שיטה חצי אוטומטית וניתנת לשחזור ביולוגית לכימות תצהיר סידן במבחנה

Summary

מחלות לב וכלי דם הן סיבת המוות המובילה בעולם. הסתיידות כלי הדם תורמת באופן משמעותי לנטל התחלואה והתמותה. פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה לכימות משקעי סידן בתיווך תאי שריר חלקים במבחנה על ידי הדמיה פלואורסצנטית.

Abstract

הסתיידות כלי הדם כוללת סדרה של פתולוגיות ניווניות, כולל דלקת, שינויים בפנוטיפ התאים, מוות של תאים והיעדר מעכבי הסתיידות, שמובילים במקביל לאובדן גמישות ותפקוד כלי הדם. הסתיידות כלי הדם תורמת תרומה חשובה לתחלואה ולתמותה בפאתולוגיות רבות, כולל מחלת כליות כרונית, סוכרת וטרשת עורקים. מודלי המחקר הנוכחיים לחקר הסתיידות כלי הדם מוגבלים וניתנים ליישום רק בשלבים מאוחרים של התפתחות ההסתיידות in vivo. כלים במבחנה לחקר הסתיידות כלי דם משתמשים במדידות נקודת קצה, מגדילים את הדרישות מחומר ביולוגי ומסתכנים בהכנסת שונות למחקרים. אנו מדגימים את היישום של בדיקה חדשנית המסומנת באופן פלואורסצנטי הנקשרת להתפתחות הסתיידות במבחנה על תאי שריר חלק של כלי דם אנושיים וקובעת את ההתפתחות בזמן אמת של הסתיידות חוץ גופית . בפרוטוקול זה אנו מתארים את היישום של בדיקת ההסתיידות החדשה שפיתחנו, כלי חדשני במידול מחלות שיש לו יישומים תרגומיים פוטנציאליים. אנו צופים כי בדיקה זו תהיה רלוונטית במגוון רחב יותר של מחקרי תצהיר מינרלים, כולל יישומים במחקר עצמות, סחוס או שיניים.

Introduction

הסתיידות כלי דם (VC) היא גורם סיכון עצמאי לתחלואה קרדיווסקולרית ותמותה ^1,2,3. הוא נחשב זה מכבר לתהליך כימי פסיבי של תצהיר מינרלים חוץ רחמיים, וכעת הוא נראה כתגובת ריפוי רקמות הניתנת לשינוי הכוללת תרומה אקטיבית של תאים שונים, כולל תאי שריר חלק של כלי הדם המופעלים (hVSMC) כגורם למחלה ^4,5. In vivo ניתן למדוד VC על ידי סריקות CT מרובות פרוסות כהערכה של עומס טרשת עורקים ^6,7,8. כיום, מתרחש שינוי פרדיגמה, שבו חומרת VC הופכת להיות מוכרת כגורם סיכון למחלות לב וכלי דם, סוכרת מסוג II, מחלת כליות כרונית והזדקנות 9,10,11,12,13,14,15^.

hVSMCs הם סוג התא הנפוץ ביותר במערכת הלב וכלי הדם ושחקן מרכזי בפיתוח VC. הסתיידות המושרה על-ידי hVMC במבחנה היא מודל מחלות נפוץ לחקר מחלות לב וכלי דם^16,17. עם זאת, רוב הפרוטוקולים לזיהוי הסתיידות חוץ גופית משתמשים במדידות נקודת קצה שיכולות להגביל את רכישת הנתונים, דורשות שימוש רב יותר בחומר תאי ויכולות להאט את המחקר. שיטות נפוצות לזיהוי הסתיידות hVSMC במבחנה כוללות את בדיקת o-cresolphthalein, המודדת תצהיר סידן מסיס כנגד סך החלבון ודורשת תזה¹⁸. כמו כן, מכתים אדומים Alizarin משמש, אשר נקשר ישירות משקעי סידן על תאים קבועים או רקמות¹⁹. כדי לחקור הסתיידות hVSMC לאורך זמן עם o-cresolphthalein או Alizarin אדום דורש קבוצות של שכפולים לכל נקודת זמן, להגדיל את הביקוש על חומר ביולוגי, בתורו, להגדיל את הסיכוי של השתנות.

