שימוש בפינצטה אופטית כפולה ומיקרופלואידיקה למחקרי מולקולות בודדות

Summary

ביוכימיה חזותית של מולקולה בודדת הנחקרת באמצעות תאים מיקרופלואידיים מקלה מאוד באמצעות קנה זכוכית, מזרקים אטומים לגז, חיבורים יציבים של צינורות לתאי זרימה, וחיסול בועות על ידי הצבת שסתומי מיתוג בין המזרקים והצינורות. הפרוטוקול מתאר מלכודות אופטיות כפולות המאפשרות הדמיה של עסקאות דנ"א ואינטראקציות בין-מולקולריות.

Abstract

ביוכימיה חזותית היא טכניקה רבת עוצמה להתבוננות בתכונות הסטוכסטיות של אנזימים בודדים או קומפלקסים של אנזימים המוסתרים בממוצע המתרחש במחקרים בתפזורת. כדי להשיג הדמיה, פינצטות אופטיות כפולות, שבהן מלכודת אחת קבועה והשנייה ניידת, ממוקדות בערוץ אחד של תא מיקרופלואידי מרובה זרמים הממוקם על הבמה של מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך. הפינצטה האופטית לוכדת מולקולות בודדות של דנ"א מסומן פלואורסצנטי וזרימת נוזלים דרך החדר ומעבר לחרוזים הלכודים, מותחת את הדנ"א לצורת B (תחת כוח מינימלי, כלומר 0 pN) כאשר חומצת הגרעין נצפית כחוט לבן על רקע שחור. מולקולות דנ"א מועברות מזרם אחד למשנהו, על ידי תרגום השלב הניצב לזרימה כדי לאפשר ייזום תגובות באופן מבוקר. כדי להשיג הצלחה, התקנים microfluidic עם ערוצים ברורים אופטית מחוברים מזרקי זכוכית מוחזקים במקום משאבת מזרק. תוצאות אופטימליות משתמשות במחברים המחוברים באופן קבוע לתא הזרימה, צינורות קשיחים מכנית ועמידים כימית, ואשר מחוברים לשסתומי מיתוג המסלקים בועות האוסרות על זרימה למינרית.

Introduction

היכולת לדמיין אינטראקציות חלבון-דנ"א ברמת המולקולה הבודדת ובזמן אמת סיפקה תובנה משמעותית לגבי יציבות הגנום ^1,2. בנוסף לעבודה עם מולקולות בודדות של דנ"א בזו אחר זו, היכולת להציג עסקאות בין מולקולות בודדות בקרבת מקום מספקת תובנה נוספת ^3,4,5. המניפולציה של מולקולות דנ"א נוספות דורשת הן מלכודות אופטיות נוספות והן תאי זרימה מיקרופלואידית איכותיים, רב-ערוציים,⁶.

קיימות מספר שיטות ליצירת יותר ממלכודת אופטית אחת. אלה כוללים מראות סריקת גלוונומטר, מודולטורים אופטיים אקוסטיים ואופטיקה דיפרקטיבית, המייצרים פינצטה אופטית הולוגרפית 4,7,8,9. לעתים קרובות, מראות סורקות ומודולטורים אופטיים אקוסטיים מייצרים מלכודות המשותפות בזמן. במערך המתואר כאן, הקרן של לייזר Nd:YAG יחיד מפוצלת על קיטוב, ואז מראות סריקת לייזר גלוונומטר שולטות במיקום של מה שמכונה מלכודת ניידת (איור 1)⁴. כדי להקל על מיקום המראות והמסננים כדי לכוון את קרן הלכידה למפתח הצמצם האחורי של מטרת המיקרוסקופ, נעשה שימוש בלייזר HeNe. זה הופך את היישור הכללי לקל יותר מכיוון שקרן HeNe נראית לעין בלתי, בעוד שקרני אינפרא אדום אינן. קרן HeNe גם בטוחה יותר לעבודה עם הפיכת המיקום של מראות ורכיבים אחרים לפחות מלחיץ. בתחילה, נתיב הקרן עבור לייזר זה נפרד מן הקרן 1064 ננומטר, אבל הוא הציג לתוך אותו נתיב קרן, ולאחר מכן לתוך מטרת המיקרוסקופ. לאחר השגת יישור פיזי, נעשה מיקום קרן 1064 ננומטר על גבי קרן HeNe וזה מתאפשר על ידי שימוש בצופה אינפרא אדום ובכלי הדמיית קרן שונים כדי לדמיין את מיקום הקרן ואיכותה. לאחר מכן, מרחיב הקרן מוצג, וקרן האינפרא אדום המורחבת המתקבלת מיושרת על הפתח האחורי של המטרה. לבסוף, המטרה מוסרת והעוצמה בכל קרן מקוטבת נמדדת ומותאמת באמצעות לוחות גל λ/2 כדי להיות שווים (איור 1C). מדידות הספק נעשות גם לאחר החזרת המטרה ובדרך כלל יש אובדן הספק של 53%. עם זאת, יש מספיק כוח כדי ליצור מלכודות אופטיות קבועות ונעות יציבות במישור המוקד (איור 1D).

