحبيبية، عادة ما يتم استخدام طابعات البثق القائمة على المسمار.
  2. تصميم الطباعة
    ملاحظة: يستخدم برنامج Repetier Host (يشار إليه من الآن فصاعدا باسم برنامج الطباعة ثلاثية الأبعاد) لتطبيقات الطباعة ثلاثية الأبعاد (الخطوات 5.2-5.3).
    1. إنشاء تصميمات الطباعة من خلال برنامج التصميم بمساعدة الكمبيوتر (CAD). يمكن للمستخدمين إنشاء تصميمات جديدة من الصفر أو تعديل التصاميم الموجودة مسبقا ، مثل مسح أنسجة المريض أو من المستخدمين الآخرين. لمزيد من المعلومات حول إنشاء تصميمات CAD ، يرجى الرجوع إلى المراجع التالية41،42،43.
    2. لمعالجة نماذج CAD في G-Code، تأكد من حفظ ملف CAD بتنسيق ".stl" (الملف التكميلي 1) وتحميله إلى برنامج الطباعة ثلاثية الأبعاد عن طريق تحديد زر التحميل في اللوحة العلوية أو تحديد تحميل > ملف في شريط القوائم. يحدد رمز G هذا مسار الطباعة لترسيب الحبر. تم تضمين مثال على ملف .stl لأسطوانة مجوفة في الملفات التكميلية.
    3. بمجرد تحميل ملف STL إلى برنامج الطباعة ثلاثية الأبعاد، انتقل إلى لوحة مقسم طريقة العرض وحدد Slic3r كخيار مقسم طريقة العرض. هنا ، يمكن ضبط الإعدادات مثل قطر الفوهة وارتفاع الطبقة وسرعة الطباعة ومعدل البثق استنادا إلى توصيف الحبر ونتائج الطباعة المطلوبة. في هذا البروتوكول ، يتم استخدام إبرة 18 G (قطرها الداخلي 838 ميكرومتر). يتم ضبط ارتفاع الطبقة على 1 مم، ويتم ضبط سرعة الطباعة على 8 مم/ثانية، ويتم ضبط معدل التدفق على 9 ميكرولتر/ثانية، استنادا إلى التحسين السابق39. يمكن تعديل القيم العددية للمعلمات بنسبة ± 20٪ لمراعاة الاختلافات في خصائص أحبار الهيدروجيل الحبيبية.
      ملاحظة: من المهم ملاحظة أن هذه الإعدادات وتصميم الطباعة قد تحتاج إلى ضبط من خلال الاختبارات التجريبية التكرارية، اعتمادا على التعديلات التي تم إجراؤها على تركيبة الحبر أو دقة الطباعة المطلوبة أو النظام الأساسي للطباعة المستخدم. لمزيد من المعلومات حول هذه المعلمات، وكذلك حول توصيف إعدادات الطباعة بصيغة حبر جديدة، يرجى الرجوع إلى المراجع الأخرى40،44،45،46.
  3. طباعة البثق باستخدام هيدروجيل حبيبي مجزأ
    1. وللاطلاع على تحميل المحاقن بمواد هلامية هيدروجيلية حبيبية مجزأة، انظر 4-2-4، وكذلك الشكل 4 والشكل 5.
    2. قم بإزالة غطاء الطرف واستبدله بإبرة من اختيارك.
    3. قم بتحميل المحقنة في منصة الطباعة التي تختارها. هنا ، يتم استخدام طابعة بثق قائمة على المسمار مصممة خصيصا.
      ملاحظة: للحصول على معلومات حول إنشاء طابعات حيوية مخصصة، يرجى الاطلاع على المراجع الأخرى44,47.
    4. قم بتحميل ملف G-Code المعد من مرحلة التخطيط إلى برنامج الطباعة 3D. انتقل إلى لوحة معاينة الطباعة واضغط على طباعة.
    5. بمجرد اكتمال ترسب الطباعة، قم بتعريض هياكل الهيدروجيل الحبيبية المجزأة للأشعة فوق البنفسجية للربط الضوئي والاستقرار.
    6. بمجرد اكتمال الربط المتقاطع ، قم بمعالجة العينة عن طريق غسلها في PBS ثلاث مرات.

figure-protocol-21756
الشكل 5: نظرة عامة على طباعة البثق باستخدام الهلاميات المائية الحبيبية المجزأة. يصور الشكل (أ) باستخدام ملعقة لنقل هيدروجيل حبيبي مجزأ إلى برميل حقنة ، (ب) ربط إبرة حادة الطرف (18 جم موضحة) ودفع العينة إلى الأعلى ، (ج) رسم بياني يمثل الاتصال ببرنامج الكمبيوتر للطباعة ، و (د) إكمال طباعة بنية على شكل نجمة مع هيدروجيل حبيبي مجزأ. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

النتائج

وترد النتائج التمثيلية لهذه البروتوكولات في الشكل 3 والشكل 6. ينتج عن تجزئة البثق هلاميات دقيقة ذات أشكال مضلعات خشنة بأقطار تتراوح بين 10-300 ميكرومتر (الشكل 3). علاوة على ذلك ، تتراوح الدائرية من 0.2 (غير دائرية) إلى 1 تقريبا (دائرة مثالية) ، وتترا...