במאמר זה אנו מפרטים את השיטה ליישום בדיקה חדשנית המשתמשת ב- hVSMCs עם בדיקת הדמיה פלואורסצנטית כדי לקבוע התקדמות VC במבחנה , כמו גם לתפקד כבדיקת הסתיידות חד-שלבית סופית. הוכחנו בעבר כי בדיקה זו דומה באופן ישיר לשיטות o-cresolphthalein ו- Alizarin Red וניתן להשתמש בה כדי להבחין בין תנאי תרבית משתנים²⁰. בנוסף למדידות בזמן אמת, ניתן להשתמש בבדיקה זו כדי לקבוע את הנטייה של דגימות סרום או פלזמה כסמן פונדקאי לפיתוח VC קליני²⁰. זה יסייע ביישום אסטרטגיות ביולוגיות של מדעי הלב וכלי הדם ומידול מחלות. יישום נוסף של הבדיקה עשוי להיות כמערכת BioHybrid תרגומית להערכת חומרת VC או התקדמות ממרכיבי דם כגון סרום או פלזמה.

Protocol

1. זריעת תאים, תחזוקה והסתיידות

1. לגידול תאים ראשוניים, השתמש בארון זרימת אוויר למינרי, כפפות וציוד סטרילי. יש לחטא את הידיים ואת סביבת העבודה לפני ואחרי ביצוע כל עבודה. התייחסו לכל התאים הראשוניים ואמצעי התרבית כאל ביו-האזרד פוטנציאלי, אלא אם כן הוכח אחרת. רצוי אוטוקלאב תאים עודפים ומדיה לפני ההשלכה. אין להשבית כימית ואוטוקלאב מכיוון שהדבר ישחרר אדים רעילים.
2. תרבית hVSMC על צלחות תרבית תאים לא מצופים.
3. שמור באופן שגרתי על hVSMC במדיום צמיחה המורכב ממדיום M199 בתוספת 10%-20% FBS ו-1% Pen/Strep ודגירה ב-37 °C ו-5% CO₂.
4. פצל את התאים במפגש של 70%-90%.
   1. כדי לפצל, לשטוף את hVSMCs 2x עם PBS. מוסיפים טריפסין ודוגרים במשך 2-5 דקות ב-37 מעלות צלזיוס. בדוק את ניתוק התאים מתחת למיקרוסקופ.
   2. לעכב את תגובת הטריפסין על ידי הוספת מדיום המכיל סרום. צנטריפוגה של התאים ב 350 x גרם במשך 4 דקות ולהשהות את הכדור במדיום תחזוקה. hVSMCs עוקבים אחר ערכת פיצול 1:2.
5. כדי להתחיל את ניסוי ההסתיידות, הכן את התאים לפי ההוראות הבאות לפיצול (שלב 1.4.1). לאחר ההדחה, סופרים את התאים והזרעים לצלחת של 48 בארות בצפיפות של 10-15 x 10³ תאים לס"מ². זרעו את התאים תוך הימנעות משימוש בבארות החיצוניות, כפי שמומלץ באיור משלים 1.
6. תנו לתאים להיצמד ולהתאושש במשך 24 שעות (למשך הלילה) תוך כדי דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂.
7. יש לשטוף בעדינות את התאים פי 2 עם PBS, תוך שאיפה זהירה של כל ה-PBS הנותרים לאחר השטיפה^השנייה .
8. הוסיפו בעדינות מדיום הסתיידות ודגירה נוספת ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂. מדיום הסתיידות חייב להכיל גירוי הסתיידות, המסומן באופן פלואורסצנטי fetuin-A (למשל, עם חלבון פלואורסצנטי אדום [RFP]) (1 מיקרוגרם/מ"ל), וכתם גרעיני HOECHST 33342 (0.1 מיקרוגרם/מ"ל) או כתם גרעיני פלואורסצנטי חי דומה. אין להשתמש ב- DAPI, מכיוון שהוא אינו חדיר.
9. יש לבדוק מדי יום במיקרוסקופ אור עד להתרחשות ההסתיידות.
   הערה: להערות על תרבית תאים ותחזוקה של hVMSCs, ראה קובץ משלים 1.