כדי לדמות עסקאות דנ"א, תאי זרימה מיקרופלואידיים ממלאים תפקיד מפתח כשהם מאפשרים מדידות מבוקרות ברמת המולקולה הבודדת עם רזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה (איור 2). המונח microfluidic מתייחס ליכולת לתפעל נוזלים בערוץ אחד או יותר עם ממדים הנעים בין 5-500 מיקרומטר^10,11. המונח זרם מתייחס לנוזל בפועל בתוך ערוץ והערוץ מתייחס לערוץ הפיזי שבו זרם זורם או זרמים נעים. לתכנון תא זרימה חד-ערוצי יש ערוץ פיזיקלי משותף שבו נצפות תגובות, ובדרך כלל קיים רק זרם נוזל אחד. לפיכך, עיצובים אלה ידועים כתאי זרימה חד-זרמיים. לעומת זאת, תאי זרימה מרובי זרמים מוגדרים כמכשיר מיקרופלואידי שבו שני ערוצי כניסה או יותר מתכנסים לערוץ פיזיקלי יחיד ומשותף (איור 2A). בתוך הערוץ המשותף, הזרמים הזורמים שמקורם בערוצים הבודדים זורמים במקביל זה לזה, ונותרים מופרדים כאשר הערבוב המינימלי ביניהם מתרחש רק כתוצאה מדיפוזיה (איור 2B). ברוב המערכות הניסיוניות, משאבה אחת דוחפת נוזלים לכל ערוץ באותה מהירות. לעומת זאת, כאשר נעשה שימוש בהיגוי גבול, שלוש משאבות או יותר, הנשלטות באופן עצמאי, דוחפות נוזלים דרך התעלות. עם זאת, כל משאבה פועלת במהירות שונה אך קצב הזרימה נטו בערוץ המשותף הוא^{קבוע 12}. זה מאפשר החלפה מהירה של רכיבי הערוץ הראשי פשוט על ידי שינוי מהירות המשאבה.

בנוסף לזרימה הלמינרית, גורם קריטי נוסף הוא פרופיל המהירות הפרבולית בתוך זרם הנוזל הלמינרי. מהירות הזרימה הגבוהה ביותר מתרחשת באמצע הנחל, והאיטית ביותר מתרחשת ליד המשטחים (איור 2C)¹³. יש לשקול פרופיל זה כדי למתוח באופן מלא מולקולת דנ"א המחוברת לחרוז המוחזק בזרם לצורך הדמיה מדויקת של דנ"א פלואורסצנטי וניתוחים מדויקים של מולקולה בודדת. כאן, הדנ"א נמתח לצורת B ומוחזק במקומו תחת 0 pN של כוח. כדי להשיג זאת, המיקוד של מיקום ההשמנה האופטית צריך להיות במיקום של 10-20 מיקרומטר ממשטח הכיסוי התחתון (איור 2D). יש להקפיד על כך שמולקולת הדנ"א לא תימתח מעבר לצורת B, שכן הדבר עלול לעכב תגובות אנזימיות. בתנאי חיץ טיפוסיים, 1 מיקרומטר = 3,000 bp של DNA¹⁴. יתר על כן, על ידי לכידת 10-20 מיקרומטר מהכיסוי, קומפלקס הדנ"א ממוקם הרחק מפני השטח ובכך ממזער את האינטראקציות על פני השטח.

שיטות רבות שימשו ליצירת ערוצי התקנים מיקרופלואידיים וניתן לעשות זאת במעבדה או לרכוש תאי זרימה ממקורות מסחריים 6,15,16,17. החומרים האופטימליים המשמשים לבניית תאי הזרימה חייבים להיות קשיחים מכנית, שקופים אופטית עם פלואורסצנטיות נמוכה, ואטומים לממיסים אורגניים⁶. לעתים קרובות, זכוכית צפה בורוסיליקט, או סיליקה מתמזגת משמשים כדי לספק סביבת זרימה יציבה לזמן ממושך המתאימה להשמנה אופטית, הדמיה וזיהוי כוח. חומרים אלה מאפשרים גם שימוש בממיסים לא מימיים (למשל, מתנול בדרגה ספקטרופוטומטרית) כדי לפשט את ההרטבה וההסרה של בועות אוויר, ודנטורנטים (למשל, 6M guanidinium hydrochloride) או דטרגנטים לניקוי תא הזרימה. לבסוף, השיטות המשמשות להחדרת נוזלים לתאי זרימה משתנות ממערכות משאבות ואקום מורכבות למשאבות מזרק יחיד 14,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27^. בגישה המתוארת כאן, נעשה שימוש במשאבת מזרק שיכולה להכיל עד 10 מזרקים (איור 3A). הדבר מספק גמישות לשימוש בתאי זרימה חד-ערוציים או בתאי זרימה עם ערוצי כניסה מרובים. כאן נעשה שימוש בתא זרימה בעל שלושה ערוצים, והוא מחובר למזרקים המוחזקים במקומם על משאבת המזרק באמצעות צינורות פולי-אתר-אתר-קטון (PEEK) (איור 3A-C). זרימת הנוזלים נשלטת על-ידי שסתומי מיתוג בעלי ארבעה כיוונים, ולכן היא משמשת למזעור החדרת בועות לתא הזרימה (איור 3A,D). בנוסף, מזרקי המילטון בעלי דפנות זכוכית נוקשות ובוכנות מצופות פוליטטרה-פלואורואתילן (PTFE), מומלצים מכיוון שהם מספקים תנועת בוכנה חלקה במיוחד החיונית להשגת זרימה חלקה^14,27.

במערכת הניסוי המתוארת נעשה שימוש בתאי זרימה עם שניים עד חמישה ערוצי כניסה. מספר ערוצי הכניסה מוכתב על ידי הניסוי שנעשה. לצורך המחקר של RecBCD ו- Hop2-Mnd1, שני ערוצי זרם היו^{מספיקים 14,28}. עבור ההליקאז, האנזים נקשר לקצה החופשי של הדנ"א ותורגם לזרם המכיל מגנזיום ו-ATP כדי ליזום טרנסלוקציה ושחרור. עבור Hop2-Mnd1, דנ"א לכוד אופטית תורגם לזרם הנוזלים הסמוך המכיל חלבונים וחיץ ± יוני מתכת דיוולנטיים. השימוש בתאי זרימה תלת-ערוציים מאפשר ללכוד דנ"א בזרם 1, לתרגם את הדנ"א לזרם 2 כדי לאפשר קשירת חלבונים, ולאחר מכן להזרים 3 היכן ש-ATP נמצא, למשל, כדי ליזום תגובות. וריאציה על האמור לעיל היא להשתמש בחלבון מתויג פלואורסצנטי בערוץ 2, מה שגורם לזרם הנוזלים להיות לבן לחלוטין ומונע הדמיה של הדנ"א. כאשר מולקולה זו מתורגמת לזרם 3, גם חלבונים וגם דנ"א נראים כעת כאשר מתחילות תגובות.

השימוש בשסתומי מיתוג בעלי ארבעה כיוונים לשליטה בזרימת הנוזלים הוא מרכיב קריטי במערכת לסילוק בועות בתאי הזרימה. בועות מזיקות לזרימת נוזלים יציבה כאשר הן מתכווצות ומתרחבות בדרכים בלתי צפויות וכתוצאה מכך שינויים מהירים במהירות הזרימה והכנסת מערבולות. כאשר השסתומים ממוקמים בין מזרקים וצינורות כניסה, נתיב הזרימה מנותק על ידי החלפת מיקום השסתום כאשר מזרקים מוחלפים. כאשר מזרק חדש הוא הניח במקום, הבוכנה יכולה להיות מדוכאת באופן ידני כך >6 μL נפלט (נפח מת של השסתום) וזה מבטל בועות כמעט לחלוטין.

החיבור של מחברים לתאי זרימה הוא לעתים קרובות השלב המגביל את הקצב בשימוש בתאי זרימה. אנו מתארים את השימוש בשני סוגים של מחברים: נשלפים המכונים התאמה לעיתונות וקבועים (מכללי ננו-פורט). המחברים הנשלפים פשוטים להיצמד לתא זרימה וניתן לבדוק סוגים שונים של צינורות גמישים בנוסף ל- PTFE המומלץ עם מחברים אלה. זוהי דרך מהירה וחסכונית לבדוק צינורות ומחברים מבלי להקריב תאי זרימת זכוכית יקרים יותר. לעומת זאת, מכלולי ננו-פורט מחוברים באופן קבוע, עומדים בלחצים של עד 1,000 psi, ובידינו השימוש בהם מוגבל לצינורות PEEK בקטרים שונים. זה לא חיסרון שכן עדיף להשתמש בצינורות PEEK. תא זרימת זכוכית יחיד עם מכלולים קבועים מחוברים ניתן לעשות שימוש חוזר במשך יותר משנה עם שימוש זהיר.

Protocol

1. יישור מלכודת לייזר ובדיקה עם חרוזי פוליסטירן

הערה: עבור ההתקנה, עיין באיור 1A,B.

התראה: על הנסיין להרכיב משקפי מגן מתאימים או משקפי בטיחות לייזר במהלך יישור קרן לייזר. מכיוון שמערכת הפינצטה האופטית המתוארת כאן משתמשת הן באלומות HeNe והן באלומות IR, נדרשים שני סטים נפרדים של כלי זכוכית בטיחותיים ללייזר.

1. יישור קרן HeNe
   1. מקם את כל הרכיבים האופטיים על לוח הלחם. יישרו את לוח הלחם כך שיהיה קרוב ככל האפשר לזווית של 90° ביחס למיקרוסקופ.
   2. חברו את צינור ההזדווגות המכיל את המטרה ואת עדשת הטלאן למיקרוסקופ (איור 1A-11,12).
      הערה: עדשת הטלאן היא מערכת עדשות המשמשת למיקוד התמונה במישור התמונה הבינוני בעיניות.
   3. הפעל את לייזר HeNe ופתח את התריס (איור 1A-18). הקרן צריכה לפגוע במסנן (איור 1A-3) בגובה של 54 מ"מ המשקף 50% מהאור על מראה 5 (איור 1A-5). 50% הנותרים של הקרן פוגעים במראה 4 (איור 1A-4) באותו גובה כמו מראה 3.
   4. התאימו את המראה 4 (איור 1A-4) כך שהקרן תפגע במראה 6 (איור 1A-6) בגובה של 51 מ"מ.
   5. כוונן את המראה 6 (איור 1A-6) כך שהקרן תופנה למראה הגלוונית התחתונה בגובה של 51 מ"מ. הקורה היוצאת מהמראה הגלוונית העליונה תהיה בגודל 57.5 מ"מ.
   6. התאימו את המראה 3 (איור 1A-3) כך שקרן זו תפגע במראה 5 (איור 1A-5) בגובה של 57.5 מ"מ. לאחר שהיא משתקפת ממראה 5, הקרן צריכה להכות במראה 9 (איור 1A-9) באותו גובה. הקרן מתמזגת למעשה במראה 9, עוברת דרך המטרה, ומערכת עדשות טלאן אל מראה 21 (איור 1A-21), אשר משקפת אותה לתוך המטרה.
   7. הניחו שקופית מיקרוסקופ נקייה על במת המיקרוסקופ. הפעל את המצלמה וצלם את הקורות של הקורות הקבועות והסורקות בנפרד על המסך. החל ממראה 3, לאחר מכן 5 ו -9, ולבסוף 21, בצע התאמות קטנות כדי למקם את הקרן הקבועה במרכז המסך.
   8. כדי להבטיח שזווית היציאה מקרן 21 תהיה 90°, שנה את גובה Z של המיקרוסקופ ומקם את הקרן המצולמת על המשטחים העליונים והתחתונים של המגלשה. כאשר הם זהים, הקרן נמצאת במיקום הנכון, אשר בניצב לבמה. צמצם קרן זו באמצעות תריס 19 (איור 1A-19).
   9. החל ממראות 4 ו-6, בצעו התאמות קטנות כדי למקם את הקורה הקבועה במרכז המסך. תריס את הקורה הזו.
2. יישור קרן אינפרא אדום (IR)
   התראה: בצע את כל השלבים בעוצמת לייזר נמוכה מטעמי בטיחות.
   1. התאם את לוח הגלים 14 (איור 1A-14) כדי להתאים את היחס בין האלומות המועברות והמשתקפות המפוצלות במפצל הקרן 2 (איור 1A-2). מפצל קרן 2 משקף את רכיב ה-s של קרן הלייזר ומעביר את רכיב ה-p.
   2. הקרן שעוברת דרך 2 פוגעת במראה 7 (איור 1A-7), מה שמסיט את הקרן אל המראה הגלוונית התחתונה. זה צריך ללכת בדרך של קרן HeNe אל מראה 21. בצע תנועות קטנות של מראה 7 כדי להשיג מיקום זה.
   3. כוונן את מראה 2 כך שהקרן המשתקפת על-ידי מראה 2, תפגע במראה 10 (איור 1A-10) בגובה של 57.5 מ"מ.
   4. הקרן משתקפת ממראה 10 אל מראה 8 (איור 1A-8) בגובה של 57.5 מ"מ. הקורה הבאה צריכה להכות במראה 9 באותו גובה. אם לא, בצע התאמות קטנות למראות 10 ו- 8 כנדרש.
   5. הסר את המטרה והנח את ראש מד הכוח מעל היציאה בצריח המטרה.
   6. השתמשו בלוחות 14, 15 ו-16 (איור 1A-14,15,16) כדי להתאים את העוצמה של כל קרן לייזר כך שתהיה שווה כפי שמוצג באיור 1C.
   7. שים את מרחיב הקרן 1 (איור 1A-1) במקומו. התאם את קרן הלייזר המורחבת כך שתהיה מעגלית ללא כל תרדמת או אסטיגמציה.
   8. כדי לבדוק את המלכודות האופטיות, צור פתרון של חרוזי פוליסטירן 1 מיקרומטר התלויים במים. לאחר מכן, הניחו 10 מיקרוליטר של תמיסה זו על שקופית מיקרוסקופ, הניחו כיסוי על גביו ואטמו עם לק. הנח את השקופית על במת המיקרוסקופ ובדוק את המלכודות האופטיות על ידי לכידת חרוזים אלה של 1 מיקרומטר. ודא כי החרוזים נשאבים לתוך המלכודות ומוחזקים ביציבות כאשר הבמה מועברת. ההשמנה צריכה להתרחש ביעילות שווה מכל צידי המלכודת.

2. הכנת תא מיקרופלואידי

1. אם תא הזרימה הוא התקן שנבנה באופן מסחרי העשוי מפולידימתילסילוקסן (PDMS) על גבי כיסוי, המשך לשלב 3. אם זהו התקן זכוכית עם מחברים מחוברים, המשך לשלב 4.
2. אם לתא הזרימה אין מחברים מחוברים, חברו אותם תחילה לחורי הכניסה בשקופית המיקרוסקופ. עיין בשלב 3 לקבלת השלבים לחיבור מחברים.

3. חיבורי תאי זרימה באמצעות תא זרימה PDMS

הערה: עבור ההתקנה, עיין באיור 2D.

1. הנח את תא הזרימה על משטח שטוח ונקי. החזק את צינורות ה- PTFE 3 מ"מ מהקצה החופשי עם מלקחיים. דחפו את הצינורות לתוך היציאה המוכנה מראש (היציאה יכולה לתמוך בלחץ של 2 קווי בר).
2. חזור על הליך זה עבור כל אחת מהיציאות הנותרות. חברו את יציאות הכניסה למשאבת המזרק ולשקע לבקבוק פסולת (איור 4A,B).
3. מלאו כל מזרק זכוכית ב-1 מ"ל של מתנול בדרגה ספקטרופוטומטרית. חבר כל מזרק לשסתום מיתוג. ודא שהשסתום מכוון לשקע לפסולת וטהר כל קו עם 50 μL של מתנול (איור 4C, מיקום סגור).
4. העבר את מיקום היציאה לתא הזרימה (איור 4C, מיקום פתוח). יש לשאוב 800 μL של מתנול דרך תא הזרימה בקצב זרימה של 100 μL/h כדי להרטיב את המשטחים ולסלק בועות.
5. למחרת, חזור על תהליך זה באמצעות 800 μL של מים אולטרה-טהורים. תא הזרימה מוכן כעת לשימוש.