Discussion

هنا ، يتم وصف طرق تصنيع الهيدروجيل الحبيبي باستخدام الهلاميات الدقيقة المجزأة البثق والتعبئة إما عن طريق الطرد المركزي أو الترشيح المدفوع بالفراغ. بالمقارنة مع طرق تصنيع microgel الأخرى (أي الموائع الدقيقة ، مستحلبات الدفعات ، الرش الكهربائي ، الطباعة الحجرية الضوئية) ، فإن تصنيع microgel لتجزئ?...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم من خلال برنامج UPenn MRSEC (DMR-1720530) وزمالات أبحاث الدراسات العليا (إلى V.G.M و M.E.P.) والمعاهد الوطنية للصحة (R01AR077362 إلى J.A.B).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
15 mL Plastic Conical Centrifuge TubeCorning430766
30 G NT Premium Series Dispensing TipJensen GlobalJG30-0.5HPXCatalog Number listed here is for 30 G, 0.5" needle. Various sizes are available.
BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips (3 mL)Fisher Scientific14-823-435Catalog Number listed here is for 3 mL syringe. Various sizes are available (14-823-XXX).
Black foldersVarious Vendors
Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines (18 G, 0.5")Grainger5FVH5Catalog Number listed here is for 18 G, 0.5" needle. Various sizes are available.
Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines (23 G, 0.5")Grainger5FVJ3
Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines (27 G, 1.5")Grainger5FVL0
Dulbecco's Phosphate Buffered SalineFisher Scientific14190-250Catalog Number listed here is for a case of 10 x 500 mL bottles.
Durapore Membrane Filter, 0.22 µmMilliporeGVWP04700
Epifluorescent or confocal microscopeVarious VendorsTo visualize microgels and granular hydrogels
Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Safe-Lock TubesFisher Scientific05-402-25
Extrusion printerCustom-builtOther extrusion printers can be use,d such as commercially available BIOX.
Filter AdaptersFisher Scientific05-888-107Catalog Number listed here is for a set of multiple sizes. Various sizes are available (05-888-XXX).
Filter FlaskVarious Vendors
Fluorescein isothiocyanate-dextran (2 MDa)Sigma-Aldrich52471
Glass microscope slideVarious Vendors
ImageJNational Institutes of Health"Analyze Particles" information link: https://imagej.nih.gov/ij/docs/menus/analyze.html
LaptopVarious Vendors
Luer-Lock Tip CapsIntegrated Dispensin g Solutions9991329
Metal spatula for scoopingVarious Vendors
MicrocentrifugeVarious VendorsCapable of speed up to 18,000 x g
Microscoft ExeclMicrosoftOther programs can be used, such as Google Slides.
OmniCure S2000 Spot UV Curing SystemExcelitas TechnologiesS2000Different light systems may be used to fabricate bulk hydrogels if desired.
Porcelain Buchner Funnel with Fixed Perforated PlateFisher ScientificFB966CCatalog Number listed here is for 56mm diameter plate. Various sizes are available.
RadiometerVarious Vendors
Repetier HostHot-World GmbH & Co. KG3D printing software
Screw-based extrusion printerVarious VendorsThis study used a custom-modified 3D FDM printer (Velleman K8200). Many alternatives are available.
Solidworks/CAD softwareDassault Systèmes SolidWorks CorporationOther programs can be used, such as Blender or TinkerCAD.
Tubing to Connect Filter Flask to Vacuum LineVarious Vendors
UV Eye Protection (i.e., safety glasses)Various Vendors

