Uso de pinças ópticas duplas e microfluídicas para estudos de molécula única

Resumo

A bioquímica visual de molécula única estudada através de câmaras microfluídicas é muito facilitada usando barril de vidro, seringas à prova de gás, conexões estáveis de tubos para células de fluxo e eliminação de bolhas colocando válvulas de comutação entre as seringas e a tubulação. O protocolo descreve armadilhas ópticas duplas que permitem a visualização de transações de DNA e interações intermoleculares.

Resumo

A bioquímica visual é uma técnica poderosa para observar as propriedades estocásticas de enzimas individuais ou complexos enzimáticos que são obscurecidos na média que ocorre em estudos de fase a granel. Para alcançar a visualização, pinças ópticas duplas, onde uma armadilha é fixada e a outra é móvel, são focadas em um canal de uma câmara microfluídica multifluxo posicionada no estágio de um microscópio de fluorescência invertida. As pinças ópticas aprisionam moléculas únicas de DNA marcado fluorescentemente e fluem através da câmara e passam pelas contas aprisionadas, esticam o DNA para a forma B (sob força mínima, ou seja, 0 pN) com o ácido nucleico sendo observado como uma corda branca contra um fundo preto. As moléculas de DNA são movidas de um fluxo para o outro, traduzindo o estágio perpendicular ao fluxo para permitir o início das reações de maneira controlada. Para alcançar o sucesso, os dispositivos microfluídicos com canais opticamente claros são acoplados a seringas de vidro mantidas no lugar em uma bomba de seringa. Os melhores resultados usam conectores permanentemente ligados à célula de fluxo, tubulação que é mecanicamente rígida e quimicamente resistente, e que é conectada a válvulas de comutação que eliminam bolhas que proíbem o fluxo laminar.

Introdução

A capacidade de visualizar interações proteína-DNA no nível de molécula única e em tempo real forneceu uma visão significativa da estabilidade do genoma ^1,2. Além de trabalhar com moléculas individuais de DNA, uma de cada vez, a capacidade de visualizar transações entre moléculas individuais próximas fornece informações adicionais ^3,4,5. A manipulação de moléculas adicionais de DNA requer armadilhas ópticas adicionais, bem como células de fluxo microfluídico multicanal de alta qualidade⁶.

Existem vários métodos disponíveis para gerar mais de um trap óptico. Estes incluem espelhos de varredura de galvanômetros, moduladores ópticos acústicos e óptica difrativa, que geram pinças ópticas holográficas 4,7,8,9. Muitas vezes, espelhos de varredura e moduladores ópticos acústicos produzem armadilhas que compartilham o tempo. Na configuração descrita aqui, o feixe de um único laser Nd:YAG é dividido na polarização e, em seguida, os espelhos de varredura a laser galvanômetro controlam a posição do que é chamado de armadilha móvel (Figura 1)⁴. Para facilitar o posicionamento de espelhos e filtros para direcionar o feixe de retenção para a abertura traseira da objetiva do microscópio, um laser HeNe é usado. Isso facilita o alinhamento geral, pois o feixe HeNe é visível a olho nu, enquanto os feixes infravermelhos não são. O feixe HeNe também é mais seguro de trabalhar, tornando o posicionamento de espelhos e outros componentes menos estressante. Inicialmente, o caminho do feixe para este laser é separado do feixe de 1064 nm, mas é introduzido no mesmo caminho do feixe e, em seguida, na objetiva do microscópio. Uma vez que o alinhamento físico é alcançado, o posicionamento do feixe de 1064 nm no topo do feixe HeNe é feito e isso é facilitado pelo uso de um visualizador infravermelho e várias ferramentas de imagem do feixe para visualizar a posição e a qualidade do feixe. Em seguida, o expansor de feixe é introduzido e o feixe infravermelho expandido resultante é alinhado na abertura traseira do objetivo. Finalmente, a objetiva é removida e a potência em cada feixe polarizado é medida e ajustada usando placas de onda λ/2 para ser igual (Figura 1C). As medições de energia também são feitas uma vez que o objetivo é retornado e, normalmente, há uma perda de energia de 53%. Há, no entanto, energia suficiente para formar armadilhas ópticas fixas e móveis estáveis no plano focal (Figura 1D).

Para as transações de DNA de imagem, as células de fluxo microfluídico desempenham um papel fundamental, pois permitem medições controladas no nível de molécula única com alta resolução espacial e temporal (Figura 2). O termo microfluídico refere-se à capacidade de manipular fluidos em um ou mais canais com dimensões que variam de 5 a 500 μm^10,11. O termo fluxo refere-se ao fluido real dentro de um canal e o canal refere-se ao canal físico no qual um fluxo ou fluxos de fluido se movem. O design de células de fluxo de canal único tem um canal físico comum onde as reações são observadas e normalmente há apenas um fluxo de fluido presente. Assim, esses projetos são conhecidos como células de fluxo único. Em contraste, as células de fluxo multifluxo são definidas como um dispositivo microfluídico no qual dois ou mais canais de entrada convergem em um único canal físico comum (Figura 2A). Dentro do canal comum, os fluxos de fluido que se originam dos canais individuais fluem paralelamente uns aos outros e permanecem separados com apenas uma mistura mínima entre eles ocorrendo devido à difusão (Figura 2B). Na maioria das configurações experimentais, uma única bomba empurra fluidos para cada canal na mesma velocidade. Em contraste, quando a direção de limite é usada, três ou mais bombas controladas independentemente empurram fluidos através dos canais. No entanto, cada bomba opera a uma velocidade diferente, mas a taxa de fluxo líquido no canal comum é constante¹². Isso permite a troca rápida de componentes do canal principal simplesmente alterando a velocidade da bomba.

Além do fluxo laminar, outro fator crítico é o perfil de velocidade parabólica dentro do fluxo de fluido laminar. A maior velocidade de escoamento ocorre no meio do fluxo e a mais lenta ocorre junto às superfícies (Figura 2C)¹³. Este perfil deve ser considerado para esticar completamente uma molécula de DNA que está ligada a uma conta mantida no fluxo para visualização precisa do DNA fluorescente e análises precisas de molécula única. Aqui, o DNA é esticado para a forma B e é mantido no lugar sob 0 pN de força. Para conseguir isso, o foco da posição do purgador óptico deve estar a uma posição de 10-20 μm da superfície inferior da tampa (Figura 2D). Deve-se tomar cuidado para que a molécula de DNA não seja esticada além da forma B, pois isso pode inibir as reações enzimáticas. Sob condições típicas de tampão, 1 μm = 3.000 pb de DNA¹⁴. Além disso, ao prender 10-20 μm da lâmina de cobertura, o complexo de DNA é posicionado longe da superfície, minimizando assim as interações superficiais.

Muitos métodos têm sido utilizados para criar canais de dispositivos microfluídicos e estes podem ser feitos em laboratório ou células de fluxo podem ser adquiridas de fontes comerciais 6,15,16,17. Os materiais ideais utilizados para a construção das células de fluxo devem ser mecanicamente rígidos, opticamente transparentes com baixa fluorescência e impermeáveis a solventes orgânicos⁶. Frequentemente, o vidro float de borossilicato ou a sílica fundida são usados para fornecer um ambiente de fluxo estável por um tempo prolongado que é adequado para aprisionamento óptico, visualização e detecção de força. Esses materiais também permitem o uso de solventes não aquosos (por exemplo, metanol de grau espectrofotométrico) para simplificar a umectação da superfície e a remoção de bolhas de ar e desnaturantes (por exemplo, cloridrato de guanidínio 6M) ou detergentes para limpar a célula de fluxo. Finalmente, os métodos utilizados para introduzir fluidos em células de fluxo variam de sistemas complexos de bomba de vácuo a bombas de seringa única 14,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. Na abordagem descrita aqui, é utilizada uma bomba de seringa que pode acomodar até 10 seringas (Figura 3A). Isso fornece flexibilidade para usar células de fluxo de canal único ou células de fluxo com vários canais de entrada. Aqui, uma célula de fluxo de três canais é usada e é acoplada a seringas mantidas no lugar na bomba da seringa usando tubos de poli-éter-éter-cetona (PEEK) (Figura 3A-C). O fluxo de fluidos é controlado por válvulas de comutação de quatro vias e, assim, servem para minimizar a introdução de bolhas na célula de fluxo (Figura 3A,D). Além disso, seringas à prova de gás Hamilton, que possuem paredes de vidro rígidas e êmbolos revestidos com politetrafluoroetileno (PTFE), são recomendadas, pois proporcionam um movimento de êmbolo excepcionalmente suave, essencial para a obtenção de um fluxo suave^14,27.