4. חיבור של מחברי צינורות מתאימים לעיתונות

הערה: עבור ההתקנה, עיין באיור 2F.

1. אם יש להשתמש במחברי צינורות המתאימים ללחיצה, הסר בזהירות את סרט ההדבקה מצד אחד של המחבר והנח אותו מעל החור בשקופית המיקרוסקופ. לחץ כלפי מטה למשך מספר שניות. חזור על התהליך עבור המחברים הנותרים.
2. הנח את תא הזרימה על משטח שטוח ונקי. החזק את צינורות ה- PTFE 3 מ"מ מהקצה החופשי עם מלקחיים. דחפו את הצינורות לתוך החור המוכן מראש ביציאה וחזרו על הליך זה עבור כל אחת מהיציאות הנותרות.
3. חברו צינורות מהכניסות לשסתומי המיתוג. המשך לשלב 7.

5. צירוף מכלולים קבועים

הערה: עבור ההתקנה, עיין באיור 2A-C.

1. בצע את החיבור על משטח נקי ושטוח או על סעפת שנבנתה בהתאמה אישית כדי להחזיק את תא הזרימה והמחברים במקומם בזמן ההדבקה.
2. הניחו את תא הזרימה על משטח שטוח ונקי או בחלק השקוע של הסעפת (איור 2B). מניחים כמות קטנה של דבק זכוכית בתחתית המכלול ומכניסים את האטם.
3. מקם את הננו-יציאה מעל אחד מחורי הכניסה בשקופית המיקרוסקופ. יש לדחוף בעדינות כלפי מטה ולהחזיק במקומם ללא תזוזה לרוחב. חזור על התהליך עבור היציאות הנותרות.
4. אפשר להתייבש או להדק במקומו בסעפת. הסר בעדינות את תא הזרימה מהסעפת וודא שהמכלולים מתיישרים היטב עם יציאות הכניסה בתא הזרימה. המשך לשלב 7 כשתהיה מוכן.

6. חיבורי תאי זרימה והכנה

הערה: עבור ההתקנה, עיין באיור 4A,B.

1. מניחים תא זרימה על במת המיקרוסקופ. חבר את הצינורות באמצעות המחברים ההדוקים לאצבעות.
2. מלאו כל מזרק זכוכית ב-1 מ"ל של מתנול בדרגה ספקטרופוטומטרית. חבר כל מזרק לשסתום מיתוג. ודא שהשסתום מכוון לשקע לפסולת וטהר כל קו עם 50 μL של מתנול (איור 4C, מיקום סגור).
3. העבר את מיקום היציאה לתא הזרימה (איור 4C, מיקום פתוח). יש לשאוב 800 μL של מתנול דרך תא הזרימה בקצב זרימה של 100 μL/h כדי להרטיב את המשטחים ולסלק בועות.
4. למחרת, חזור על תהליך זה באמצעות 800 μL של מים אולטרה-טהורים. תא הזרימה מוכן כעת לשימוש.

7. שליטה על זרימת הנוזלים

1. סובבו את שסתומי המיתוג למצב סגור (איור 4C). הסר את המזרקים, להשליך את המים שיורית, ולמלא את המזרקים עם פתרונות ניסיוניים, למשל, חרוזי DNA; אנזים; ו-ATP. החזירו מזרקים למשאבה וחברו אותם לשסתומי המיתוג.
2. במצב זה, כפו ידנית את הבוכנות כלפי מטה 5-10 μL כדי להסיר בועות. שנה את מיקום שסתום המיתוג לפתיחה.
3. השתמש בסכמת קצב הזרימה כדי להשיג מהירות זרימה זורמת אופטימלית להשמנה ולתצוגה חזותית כמתואר בטבלה 1. זרימת הנוזל האופטימלית להשמנה אופטית אמורה לאפשר לכידה יציבה של חרוזים וברגע שהדנ"א נמתח, הוא צריך להיות בצורת B (~3,000 bp/μm).