References

  1. Daly, A. C., Riley, L., Segura, T., Burdick, J. A. Hydrogel microparticles for biomedical applications. Nature Reviews Materials. 5 (1), 20-43 (2020).
  2. Qazi, T. H., Burdick, J. A. Granular hydrogels for endogenous tissue repair. Biomaterials and Biosystems. 1, 100008 (2021).
  3. Riley, L., Schirmer, L., Segura, T. Granular hydrogels: emergent properties of jammed hydrogel microparticles and their applications in tissue repair and regeneration. Current Opinion in Biotechnology. 60, 1-8 (2019).
  4. Highley, C. B., Song, K. H., Daly, A. C., Burdick, J. A. Jammed microgel inks for 3D printing applications. Advanced Science. 6 (1), 1801076 (2019).
  5. Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., Di Carlo, D., Segura, T. Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks. Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).
  6. Xin, S., Chimene, D., Garza, J. E., Gaharwar, A. K., Alge, D. L. Clickable PEG hydrogel microspheres as building blocks for 3D bioprinting. Biomaterials Science. 7 (3), 1179-1187 (2019).
  7. Hirsch, M., Charlet, A., Amstad, E. 3D printing of strong and tough double network granular hydrogels. Advanced Functional Materials. 31 (5), 2005929 (2021).
  8. Seymour, A. J., Shin, S., Heilshorn, S. C. 3D printing of microgel scaffolds with tunable void fraction to promote cell infiltration. Advanced Healthcare Materials. 10 (18), 2100644 (2021).
  9. Xin, S., et al. Generalizing hydrogel microparticles into a new class of bioinks for extrusion bioprinting. Science Advances. 7 (42), (2021).
  10. de Rutte, J. M., Koh, J., Di Carlo, D. Scalable high-throughput production of modular microgels for in situ assembly of microporous tissue scaffolds. Advanced Functional Materials. 29 (25), 1900071 (2019).
  11. Qazi, T. H., et al. Anisotropic rod-shaped particles influence injectable granular hydrogel properties and cell invasion. Advanced Materials. 34 (12), 2109194 (2021).
  12. Darling, N. J., Sideris, E., Hamada, N., Carmichael, S. T., Segura, T. Injectable and spatially patterned microporous annealed particle (MAP) hydrogels for tissue repair applications. Advanced Science. 5 (11), 1-8 (2018).
  13. Hsu, R. S., et al. Adaptable microporous hydrogels of propagating NGF-gradient by injectable building blocks for accelerated axonal outgrowth. Advanced Science. 6 (16), 1900520 (2019).
  14. Sheikhi, A., et al. Microfluidic-enabled bottom-up hydrogels from annealable naturally-derived protein microbeads. Biomaterials. 192, 560-568 (2019).
  15. Griffin, D. R., et al. Activating an adaptive immune response from a hydrogel scaffold imparts regenerative wound healing. Nature Materials. 20 (4), 560-569 (2021).
  16. Pruett, L. J., Jenkins, C. H., Singh, N. S., Catallo, K. J., Griffin, D. R. Heparin microislands in microporous annealed particle scaffolds for accelerated diabetic wound healing. Advanced Functional Materials. 31 (35), 1-12 (2021).
  17. Feng, Q., et al. Engineering the cellular mechanical microenvironment to regulate stem cell chondrogenesis: Insights from a microgel model. Acta Biomaterialia. 113, 393-406 (2020).
  18. Caldwell, A. S., Rao, V. V., Golden, A. C., Anseth, K. S. Porous bio-click microgel scaffolds control hMSC interactions and promote their secretory properties. Biomaterials. 232, 119725 (2020).
  19. Muir, V. G., Qazi, T., Shen, J., Groll, J., Burdick, J. Influence of microgel fabrication technique on granular hydrogel properties. ACS Biomaterials Science and Engineering. 7 (9), 4269-4281 (2021).
  20. Jivan, F., et al. Sequential thiol-ene and tetrazine click reactions for the polymerization and functionalization of hydrogel microparticles. Biomacromolecules. 17 (11), 3516-3523 (2016).
  21. Truong, N. F., Lesher-Pérez, S. C., Kurt, E., Segura, T. Pathways governing polyethylenimine polyplex transfection in microporous annealed particle scaffolds. Bioconjugate Chemistry. 30 (2), 476-486 (2019).
  22. Riederer, M. S., Requist, B. D., Payne, K. A., Way, J. D., Krebs, M. D. Injectable and microporous scaffold of densely-packed, growth factor-encapsulating chitosan microgels. Carbohydrate Polymers. 152, 792-801 (2016).
  23. Xin, S., Wyman, O. M., Alge, D. L. Assembly of PEG microgels into porous cell-instructive 3D scaffolds via thiol-ene click chemistry. Advanced Healthcare Materials. 7 (11), 1-7 (2018).
  24. Isaac, A., et al. Microporous bio-orthogonally annealed particle hydrogels for tissue engineering and regenerative medicine. ACS Biomaterials Science and Engineering. 5 (12), 6395-6404 (2019).