No sistema experimental descrito, foram utilizadas células de fluxo com dois a cinco canais de entrada. O número de canais de entrada é ditado pelo experimento que está sendo feito. Para o estudo de RecBCD e Hop2-Mnd1, dois canais de fluxo foram suficientes^14,28. Para a helicase, a enzima foi ligada à extremidade livre do DNA e traduzida em um fluxo contendo magnésio e ATP para iniciar a translocação e o desenrolar. Para Hop2-Mnd1, o DNA opticamente aprisionado foi traduzido para a corrente fluida adjacente contendo proteínas e tampão ± íons metálicos divalentes. O uso de células de fluxo de três canais permite prender o DNA no fluxo 1, traduzir o DNA no fluxo 2 para permitir que a ligação às proteínas ocorra e, em seguida, transmitir o fluxo 3 onde o ATP está presente, por exemplo, para iniciar reações. Uma variação do acima é usar proteína marcada com fluorescente no canal 2, o que resulta no fluxo de fluido sendo completamente branco e impede a visualização do DNA. Quando esta molécula é traduzida em fluxo 3, tanto as proteínas quanto o DNA são agora visíveis quando as reações são iniciadas.

O uso de válvulas de comutação de quatro vias para controlar o fluxo de fluido é um componente crítico do sistema para eliminar bolhas nas células de fluxo. As bolhas são prejudiciais ao fluxo estável de fluidos à medida que se contraem e se expandem de maneiras imprevisíveis, resultando em mudanças rápidas na velocidade do fluxo e na introdução de turbulência. Quando as válvulas são posicionadas entre as seringas e a tubulação de entrada, o caminho do fluxo é desconectado alternando a posição da válvula quando as seringas são trocadas. Quando a nova seringa é colocada no lugar, o êmbolo pode ser pressionado manualmente para que >6 μL seja ejetado (o volume morto da válvula) e isso elimina as bolhas quase inteiramente.

A fixação de conectores a células de fluxo é frequentemente a etapa de limitação de taxa no uso de células de fluxo. Descrevemos o uso de dois tipos de conectores: removíveis conhecidos como press-fit e permanentes (conjuntos de nanoportas). Os conectores removíveis são simples de aderir a uma célula de fluxo e diferentes tipos de tubos flexíveis, além do PTFE recomendado, podem ser testados com esses conectores. Esta é uma maneira rápida e econômica de testar tubos e conectores sem sacrificar células de fluxo de vidro mais caras. Em contraste, os conjuntos de nanoportas são fixados permanentemente, suportam pressões de até 1.000 psi e, em nossas mãos, seu uso é restrito a tubos PEEK de diferentes diâmetros. Isso não é uma desvantagem, pois a tubulação PEEK é preferencialmente usada. Uma única célula de fluxo de vidro com conjuntos permanentes anexados pode ser reutilizada por mais de 1 ano com uso cuidadoso.

Protocolo

1. Alinhamento e teste da armadilha a laser com esferas de poliestireno

NOTA: Para a configuração, consulte a Figura 1A,B.

CUIDADO: O experimentalista deve usar óculos de proteção apropriados ou óculos de segurança a laser durante o alinhamento do feixe de laser. Como o sistema de pinça óptica descrito aqui usa feixes HeNe e IR, são necessários dois conjuntos separados de vidro de segurança a laser.

1. Alinhamento do feixe HeNe
   1. Posicione todos os componentes ópticos na breadboard. Alinhe a breadboard para que ela fique o mais próximo possível de um ângulo de 90° em relação ao microscópio.
   2. Fixar o tubo de acasalamento contendo a objetiva e a lente telan ao microscópio (Figura 1A-11,12).
      NOTA: A lente telan é um sistema de lentes que é usado para focar a imagem no plano intermediário da imagem nas oculares.
   3. Ligue o laser HeNe e abra o obturador (Figura 1A-18). O feixe deve atingir o filtro (Figura 1A-3) a uma altura de 54 mm refletindo 50% da luz no espelho 5 (Figura 1A-5). Os 50% restantes do feixe atingem o espelho 4 (Figura 1A-4) na mesma altura do espelho 3.
   4. Ajuste o espelho 4 (Figura 1A-4) de modo que o feixe atinja o espelho 6 (Figura 1A-6) a uma altura de 51 mm.
   5. Ajustar o espelho 6 (Figura 1A-6) de modo a que o feixe seja direcionado para o espelho galvânico inferior a uma altura de 51 mm. O feixe que sai do espelho galvânico superior será de 57,5 mm.
   6. Ajuste o espelho 3 (Figura 1A-3) de modo que este feixe atinja o espelho 5 (Figura 1A-5) a uma altura de 57,5 mm. Uma vez refletido no espelho 5, o feixe deve atingir o espelho 9 (Figura 1A-9) na mesma altura. O feixe é efetivamente recombinado no espelho 9, passa através do objetivo e do sistema de lentes telan para o espelho 21 (Figura 1A-21), que o reflete no objetivo.
   7. Coloque uma lâmina de microscópio limpa no estágio do microscópio. Ligue a câmera e crie imagens dos feixes fixos e de digitalização individualmente na tela. Começando pelo espelho 3, depois 5 e 9, finalmente 21, realize pequenos ajustes para posicionar o feixe fixo no centro da tela.
   8. Para garantir que o ângulo do feixe que sai do espelho 21 é de 90°, altere a altura Z do microscópio e posicione o feixe fotografado nas superfícies superior e inferior da lâmina. Quando são idênticos, o feixe está na posição correta, que é perpendicular ao palco. Obture este feixe usando o obturador 19 (Figura 1A-19).
   9. Começando pelos espelhos 4 e 6, realize pequenos ajustes para posicionar o feixe fixo no centro da tela. Obture este feixe.
2. Alinhamento do feixe infravermelho (IR)
   CUIDADO: Execute todas as etapas com baixa potência do laser por razões de segurança.
   1. Ajustar a placa de onda 14 (Figura 1A-14) para ajustar a razão entre os feixes transmitidos e refletidos que estão sendo divididos no divisor de feixes 2 (Figura 1A-2). O divisor de feixe 2 reflete o componente s do feixe de laser e transmite o componente p.
   2. O feixe que passa por 2, atinge o espelho 7 (Figura 1A-7), que desvia o feixe para o espelho galvânico inferior. Deve seguir o caminho do feixe HeNe no espelho 21. Realize pequenos movimentos do espelho 7 para conseguir esse posicionamento.
   3. Ajuste o espelho 2 de modo que o feixe que é refletido pelo espelho 2 atinja o espelho 10 (Figura 1A-10) a uma altura de 57,5 mm.
   4. O feixe é refletido do espelho 10 para o espelho 8 (Figura 1A-8) a uma altura de 57,5 mm. O feixe subsequente deve atingir o espelho 9 na mesma altura. Caso contrário, faça pequenos ajustes nos espelhos 10 e 8, conforme necessário.
   5. Remova a objetiva e coloque a cabeça do medidor de energia sobre a porta na torre objetiva.
   6. Use as placas 14, 15 e 16 (Figura 1A-14,15,16) para ajustar a potência de cada feixe de laser de modo que eles sejam iguais, como mostrado na Figura 1C.
   7. Coloque o expansor de feixe 1 (Figura 1A-1) no lugar. Ajuste o feixe de laser expandido para ser circular sem qualquer coma ou astigmatismo.
   8. Para testar as armadilhas ópticas, faça uma solução de 1 μm de esferas de poliestireno suspensas em água. Em seguida, coloque 10 μL desta solução em uma lâmina de microscópio, coloque uma tampa por cima e sele com esmalte. Coloque a lâmina no estágio do microscópio e teste as armadilhas ópticas prendendo essas contas de 1 μm. Certifique-se de que as contas sejam sugadas para as armadilhas e mantidas de forma estável quando o palco for movido. O aprisionamento deve ocorrer de forma igualmente eficiente de todos os lados da armadilha.

2. Preparação da câmara microfluídica

1. Se a célula de fluxo for um dispositivo construído comercialmente feito de polidimetilsiloxano (PDMS) em uma folha de cobertura, prossiga para a etapa 3. Se for um dispositivo de vidro com conectores conectados, prossiga para a etapa 4.
2. Se a célula de fluxo não tiver conectores conectados, ligue-os aos orifícios de entrada na lâmina do microscópio primeiro. Consulte a etapa 3 para obter as etapas para conectar conectores.

3. Conexões de célula de fluxo usando uma célula de fluxo PDMS

NOTA: Para a configuração, consulte a Figura 2D.

1. Coloque a célula de fluxo em uma superfície plana limpa. Segure a tubulação de PTFE a 3 mm da extremidade livre com pinças. Empurre a tubulação para a porta pré-formada (a porta pode suportar pressão de linha de 2 bares).
2. Repita este procedimento para cada uma das portas restantes. Conecte as portas de entrada à bomba da seringa e a saída a um frasco de resíduos (Figura 4A,B).
3. Encha cada seringa de vidro com 1 ml de metanol de grau espectrofotométrico. Ligue cada seringa a uma válvula de comutação. Certifique-se de que a válvula tenha a saída direcionada para o desperdício e purge cada linha com 50 μL de metanol (Figura 4C, posição fechada).
4. Alterne a posição de saída para a célula de fluxo (Figura 4C, posição aberta). Bombear 800 μL de metanol através da célula de fluxo a uma taxa de fluxo de 100 μL / h para molhar as superfícies e eliminar bolhas.
5. No dia seguinte, repita este processo usando 800 μL de água ultrapura. A célula de fluxo agora está pronta para uso.

4. Fixação dos conectores de tubulação do press fit

NOTA: Para a instalação, consulte a Figura 2F.

1. Se os conectores de tubulação press-fit forem usados, remova cuidadosamente a fita adesiva de um lado do conector e coloque-a sobre o orifício na lâmina do microscópio. Pressione para baixo por alguns segundos. Repita o processo para os conectores restantes.
2. Coloque a célula de fluxo em uma superfície plana limpa. Segure a tubulação de PTFE a 3 mm da extremidade livre com pinças. Empurre a tubulação para o orifício pré-formado na porta e repita este procedimento para cada uma das portas restantes.
3. Fixe a tubulação das entradas às válvulas de comutação. Prossiga para a etapa 7.

5. Anexação de assembleias permanentes

NOTA: Para a configuração, consulte a Figura 2A-C.

1. Execute a fixação em uma superfície limpa e plana ou em um coletor personalizado para manter a célula de fluxo e os conectores no lugar enquanto a ligação ocorre.
2. Colocar a célula de fluxo sobre uma superfície plana limpa ou na secção embutida do colector (figura 2B). Coloque uma pequena quantidade de cola de vidro na parte inferior do conjunto e insira o selo.
3. Posicione a nanoporta sobre um dos orifícios de entrada na lâmina do microscópio. Empurre suavemente para baixo e segure no lugar sem movimento lateral. Repita o processo para as portas restantes.
4. Deixe secar ou prender no lugar no coletor. Remova cuidadosamente a célula de fluxo do coletor e certifique-se de que os conjuntos se alinhem bem com as portas de entrada na célula de fluxo. Prossiga para a etapa 7 quando estiver pronto.

6. Conexões e preparação da célula de fluxo

NOTA: Para a configuração, consulte a Figura 4A,B.

1. Coloque uma célula de fluxo no estágio do microscópio. Conecte a tubulação usando os conectores à prova dos dedos.
2. Encha cada seringa de vidro com 1 ml de metanol de grau espectrofotométrico. Ligue cada seringa a uma válvula de comutação. Certifique-se de que a válvula tenha a saída direcionada para o desperdício e purge cada linha com 50 μL de metanol (Figura 4C, posição fechada).
3. Alterne a posição de saída para a célula de fluxo (Figura 4C, posição aberta). Bombear 800 μL de metanol através da célula de fluxo a uma taxa de fluxo de 100 μL / h para molhar as superfícies e eliminar bolhas.
4. No dia seguinte, repita este processo usando 800 μL de água ultrapura. A célula de fluxo agora está pronta para uso.

7. Controle do fluxo de fluidos

1. Gire as válvulas de comutação para a posição fechada (Figura 4C). Remova as seringas, descarte a água residual e encha as seringas com soluções experimentais, por exemplo, contas de DNA; enzima; e ATP. Devolva as seringas à bomba e ligue-as às válvulas de comutação.
2. Nesta posição, force manualmente os êmbolos para baixo 5-10 μL para remover quaisquer bolhas. Altere a posição da válvula de comutação para Abrir.
3. Use o esquema de taxa de fluxo para obter uma velocidade de fluxo de fluido ideal para aprisionamento e visualização, conforme descrito na Tabela 1. O fluxo de fluido ideal para aprisionamento óptico deve permitir o aprisionamento estável de contas e, uma vez que o DNA é esticado, deve ser em forma B (~ 3.000 pb / μm).

8. Aprisionamento de esferas de poliestireno com moléculas de DNA únicas ligadas

1. Na ampliação de 10x, localize a borda entre os fluxos de fluido perto dos pontos de entrada do canal. Adicione óleo à objetiva de 100x e mude para a ampliação mais alta.
2. Abra as persianas para as armadilhas ópticas (ambas ou uma de cada vez). Os feixes de laser focados devem prender contas e o DNA deve se esticar imediatamente.
3. Uma vez que um complexo tenha sido aprisionado, traduza o estágio perpendicular ao fluxo (Figura 3A, C, inserção). Isso moverá o complexo preso da solução de contas de DNA para o fluxo 2. Uma tradução adicional moverá o complexo para o fluxo 3.

9. Limpeza da célula de fluxo

Observação : execute isso diariamente.

1. Desligue a bomba quando o experimento estiver concluído. Gire as válvulas de comutação para a posição fechada (Figura 4C).
2. Retire as seringas e esvazie-as. Enxaguar três vezes com água destilada filtrada.
3. Encha as seringas com solução de limpeza. Coloque as seringas na bomba e ligue às válvulas de comutação.
4. Limpe as válvulas de comutação e mude a posição para abrir. Bombear 800 μL de solução de limpeza a uma vazão de 100 μL/h tipicamente durante a noite.
5. No dia seguinte, feche as válvulas de comutação e, em seguida, remova e enxágue as seringas com água. Enxaguar a célula de fluxo e as linhas com 4-800 μL de água a uma vazão de 400-800 μL/h. Se for necessária uma limpeza mais extenuante das células de fluxo, substitua a solução de limpeza por cloridrato de guanídio 6 M.

Resultados

O teste inicial do alinhamento e resistência do purgador é feito com 1 μm, esferas de poliestireno não fluorescentes. Como a maioria das pesquisas feitas em laboratório usa fluorescência, testamos ainda mais a resistência da armadilha usando 1 μm, esferas de poliestireno verde Dragon (Figura 1D,E). Posteriormente, o trabalho muda para o aprisionamento óptico de complexos DNA-grânulos onde o DNA é corado com o corante bis-intercalante YOYO-1^14,29<...

Discussão

A montagem cuidadosa do sistema de fluxo é fundamental para o sucesso dos experimentos ^4,6. Um dos aspectos mais desafiadores do protocolo é a fixação de conectores à superfície de vidro. Para isso, usamos as duas abordagens a seguir: conectores de tubulação de ajuste press-fit e conjuntos de nanoportas. Os conectores press-fit aderem facilmente ao vidro, seguidos pelo empurrão da tubulação de PTFE para os orifícios pré-formados usando pinças. Quand...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
100x objective	Leica	506318 or 506038	Oil immersion lenses; Imaging and optical trapping only; Plan APO objectives optimized for fluorescence imaging
10X Objective	Leica	506263	Used to locate laser beams spots during alignment; to find focus and X-Y position in flow cell
1 mm fluorescent beads	Bangs Labs	FSDG004	Used for tap performance, focal position determination
1 mm polystyrene beads	Bangs Labs	CPO1004	Used for trap performance evaluation and binding to biotinylated molecules
63x objective	Leica	506081	Used to locate laser beams spots during alignment and to find focus and X-y position in flow cell; can be used for optical trapping as it has an identical back aperture diameter to the 100X; oil immersion lens
Alignment laser	Lumentum	1100 series	10mW HeNe laser that is visible to the naked eye that is used to position optics
Beam alignment camera	Amscope	MU303	A simple, inexpensive and software controlled camera for imaging of the beam position
Camera control and Image capture software	Hamamatsu	HCImage	Coordinates activities of the Lambda DG4 with the camera to facilitate rapid wavelength switching
Camera; Orca flash 4	Hamamatsu	c13440-20cu	CCD camera for imaging of single-molecule experiments
C-mount for the beam alignment camera	Spot imaging solutions	DE50CMT	Provides optimal positioning of the camera for imaging of laser beams during alignment
C-mount for the Orca Flash 4 camera			Has a retainer ring to hold an IR blocking filter in place. This eliminates reflected IR beam from the optical traps and facilitates clearer imaging of trapped objects.
Cy5  fluorescence filter cube	Semrock	cy5-404a-lsc-zero	Used in conjunction with Lambda DG4 to image Cy5 only
Fitc-Txred  fluorescence filter cube	Semrock	fitc/txred-2x-b-000	Used in conjunction with Lambda DG4 to image FITC and TXRed
Fluidics tubing	Grace Bio	46004	PTFE tubing as an alternate to PEEK; works well on some flow cells. Can be used with PDMS flow cells or glass flow cells when Grace Bio fit tubing connectors are used
GFP fluorescence filter cube	Semrock	gfp-3035b-lsc-zero	Used in conjunction with Lambda DG4 to image GFP only
Glass flow cells	Translume	Custom	Clear flow channels for imaging (Fig. 2E)
Glass glue	Loctite	233841	Securely and easily bonds Nanoport assemblies to glass flow cells
Glass/PDMS sandwich flow cells	CIDRA Precision services	Custom design	Flow cells built according to your specifications; imaging channels are clear (Fig. 2C)
Hamilton Cleaning solution	Hamilton	18311	Gentle but efficient cleaning solution for glass flow cells; does not bubble when used carefully
Illumination system	Sutter Instrument	Lamda DG4	Discontinued so recommend Lambda 721
Illumination system	Sutter Instrument	Lamda DG4	Discontinued so recommend Lambda 721
Image analysis software	Media cybernetics	Image Pro Premiere	Analysis of images and single molecule tracking
Image analysis software	Fiji/NIH Image/Image J	Shareware	Analysis of images and single molecule tracking
Image display card	Melles Griot	06 DLA 001	Alternate product from Thorlabs: VRC5
Immersion oil	Zeiss	444960	Immersol 518 F fluorescence free
Laser beam alignment tools	Thor labs	FMP05/M; dgo5-1500-h1; BHM1	Used to ensure beams are horizontal and at the correct height
Laser beam viewer	Canadian Photonics labs	IR 3150	Used to image IR beam spots on mirrors and  targets
Laser power meter	Thor labs		Measurement of laser output as well as trap strength
Laser safety glasses (HeNe)	Thor labs	LG7 or 8	Blocks >3 OD units of light of wavelengths >600 nm
Laser safety glasses (IR)	Thor labs	LG11	Blocks >7 OD units of light of wavelengths ³1000 nm
Mcherry  fluorescence filter cube	Semrock	mcherry-a-lsc-zero	Used in conjunction with Lambda DG4 to image mcherry only
Microscope	Leica	DMIRE2	DIC port removed to accommodate Dichroic trapping/alignment mirror
Microscope control software	UCSF/shareware	uManager	Controls the microscope, permits focal alignment of objectives as well as stage control
Nanoport assembly	IDEX	N333	Connectors that are bonded to flow cells
Optical table support	Thor Labs	PA52502	Active isolation table support
Optics and lenses	Solar TII	Various	Interference mirrors, telescopes and lenses custom designed for the system
PDMS flow cells	ufluidix	Custom	Flow cells built according to your specifications; imaging channels are clear (Figs. 2B and D)
PEEK tubing	IDEX	1532	Provides excellent connection to flow cells and switching valves
Pinkel fluorescence filter cube	Semrock	lf488/543/635-3x-a-000	Used in conjunction with Lambda DG4 to image multiple fluorophores rapidly
Press fit tubing connectors	GraceBio	46003	Clear silicone connector with adhesive that binds well to glass
Scanning mirrors	GSI Lumonics	VM500	Used to provide control of the second optical trap. GSI Lumonics no longer exists. Similar mirrors can be purchased from Cambridge Scientific
Stage	Leica
Stage micrometer	Electron Microscopy Sciences	68042-08	Provides on screen ruler for positioning of the beam and system calibration
Switching valves	IDEX	V-101T	Control direction of fluid flow and eliminate introduction of bubbles into flow cells
Syringe and valve manifold	Machine shop	None	Custom built
Syringe pump	Harvard Apparatus	PHD 2000	Controls fluid flow through flow cells
Syringe pump software	Harvard Apparatus	70-6000	Flow control provides seamless, programmable control of fluid flow
Syringes	Hamilton	81320	Gas-tight, PTFE Luer Lock, glass barrels with Teflon-coated plungers
Table top	Thor Labs	T36H	Optical table top or breadboard
Trapping laser	Newport/Spectra Physics	J-series; BL106C	Nd:YAG laser; 1064 nm; 5W laser