8. לכידת חרוזי פוליסטירן עם מולקולות DNA בודדות מחוברות

1. בהגדלה של 10x, אתר את הגבול בין זרמי נוזלים קרוב לנקודות הכניסה של הערוץ. הוסיפו שמן ליעד 100x ועברו להגדלה הגבוהה יותר.
2. פתח את התריסים להשמנות האופטיות (שתיהן או אחת בכל פעם). קרני הלייזר הממוקדות צריכות ללכוד חרוזים והדנ"א צריך להימתח מיד.
3. לאחר לכידת קומפלקס, תרגם את השלב הניצב לזרימה (איור 3A,C, inset). פעולה זו תעביר את הקומפלקס הלכוד מתמיסת חרוזי הדנ"א, לזרם 2. תרגום נוסף יעביר את המתחם לזרם 3.

9. ניקוי תאי זרימה

הערה: יש לבצע זאת מדי יום.

1. כבו את המשאבה בסיום הניסוי. סובבו את שסתומי המיתוג למצב סגור (איור 4C).
2. מוציאים מזרקים ומרוקנים אותם. יש לשטוף שלוש פעמים במים מזוקקים מסוננים.
3. ממלאים את המזרקים בתמיסת ניקוי. מניחים מזרקים במשאבה ומתחברים לשסתומי מיתוג.
4. נקה שסתומי מיתוג ושנה את המיקום לפתיחה. יש לשאוב תמיסת ניקוי 800 μL בקצב זרימה של 100 μL/h בדרך כלל במהלך הלילה.
5. למחרת, סגור את שסתומי המיתוג, ולאחר מכן להסיר ולשטוף מזרקים עם מים. יש לשטוף את תא הזרימה והקווים עם 4-800 μL של מים בקצב זרימה של 400-800 μL/h. אם נדרש ניקוי מאומץ יותר של תאי זרימה, החלף את תמיסת הניקוי עם 6 M גואנידיום הידרוכלוריד.

תוצאות

הבדיקה הראשונית של יישור וחוזק המלכודת נעשית עם 1 μm, חרוזי פוליסטירן שאינם פלואורסצנטיים. מאחר שרוב המחקר שנעשה במעבדה משתמש בפלואורסצנציה, אנו בודקים עוד יותר את חוזק המלכודת באמצעות 1 מיקרומטר, חרוזי פוליסטירן ירוק דרקון (איור 1D,E). לאחר מכן העבודה משתנה להשמנה א?...

Discussion

הרכבה זהירה של מערכת הזרימה היא קריטית לתוצאה המוצלחת של ניסויים ^4,6. אחד ההיבטים המאתגרים ביותר של הפרוטוקול הוא חיבור המחברים למשטח הזכוכית. לשם כך, אנו משתמשים בשתי הגישות הבאות: מחברי צינורות בהתאמה לעיתונות ומכללי ננו-יציאות. מחברים המתאימים ללחיצה נצמ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100x objective	Leica	506318 or 506038	Oil immersion lenses; Imaging and optical trapping only; Plan APO objectives optimized for fluorescence imaging
10X Objective	Leica	506263	Used to locate laser beams spots during alignment; to find focus and X-Y position in flow cell
1 mm fluorescent beads	Bangs Labs	FSDG004	Used for tap performance, focal position determination
1 mm polystyrene beads	Bangs Labs	CPO1004	Used for trap performance evaluation and binding to biotinylated molecules
63x objective	Leica	506081	Used to locate laser beams spots during alignment and to find focus and X-y position in flow cell; can be used for optical trapping as it has an identical back aperture diameter to the 100X; oil immersion lens
Alignment laser	Lumentum	1100 series	10mW HeNe laser that is visible to the naked eye that is used to position optics
Beam alignment camera	Amscope	MU303	A simple, inexpensive and software controlled camera for imaging of the beam position
Camera control and Image capture software	Hamamatsu	HCImage	Coordinates activities of the Lambda DG4 with the camera to facilitate rapid wavelength switching
Camera; Orca flash 4	Hamamatsu	c13440-20cu	CCD camera for imaging of single-molecule experiments
C-mount for the beam alignment camera	Spot imaging solutions	DE50CMT	Provides optimal positioning of the camera for imaging of laser beams during alignment
C-mount for the Orca Flash 4 camera			Has a retainer ring to hold an IR blocking filter in place. This eliminates reflected IR beam from the optical traps and facilitates clearer imaging of trapped objects.
Cy5  fluorescence filter cube	Semrock	cy5-404a-lsc-zero	Used in conjunction with Lambda DG4 to image Cy5 only
Fitc-Txred  fluorescence filter cube	Semrock	fitc/txred-2x-b-000	Used in conjunction with Lambda DG4 to image FITC and TXRed
Fluidics tubing	Grace Bio	46004	PTFE tubing as an alternate to PEEK; works well on some flow cells. Can be used with PDMS flow cells or glass flow cells when Grace Bio fit tubing connectors are used
GFP fluorescence filter cube	Semrock	gfp-3035b-lsc-zero	Used in conjunction with Lambda DG4 to image GFP only
Glass flow cells	Translume	Custom	Clear flow channels for imaging (Fig. 2E)
Glass glue	Loctite	233841	Securely and easily bonds Nanoport assemblies to glass flow cells
Glass/PDMS sandwich flow cells	CIDRA Precision services	Custom design	Flow cells built according to your specifications; imaging channels are clear (Fig. 2C)
Hamilton Cleaning solution	Hamilton	18311	Gentle but efficient cleaning solution for glass flow cells; does not bubble when used carefully
Illumination system	Sutter Instrument	Lamda DG4	Discontinued so recommend Lambda 721
Illumination system	Sutter Instrument	Lamda DG4	Discontinued so recommend Lambda 721
Image analysis software	Media cybernetics	Image Pro Premiere	Analysis of images and single molecule tracking
Image analysis software	Fiji/NIH Image/Image J	Shareware	Analysis of images and single molecule tracking
Image display card	Melles Griot	06 DLA 001	Alternate product from Thorlabs: VRC5
Immersion oil	Zeiss	444960	Immersol 518 F fluorescence free
Laser beam alignment tools	Thor labs	FMP05/M; dgo5-1500-h1; BHM1	Used to ensure beams are horizontal and at the correct height
Laser beam viewer	Canadian Photonics labs	IR 3150	Used to image IR beam spots on mirrors and  targets
Laser power meter	Thor labs		Measurement of laser output as well as trap strength
Laser safety glasses (HeNe)	Thor labs	LG7 or 8	Blocks >3 OD units of light of wavelengths >600 nm
Laser safety glasses (IR)	Thor labs	LG11	Blocks >7 OD units of light of wavelengths ³1000 nm
Mcherry  fluorescence filter cube	Semrock	mcherry-a-lsc-zero	Used in conjunction with Lambda DG4 to image mcherry only
Microscope	Leica	DMIRE2	DIC port removed to accommodate Dichroic trapping/alignment mirror
Microscope control software	UCSF/shareware	uManager	Controls the microscope, permits focal alignment of objectives as well as stage control
Nanoport assembly	IDEX	N333	Connectors that are bonded to flow cells
Optical table support	Thor Labs	PA52502	Active isolation table support
Optics and lenses	Solar TII	Various	Interference mirrors, telescopes and lenses custom designed for the system
PDMS flow cells	ufluidix	Custom	Flow cells built according to your specifications; imaging channels are clear (Figs. 2B and D)
PEEK tubing	IDEX	1532	Provides excellent connection to flow cells and switching valves
Pinkel fluorescence filter cube	Semrock	lf488/543/635-3x-a-000	Used in conjunction with Lambda DG4 to image multiple fluorophores rapidly
Press fit tubing connectors	GraceBio	46003	Clear silicone connector with adhesive that binds well to glass
Scanning mirrors	GSI Lumonics	VM500	Used to provide control of the second optical trap. GSI Lumonics no longer exists. Similar mirrors can be purchased from Cambridge Scientific
Stage	Leica
Stage micrometer	Electron Microscopy Sciences	68042-08	Provides on screen ruler for positioning of the beam and system calibration
Switching valves	IDEX	V-101T	Control direction of fluid flow and eliminate introduction of bubbles into flow cells
Syringe and valve manifold	Machine shop	None	Custom built
Syringe pump	Harvard Apparatus	PHD 2000	Controls fluid flow through flow cells
Syringe pump software	Harvard Apparatus	70-6000	Flow control provides seamless, programmable control of fluid flow
Syringes	Hamilton	81320	Gas-tight, PTFE Luer Lock, glass barrels with Teflon-coated plungers
Table top	Thor Labs	T36H	Optical table top or breadboard
Trapping laser	Newport/Spectra Physics	J-series; BL106C	Nd:YAG laser; 1064 nm; 5W laser