  25. Xin, S., Gregory, C. A., Alge, D. L. Interplay between degradability and integrin signaling on mesenchymal stem cell function within poly(ethylene glycol) based microporous annealed particle hydrogels. Acta Biomaterialia. 101, 227-236 (2020).
  26. Yao, M. H., et al. Directed self-assembly of polypeptide-engineered physical microgels for building porous cell-laden hydrogels. Chemical Communications. 50 (66), 9405-9408 (2014).
  27. Han, Y. L., et al. Directed self-assembly of microscale hydrogels by electrostatic interaction. Biofabrication. 5 (3), 035004 (2013).
  28. Gehlen, D. B., et al. Granular cellulose nanofibril hydrogel scaffolds for 3D cell cultivation. Macromolecular Rapid Communications. 41 (18), 2000191 (2020).
  29. Kurt, E., Segura, T. Nucleic acid delivery from granular hydrogels. Advanced Healthcare Materials. 11 (3), 2101867 (2021).
  30. Hsu, C. C., et al. Increased connectivity of hiPSC-derived neural networks in multiphase granular hydrogel scaffolds. Bioactive Materials. 9, 358-372 (2021).
  31. Feig, V. R., et al. Conducting polymer-based granular hydrogels for injectable 3D cell scaffolds. Advanced Materials Technologies. 6 (6), 2100162 (2021).
  32. Zhang, H., et al. Direct 3D printed biomimetic scaffolds based on hydrogel microparticles for cell spheroid growth. Advanced Functional Materials. 30 (13), 1-10 (2020).
  33. Sinclair, A., et al. Self-healing zwitterionic microgels as a versatile platform for malleable cell constructs and injectable therapies. Advanced Materials. 30 (39), 1803087 (2018).
  34. Kessel, B., et al. 3D bioprinting of macroporous materials based on entangled hydrogel microstrands. Advanced Science. 7 (18), 2001419 (2020).
  35. Hinton, T. J., et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels. Science Advances. 1 (9), 1500758 (2015).
  36. Koetting, M. C., Guido, J. F., Gupta, M., Zhang, A., Peppas, N. A. pH-responsive and enzymatically-responsive hydrogel microparticles for the oral delivery of therapeutic proteins: Effects of protein size, crosslinking density, and hydrogel degradation on protein delivery. Journal of Controlled Release. 221, 18-25 (2016).
  37. Heo, D. N., et al. 3D bioprinting of carbohydrazide-modified gelatin into microparticle-suspended oxidized alginate for the fabrication of complex-shaped tissue constructs. ACS Applied Materials and Interfaces. 12 (18), 20295-20306 (2020).
  38. Gramlich, W. M., Kim, I. L., Burdick, J. A. Synthesis and orthogonal photopatterning of hyaluronic acid hydrogels with thiol-norbornene chemistry. Biomaterials. 34 (38), 9803-9811 (2013).
  39. Muir, V. G., et al. Sticking together: Injectable granular hydrogels with increased functionality via dynamic covalent inter-particle crosslinking. Small. , 2201115 (2022).
  40. Qazi, T. H., Muir, V. G., Burdick, J. A. Methods to characterize granular hydrogel rheological properties, porosity, and cell invasion. ACS Biomaterials Science & Engineering. , (2022).
  41. Daly, A. C., Prendergast, M. E., Hughes, A. J., Burdick, J. A. Bioprinting for the biologist. Cell. 184 (1), 18-32 (2021).
  42. Pakhomova, C., Popov, D., Maltsev, E., Akhatov, I., Pasko, A. Software for bioprinting. International Journal of Bioprinting. 6 (3), 41-61 (2020).
  43. Junk, S., Kuen, C. Review of open source and freeware CAD systems for use with 3D-printing. Procedia CIRP. 50, 430-435 (2016).
  44. Bessler, N., et al. Nydus one syringe extruder (NOSE): A Prusa i3 3D printer conversion for bioprinting applications utilizing the FRESH-method. HardwareX. 6, 00069 (2019).
  45. Skardal, A., et al. Bioprinting cellularized constructs using a tissue-specific hydrogel bioink. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (110), e53606 (2016).
  46. Thayer, P. S., Orrhult, L. S., Martínez, H. Bioprinting of cartilage and skin tissue analogs utilizing a novel passive mixing unit technique for bioink precellularization. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e56372 (2018).
  47. Pusch, K., Hinton, T. J., Feinberg, A. W. Large volume syringe pump extruder for desktop 3D printers. HardwareX. 3, 49-61 (2018).
  48. Ding, A., et al. Jammed micro-flake hydrogel for 4D living cell bioprinting. Advanced Materials. 34 (15), 2109394 (2022).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

183

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved