Использование двойного оптического пинцета и микрофлюидики для исследований одной молекулы

Резюме

Визуальная, одномолекулярная биохимия, изучаемая через микрофлюидные камеры, значительно облегчается с помощью стеклянной бочки, газонепроницаемых шприцев, стабильных соединений трубки с проточными клетками и устранения пузырьков путем размещения переключающих клапанов между шприцами и трубками. Протокол описывает двойные оптические ловушки, которые позволяют визуализировать транзакции ДНК и межмолекулярные взаимодействия.

Аннотация

Визуальная биохимия является мощным методом наблюдения стохастических свойств отдельных ферментов или ферментных комплексов, которые скрыты при усреднении, которое происходит в объемно-фазовых исследованиях. Для достижения визуализации двойные оптические пинцеты, где одна ловушка фиксирована, а другая подвижна, фокусируются в одном канале многопоточной микрофлюидной камеры, расположенной на ступени перевернутого флуоресцентного микроскопа. Оптический пинцет улавливает отдельные молекулы флуоресцентно меченой ДНК и жидкости, протекающей через камеру и мимо захваченных шариков, растягивает ДНК до В-формы (под минимальной силой, то есть 0 пН) с нуклеиновой кислотой, наблюдаемой в виде белой нити на черном фоне. Молекулы ДНК перемещаются из одного потока в другой, переводя стадию перпендикулярно потоку, чтобы обеспечить инициирование реакций контролируемым образом. Для достижения успеха микрофлюидные устройства с оптически чистыми каналами соединяют со стеклянными шприцами, удерживаемыми на месте в шприцевом насосе. Оптимальные результаты используют соединители, постоянно связанные с проточной ячейкой, трубки, которые являются механически жесткими и химически стойкими, и которые подключены к переключающим клапанам, которые устраняют пузырьки, препятствующие ламинарному потоку.

Введение

Способность визуализировать взаимодействия белка и ДНК на уровне одной молекулы и в режиме реального времени обеспечила значительное понимание стабильности генома ^1,2. В дополнение к работе с отдельными молекулами ДНК по одной за раз, возможность просматривать транзакции между отдельными молекулами поблизости обеспечивает дополнительное понимание ^3,4,5. Манипулирование дополнительными молекулами ДНК требует как дополнительных оптических ловушек, так и высококачественных, многоканальных, микрофлюидных проточных клеток⁶.

Существует несколько методов создания более одной оптической ловушки. К ним относятся сканирующие зеркала гальванометра, акустические оптические модуляторы и дифракционная оптика, которые генерируют голографический оптический пинцет 4,7,8,9. Часто сканирующие зеркала и акустические оптические модуляторы производят ловушки, которые делят время. В описанной здесь установке луч одного лазера Nd:YAG расщепляется на поляризацию, а затем лазерные сканирующие зеркала гальванометра контролируют положение того, что называется мобильной ловушкой (рисунок 1)⁴. Для облегчения позиционирования зеркал и фильтров для направления улавливающего луча на заднюю апертуру объектива микроскопа используется лазер HeNe. Это облегчает общее выравнивание, так как луч HeNe виден невооруженным глазом, в то время как инфракрасные лучи — нет. Луч HeNe также безопаснее для работы, что делает позиционирование зеркал и других компонентов менее напряженным. Первоначально путь луча для этого лазера отделен от луча 1064 нм, но вводится в тот же путь луча, а затем в объектив микроскопа. Как только физическое выравнивание достигнуто, позиционирование луча 1064 нм поверх луча HeNe выполняется, и это облегчается использованием инфракрасного средства просмотра и различных инструментов визуализации луча для визуализации положения и качества луча. Затем вводится расширитель луча, и полученный расширенный инфракрасный луч выравнивается по задней диафрагме объектива. Наконец, цель удаляется, а мощность в каждом поляризованном луче измеряется и регулируется с использованием волновых пластин λ/2, чтобы быть равной (рисунок 1C). Измерения мощности также выполняются после возврата цели, и обычно происходит потеря мощности 53%. Однако имеется достаточная мощность для формирования устойчивых фиксированных и движущихся оптических ловушек в фокальной плоскости (рисунок 1D).

Для получения изображений транзакций ДНК микрофлюидные проточные клетки играют ключевую роль, поскольку они позволяют проводить контролируемые измерения на уровне одной молекулы с высоким пространственным и временным разрешением (рисунок 2). Термин микрофлюидный относится к способности манипулировать жидкостями в одном или нескольких каналах с размерами от 5-500 мкм^{до 10,11}. Термин поток относится к фактической жидкости в канале, а канал относится к физическому каналу, в котором движется поток жидкости или потоки. Конструкция одноканальной проточной ячейки имеет общий физический канал, где наблюдаются реакции, и обычно присутствует только один поток жидкости. Таким образом, эти конструкции известны как однопоточные проточные ячейки. Напротив, многопоточные проточные ячейки определяются как микрофлюидное устройство, в котором два или более входных канала сходятся в один, общий, физический канал (рисунок 2A). В пределах общего канала потоки жидкости, которые исходят из отдельных каналов, текут параллельно друг другу и остаются разделенными с минимальным перемешиванием между ними, происходящим из-за диффузии (рисунок 2B). В большинстве экспериментальных установок один насос проталкивает жидкости в каждый канал с одинаковой скоростью. Напротив, когда используется граничное рулевое управление, три или более независимо управляемых насосов проталкивают жидкости через каналы. Однако каждый насос работает с разной скоростью, но чистый расход в общем канале постоянен¹². Это позволяет быстро менять компоненты основного канала, просто изменяя скорость насоса.

В дополнение к ламинарному потоку, другим критическим фактором является профиль параболической скорости в ламинарном потоке жидкости. Самая высокая скорость потока происходит в середине потока, а самая медленная - рядом с поверхностями (рисунок 2C)¹³. Этот профиль должен рассматриваться как полностью растягивающий молекулу ДНК, которая прикреплена к шарику, удерживаемому в потоке, для точной визуализации флуоресцентной ДНК и точных одномолекулярных анализов. Здесь ДНК растягивается до В-формы и удерживается на месте под 0 пН силы. Для этого фокусировка положения оптической ловушки должна быть в положении 10-20 мкм от нижней поверхности крышки (рисунок 2D). Необходимо соблюдать осторожность, чтобы молекула ДНК не растягивалась за пределы В-формы, так как это может ингибировать ферментные реакции. В типичных буферных условиях 1 мкм = 3000 bp ДНК¹⁴. Кроме того, захватывая 10-20 мкм от покровного листа, комплекс ДНК позиционируется далеко от поверхности, тем самым сводя к минимуму поверхностные взаимодействия.

Многие методы были использованы для создания каналов микрофлюидных устройств, и они могут быть сделаны в лаборатории или проточные ячейки могут быть приобретены из коммерческих источников 6,15,16,17. Оптимальные материалы, используемые для построения проточных ячеек, должны быть механически жесткими, оптически прозрачными с низкой флуоресценцией и непроницаемыми для органических растворителей⁶. Часто боросиликатное флоат-стекло или плавленый кремнезем используются для обеспечения стабильной среды потока в течение длительного времени, которая подходит для оптического улавливания, визуализации и обнаружения силы. Эти материалы также позволяют использовать неводные растворители (например, спектрофотометрический метанол) для упрощения поверхностного смачивания и удаления пузырьков воздуха, а также денатуранты (например, 6M гуанидиния гидрохлорид) или моющие средства для очистки проточной ячейки. Наконец, методы, используемые для введения жидкостей в проточные ячейки, варьируются от сложных вакуумных насосных систем до насосов с одним шприцем ^{14,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27}. В описанном здесь подходе используется шприцевой насос, который может вместить до 10 шприцев (рисунок 3А). Это обеспечивает гибкость при использовании одноканальных проточных ячеек или проточных ячеек с несколькими входными каналами. Здесь используется трехканальная проточная ячейка, которая соединена со шприцами, удерживаемыми на месте на шприцевом насосе с использованием трубки поли-эфир-эфир-кетон (PEEK) (рисунок 3A-C). Поток жидкостей контролируется четырехходовыми переключающими клапанами и, таким образом, служит для минимизации введения пузырьков в проточную ячейку (рисунок 3A,D). Кроме того, рекомендуются газонепроницаемые шприцы Hamilton, которые имеют жесткие стеклянные стенки и плунжеры с политетрафторэтиленовым (PTFE) покрытием, поскольку они обеспечивают исключительно плавное движение плунжера, что необходимо для получения плавного потока^14,27.

В описанной экспериментальной системе использовались проточные ячейки с двумя-пятью входными каналами. Количество входных каналов диктуется проводимым экспериментом. Для исследования RecBCD и Hop2-Mnd1 было достаточно двух потоковых каналов^14,28. Для геликазы фермент связывали со свободным концом ДНК и переводили в поток, содержащий магний и АТФ, чтобы инициировать транслокацию и раскручивание. Для Hop2-Mnd1 оптически захваченную ДНК переводили в соседний поток жидкости, содержащий белки и буферные ± двухвалентных ионов металлов. Использование трехканальных проточных клеток позволяет улавливать ДНК в потоке 1, переводить ДНК в поток 2, чтобы обеспечить связывание белка, а затем в поток 3, где присутствует АТФ, например, инициировать реакции. Вариацией вышесказанного является использование флуоресцентного помеченного белка в канале 2, что приводит к тому, что поток жидкости становится полностью белым и исключает визуализацию ДНК. Когда эта молекула транслируется в поток 3, и белки, и ДНК теперь видны, когда инициируются реакции.

Использование четырехходовых переключающих клапанов для управления потоком жидкости является критически важным компонентом системы для устранения пузырьков в проточных ячейках. Пузырьки наносят ущерб стабильному потоку жидкости, поскольку они сжимаются и расширяются непредсказуемым образом, что приводит к быстрым изменениям скорости потока и введению турбулентности. Когда клапаны расположены между шприцами и впускными трубками, путь потока отключается путем переключения положения клапана при смене шприцев. Когда новый шприц установлен на место, плунжер может быть вручную нажат, так что >6 мкл выбрасывается (мертвый объем клапана), и это почти полностью устраняет пузырьки.

Прикрепление соединителей к проточным ячейкам часто является шагом, ограничивающим скорость использования проточной ячейки. Описано использование двух типов разъемов: съемных, известных как press-fit, и постоянных (нанопортовых сборок). Съемные разъемы легко прикрепляются к проточной ячейке, и различные типы гибких трубок в дополнение к рекомендуемому PTFE могут быть протестированы с этими разъемами. Это быстрый и экономичный способ тестирования трубок и соединителей без ущерба для более дорогих стеклянных проточных ячеек. Напротив, нанопортовые сборки крепятся постоянно, выдерживают давление до 1000 фунтов на квадратный дюйм, и, в наших руках, их использование ограничено трубками PEEK разных диаметров. Это не является недостатком, так как предпочтительно использовать трубки PEEK. Одна стеклянная проточная ячейка с прикрепленными постоянными узлами может быть повторно использована более 1 года при тщательном использовании.

протокол

1. Выравнивание и тестирование лазерной ловушки с полистирольными шариками

ПРИМЕЧАНИЕ: Для установки обратитесь к рисунку 1A,B.

ВНИМАНИЕ: Экспериментатор должен носить соответствующие защитные очки или лазерные защитные очки во время выравнивания лазерного луча. Поскольку оптическая система пинцета, описанная в настоящем описании, использует как HeNe, так и ИК-лучи, требуются два отдельных набора лазерной безопасной стеклянной посуды.

1. Выравнивание луча HeNe
   1. Расположите все оптические компоненты на макетной плате. Выровняйте макетную доску так, чтобы она была как можно ближе к углу 90° относительно микроскопа.
   2. Прикрепите к микроскопу сопрягаемую трубку, содержащую объектив и телановую линзу (рисунок 1А-11,12).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Объектив telan представляет собой линзовую систему, которая используется для фокусировки изображения в промежуточной плоскости изображения в окулярах.
   3. Включите лазер HeNe и откройте затвор (рисунок 1А-18). Луч должен ударить фильтром (рисунок 1А-3) на высоте 54 мм, отражая 50% света на зеркало 5 (рисунок 1А-5). Остальные 50% луча ударяются о зеркало 4 (рисунок 1А-4) на той же высоте, что и зеркало 3.
   4. Отрегулируйте зеркало 4 (рисунок 1А-4) так, чтобы луч ударялся о зеркало 6 (рисунок 1А-6) на высоте 51 мм.
   5. Отрегулируйте зеркало 6 (рисунок 1А-6) так, чтобы луч был направлен на нижнее гальваническое зеркало на высоте 51 мм. Луч, выходящий из верхнего гальванического зеркала, будет на уровне 57,5 мм.
   6. Отрегулируйте зеркало 3 (рисунок 1А-3) так, чтобы этот луч ударялся о зеркало 5 (рисунок 1А-5) на высоте 57,5 мм. После отражения от зеркала 5 луч должен удариться о зеркало 9 (рисунок 1А-9) на той же высоте. Луч эффективно рекомбинируется в зеркале 9, проходит через объектив, а система линз телана на зеркало 21 (рисунок 1А-21), которое отражает его в объектив.
   7. Поместите чистый слайд микроскопа на сцену микроскопа. Включите камеру и нарисуйте лучи фиксированного и сканирующего лучей по отдельности на экране. Начиная с зеркала 3, затем 5 и 9, наконец, 21, выполняйте небольшие корректировки, чтобы расположить фиксированный луч в центре экрана.
   8. Чтобы убедиться, что угол выхода из зеркала луча 21 составляет 90°, измените Z-высоту микроскопа и расположите луч, изображенный на верхней и нижней поверхностях слайда. Когда они идентичны, луч находится в правильном положении, которое перпендикулярно сцене. Закройте этот луч с помощью затвора 19 (рисунок 1А-19).
   9. Начиная с зеркал 4 и 6, выполните небольшие настройки, чтобы расположить фиксированный луч в центре экрана. Затвор этого луча.
2. Выравнивание инфракрасного (ИК) луча
   ВНИМАНИЕ: Выполняйте все шаги при низкой мощности лазера по соображениям безопасности.
   1. Отрегулируйте волновую пластину 14 (фиг.1А-14) для регулировки соотношения передаваемых и отраженных пучков, расщепляемых на делителе пучка 2 (фиг.1А-2). Делитель луча 2 отражает s-компонент лазерного луча и передает p-компонент.
   2. Луч, проходящий через 2, ударяется о зеркало 7 (рисунок 1А-7), которое отклоняет луч на нижнее гальваническое зеркало. Он должен следовать по пути луча HeNe на зеркало 21. Выполняйте небольшие движения зеркала 7 для достижения этого позиционирования.
   3. Отрегулируйте зеркало 2 так, чтобы луч, отраженный зеркалом 2, ударял по зеркалу 10 (рисунок 1А-10) на высоте 57,5 мм.
   4. Луч отражается от зеркала 10 на зеркало 8 (рисунок 1А-8) на высоте 57,5 мм. Последующий луч должен ударить зеркалом 9 на той же высоте. Если нет, внесите небольшие коррективы в зеркала 10 и 8 по мере необходимости.
   5. Снимите объектив и поместите головку измерителя мощности над портом в объективную башню.
   6. Используйте пластины 14, 15 и 16 (рисунок 1A-14,15,16) для регулировки мощности каждого лазерного луча таким образом, чтобы они были равны, как показано на рисунке 1C.
   7. Поставьте расширитель балки 1 (рисунок 1А-1) на место. Отрегулируйте расширенный лазерный луч, чтобы он был круглым без комы или астигматизма.
   8. Для проверки оптических ловушек делают раствор из 1 мкм полистирольных шариков, взвешенных в воде. Затем поместите 10 мкл этого раствора на предметное стекло микроскопа, сверху поместите накладку и запечатайте лаком для ногтей. Поместите затвор на ступень микроскопа и проверьте оптические ловушки, захватив эти шарики размером 1 мкм. Убедитесь, что бусины засасываются в ловушки и удерживаются стабильно при перемещении сцены. Отлов должен происходить одинаково эффективно со всех сторон ловушки.

2. Подготовка микрофлюидной камеры

1. Если проточная ячейка представляет собой коммерчески сконструированное устройство, изготовленное из полидиметилсилоксана (PDMS) на крышке, перейдите к этапу 3. Если это стеклянное устройство с подключенными разъемами, перейдите к шагу 4.
2. Если проточная ячейка не имеет разъемов, сначала прикрепите их к входным отверстиям на слайде микроскопа. В шаге 3 приведены инструкции по подключению соединителей.

3. Соединения проточных ячеек с помощью проточной ячейки PDMS

ПРИМЕЧАНИЕ: Для настройки обратитесь к рисунку 2D.

1. Поместите проточную ячейку на чистую плоскую поверхность. Удерживайте трубку из PTFE на расстоянии 3 мм от свободного конца щипцами. Вставьте трубку в предварительно сформированное отверстие (порт может поддерживать давление в линии 2 бара).
2. Повторите эту процедуру для каждого из оставшихся портов. Подключите входные отверстия к шприцевому насосу, а выходное отверстие к бутылке для отходов (рисунок 4A,B).
3. Наполните каждый стеклянный шприц 1 мл спектрофотометрического метанола. Прикрепите каждый шприц к переключающему клапану. Убедитесь, что клапан имеет выходное отверстие, направленное на отходы, и продувайте каждую линию 50 мкл метанола (рисунок 4C, закрытое положение).
4. Переключите положение выходного отверстия на проточную ячейку (рисунок 4C, открытое положение). Перекачивайте 800 мкл метанола через проточную ячейку со скоростью потока 100 мкл/ч для намокания поверхностей и устранения пузырьков.
5. На следующий день повторите этот процесс, используя 800 мкл сверхчистой воды. Теперь проточная ячейка готова к использованию.

4. Крепление разъемов для нажимной трубки

ПРИМЕЧАНИЕ: Для настройки обратитесь к рисунку 2F.

1. Если необходимо использовать нажимные соединители трубки, осторожно снимите клейкую ленту с одной стороны разъема и поместите ее над отверстием в слайде микроскопа. Нажмите вниз в течение нескольких секунд. Повторите этот процесс для остальных соединителей.
2. Поместите проточную ячейку на чистую плоскую поверхность. Удерживайте трубку из PTFE на расстоянии 3 мм от свободного конца щипцами. Вставьте трубку в предварительно сформированное отверстие в порту и повторите эту процедуру для каждого из оставшихся портов.
3. Прикрепите трубку от впускных отверстий к переключающим клапанам. Перейдите к шагу 7.

5. Прикрепление постоянных собраний

ПРИМЕЧАНИЕ: Для настройки обратитесь к рисунку 2A-C.

1. Выполните крепление либо на чистой, плоской поверхности, либо на специально изготовленном коллекторе, чтобы удерживать проточную ячейку и соединители на месте во время склеивания.
2. Поместите проточную ячейку на чистую плоскую поверхность или в утопленную секцию коллектора (рисунок 2B). Поместите небольшое количество стеклянного клея на дно сборки и вставьте уплотнение.
3. Расположите нанопорт над одним из входных отверстий на слайде микроскопа. Осторожно надавите вниз и удерживайте на месте без бокового движения. Повторите этот процесс для остальных портов.
4. Дайте высохнуть или зажать на месте в коллекторе. Осторожно извлеките проточную ячейку из коллектора и убедитесь, что сборки хорошо выровнены с входными портами в проточной ячейке. Перейдите к шагу 7, когда будете готовы.

6. Соединения и подготовка проточных ячеек

ПРИМЕЧАНИЕ: Для установки обратитесь к рисунку 4A,B.

1. Поместите проточную ячейку на ступень микроскопа. Прикрепите трубку с помощью герметичных разъемов.
2. Наполните каждый стеклянный шприц 1 мл спектрофотометрического метанола. Прикрепите каждый шприц к переключающему клапану. Убедитесь, что клапан имеет выходное отверстие, направленное на отходы, и продувайте каждую линию 50 мкл метанола (рисунок 4C, закрытое положение).
3. Переключите положение выходного отверстия на проточную ячейку (рисунок 4C, открытое положение). Перекачивайте 800 мкл метанола через проточную ячейку со скоростью потока 100 мкл/ч для намокания поверхностей и устранения пузырьков.
4. На следующий день повторите этот процесс, используя 800 мкл сверхчистой воды. Теперь проточная ячейка готова к использованию.

7. Контроль потока жидкости

1. Поверните переключающие клапаны в закрытое положение (рисунок 4C). Извлеките шприцы, выбросьте остаточную воду, а шприцы наполните экспериментальными растворами, например, ДНК-шариками; фермент; и СПС. Верните шприцы в насос и подключите их к переключающим клапанам.
2. В этом положении вручную зажмите плунжеры вниз на 5-10 мкл, чтобы удалить пузырьки. Измените положение переключающего клапана на Открыть.
3. Используйте схему расхода для достижения оптимальной скорости потока жидкости для улавливания и визуализации, как описано в таблице 1. Оптимальный поток жидкости для оптического улавливания должен обеспечивать стабильное улавливание шариков, и как только ДНК растягивается, она должна быть B-формой (~ 3000 bp / μm).

8. Улавливание полистирольных шариков с прикрепленными одиночными молекулами ДНК

1. При 10-кратном увеличении найдите границу между потоками жидкости близко к точкам входа в канал. Добавьте масло к 100-кратному объективу и переключитесь на более высокое увеличение.
2. Откройте жалюзи для оптических ловушек (оба или по одному). Сфокусированные лазерные лучи должны захватывать бусины, а ДНК должна немедленно растягиваться.
3. После того, как комплекс был захвачен, переведите стадию перпендикулярно потоку (рисунок 3A, C, вставка). Это переместит захваченный комплекс из раствора ДНК в поток 2. Дальнейший перевод переместит комплекс в поток 3.

9. Очистка проточных ячеек

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте это ежедневно.

1. Выключите насос после завершения эксперимента. Поверните переключающие клапаны в закрытое положение (рисунок 4C).
2. Снимите шприцы и опорожните их. Промыть три раза фильтрованной дистиллированной водой.
3. Наполните шприцы чистящим раствором. Поместите шприцы в насос и подключите к переключающим клапанам.
4. Продувка коммутационных клапанов и изменение положения на открытие. Перекачивайте 800 мкл чистящего раствора со скоростью потока 100 мкл/ч обычно в течение ночи.
5. На следующий день закройте переключающие клапаны, а затем снимите и промойте шприцы водой. Промыть проточную ячейку и линии 4-800 мкл воды со скоростью потока 400-800 мкл/ч. Если требуется более напряженная очистка проточных клеток, замените чистящий раствор 6 М гуанидия гидрохлорида.

Результаты

Первоначальные испытания выравнивания и прочности ловушки проводятся с помощью 1 мкм, нефлуоресцентных полистирольных шариков. Поскольку большая часть исследований, проведенных в лаборатории, использует флуоресценцию, мы дополнительно проверяем прочность ловушки с использованием 1 ...

Обсуждение

Тщательная сборка системы потока имеет решающее значение для успешного исхода экспериментов ^4,6. Одним из наиболее сложных аспектов протокола является прикрепление разъемов к поверхности стекла. Для этого мы используем следующие два подхода: прижимные ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
100x objective	Leica	506318 or 506038	Oil immersion lenses; Imaging and optical trapping only; Plan APO objectives optimized for fluorescence imaging
10X Objective	Leica	506263	Used to locate laser beams spots during alignment; to find focus and X-Y position in flow cell
1 mm fluorescent beads	Bangs Labs	FSDG004	Used for tap performance, focal position determination
1 mm polystyrene beads	Bangs Labs	CPO1004	Used for trap performance evaluation and binding to biotinylated molecules
63x objective	Leica	506081	Used to locate laser beams spots during alignment and to find focus and X-y position in flow cell; can be used for optical trapping as it has an identical back aperture diameter to the 100X; oil immersion lens
Alignment laser	Lumentum	1100 series	10mW HeNe laser that is visible to the naked eye that is used to position optics
Beam alignment camera	Amscope	MU303	A simple, inexpensive and software controlled camera for imaging of the beam position
Camera control and Image capture software	Hamamatsu	HCImage	Coordinates activities of the Lambda DG4 with the camera to facilitate rapid wavelength switching
Camera; Orca flash 4	Hamamatsu	c13440-20cu	CCD camera for imaging of single-molecule experiments
C-mount for the beam alignment camera	Spot imaging solutions	DE50CMT	Provides optimal positioning of the camera for imaging of laser beams during alignment
C-mount for the Orca Flash 4 camera			Has a retainer ring to hold an IR blocking filter in place. This eliminates reflected IR beam from the optical traps and facilitates clearer imaging of trapped objects.
Cy5  fluorescence filter cube	Semrock	cy5-404a-lsc-zero	Used in conjunction with Lambda DG4 to image Cy5 only
Fitc-Txred  fluorescence filter cube	Semrock	fitc/txred-2x-b-000	Used in conjunction with Lambda DG4 to image FITC and TXRed
Fluidics tubing	Grace Bio	46004	PTFE tubing as an alternate to PEEK; works well on some flow cells. Can be used with PDMS flow cells or glass flow cells when Grace Bio fit tubing connectors are used
GFP fluorescence filter cube	Semrock	gfp-3035b-lsc-zero	Used in conjunction with Lambda DG4 to image GFP only
Glass flow cells	Translume	Custom	Clear flow channels for imaging (Fig. 2E)
Glass glue	Loctite	233841	Securely and easily bonds Nanoport assemblies to glass flow cells
Glass/PDMS sandwich flow cells	CIDRA Precision services	Custom design	Flow cells built according to your specifications; imaging channels are clear (Fig. 2C)
Hamilton Cleaning solution	Hamilton	18311	Gentle but efficient cleaning solution for glass flow cells; does not bubble when used carefully
Illumination system	Sutter Instrument	Lamda DG4	Discontinued so recommend Lambda 721
Illumination system	Sutter Instrument	Lamda DG4	Discontinued so recommend Lambda 721
Image analysis software	Media cybernetics	Image Pro Premiere	Analysis of images and single molecule tracking
Image analysis software	Fiji/NIH Image/Image J	Shareware	Analysis of images and single molecule tracking
Image display card	Melles Griot	06 DLA 001	Alternate product from Thorlabs: VRC5
Immersion oil	Zeiss	444960	Immersol 518 F fluorescence free
Laser beam alignment tools	Thor labs	FMP05/M; dgo5-1500-h1; BHM1	Used to ensure beams are horizontal and at the correct height
Laser beam viewer	Canadian Photonics labs	IR 3150	Used to image IR beam spots on mirrors and  targets
Laser power meter	Thor labs		Measurement of laser output as well as trap strength
Laser safety glasses (HeNe)	Thor labs	LG7 or 8	Blocks >3 OD units of light of wavelengths >600 nm
Laser safety glasses (IR)	Thor labs	LG11	Blocks >7 OD units of light of wavelengths ³1000 nm
Mcherry  fluorescence filter cube	Semrock	mcherry-a-lsc-zero	Used in conjunction with Lambda DG4 to image mcherry only
Microscope	Leica	DMIRE2	DIC port removed to accommodate Dichroic trapping/alignment mirror
Microscope control software	UCSF/shareware	uManager	Controls the microscope, permits focal alignment of objectives as well as stage control
Nanoport assembly	IDEX	N333	Connectors that are bonded to flow cells
Optical table support	Thor Labs	PA52502	Active isolation table support
Optics and lenses	Solar TII	Various	Interference mirrors, telescopes and lenses custom designed for the system
PDMS flow cells	ufluidix	Custom	Flow cells built according to your specifications; imaging channels are clear (Figs. 2B and D)
PEEK tubing	IDEX	1532	Provides excellent connection to flow cells and switching valves
Pinkel fluorescence filter cube	Semrock	lf488/543/635-3x-a-000	Used in conjunction with Lambda DG4 to image multiple fluorophores rapidly
Press fit tubing connectors	GraceBio	46003	Clear silicone connector with adhesive that binds well to glass
Scanning mirrors	GSI Lumonics	VM500	Used to provide control of the second optical trap. GSI Lumonics no longer exists. Similar mirrors can be purchased from Cambridge Scientific
Stage	Leica
Stage micrometer	Electron Microscopy Sciences	68042-08	Provides on screen ruler for positioning of the beam and system calibration
Switching valves	IDEX	V-101T	Control direction of fluid flow and eliminate introduction of bubbles into flow cells
Syringe and valve manifold	Machine shop	None	Custom built
Syringe pump	Harvard Apparatus	PHD 2000	Controls fluid flow through flow cells
Syringe pump software	Harvard Apparatus	70-6000	Flow control provides seamless, programmable control of fluid flow
Syringes	Hamilton	81320	Gas-tight, PTFE Luer Lock, glass barrels with Teflon-coated plungers
Table top	Thor Labs	T36H	Optical table top or breadboard
Trapping laser	Newport/Spectra Physics	J-series; BL106C	Nd:YAG laser; 1064 nm; 5W laser