2. זיהוי הסתיידות באמצעות הדמיה

הערה: הפרוטוקול הבא מספק את הצעדים הכלליים שיש לנקוט בהכנה, הדמיה וניתוח נתונים. צילומי מסך התומכים בהוראות עבור כל שלב באמצעות פלטפורמת הדמיה אוטומטית ותוכנת ניתוח תמונות מתאימה (ראה טבלת חומרים לפרטים) מסופקים בקובץ משלים 2 ובקובץ משלים 3. ניתן להשתמש במכשירי הדמיה וכלי עיבוד תמונה אחרים כדי להחיל פרוטוקול זה. עם זאת, הדמיה חוזרת ונשנית באותו מיקום בכל באר היא חיונית לקליטת נתונים משמעותית. יצירת פרוטוקול להסתיידות תמונה ושימוש חוזר בכל שלב הדמיה היא הכרחית לקבלת תוצאות הניתנות לשחזור. בפעם הראשונה ליישם את השיטה, בצע את השלבים הבאים כדי להתכונן לפני ההדמיה.

1. הגדרת פרוטוקול
   1. פתח את התוכנה ולאחר מכן בחר פרוטוקולים וצור חדש.
   2. בחר הליך ולחץ על הגדר טמפרטורה. בחלון המוקפץ, הגדר את הטמפרטורה ל- 37 °C ואת מעבר הצבע ל- 1 °C, ולחץ על OK. בחר את סוג הצלחת שבחרת מהתפריט הנפתח. הוסף את שלב ההדמיה על-ידי לחיצה על תמונה. בחרו בתמונה ההפוכה ולחצו על הלחצן 'אשר'.
   3. הוסף שלושה ערוצי הדמיה והגדר אותם ל- DAPI (377, 447 ננומטר), RFP (531, 593 ננומטר) וברייטפילד. סמן את תיבת מונטאז ' והגדר את המספר והמיקום הרצויים של התמונות. 2 x 2 עבור צלחת 48 באר היא בחירה נפוצה. שנה את החפיפה כדי לייצג כיסוי טוב יותר של כל באר. בחר אילו בארות יש לדמות. ייפתח חלון חדש שבו ניתן יהיה לבחור את הבארות המעניינות.
   4. לחצו על ' אפשרויות מיקוד' כדי להגדיר את מצב המיקוד. חלון חדש ייפתח. הגדר כל ערוץ בנפרד. בדרך כלל, בארות ממוקדות אוטומטית בערוץ "DAPI". הגדר את כל הערוצים האחרים לגובה מוקד קבוע מהערוץ הראשון והגדר על-ידי לחיצה על אישור. סגור את החלון.
   5. התחל את שלבי הפחתת הנתונים המוגדרים מראש על-ידי לחיצה על הפחתת נתונים ובחר עיבוד מקדים של תמונות. הגדרת שלב זה מפחיתה את הרקע הפלואורסצנטי. קבל את הגדרות ברירת המחדל על-ידי בחירה באפשרות אישור. קבוצה חדשה של תמונות תיווצר עם הקידומת "TSF". התמונות המקוריות יישמרו.
   6. הגדר שלב לספירת התאים על-ידי בחירה באפשרות ניתוח סלולארי. בחר תמונות TSF DAPI מהתפריט הנפתח ערוץ . הגדר פרטים נוספים לאחר ביצוע ההדמיה. שלב זה יכול להיחשב גם להפחתת נתונים; הקפידו תמיד לשמור על התמונות המקוריות.
   7. הכן את הניתוח של אות ה- RFP (הסתיידות) על-ידי בחירה באפשרות סטטיסטיקה. בחלון המוקפץ, תייג שלב ובחר TSF RFP כערוץ הקלט. סמן את התיבות ערך עליון וערך תחתון. סמן את התיבה עבור שטח כולל ברשימה התחתונה. בחרו 'ללא' בעמודה 'אפקט צבע'. בחלון המוקפץ, לחץ על מותאם אישית וסמן את התיבה רקע. פעולה זו תצבע את התוצאות מנמוך-גבוה להערכה קלה. לחץ על OK.
   8. לקריאה הוגנת, נרמל את אות ה- RFP לכל תא. בכך, שטח כולל מחולק לכל תא. כדי להגדיר שלב זה, לחץ על Ratio בצד ימין. בחלון המוקפץ, בחר עבור קלט נתונים 1 כימות RFP: שטח כולל מהתפריט הנפתח. בהמשך בחר ספירת תאים כקלט נתונים 2.
   9. לבסוף, בחר שם ערכת נתונים חדש ולחץ שוב על אישור ואישור. בחר אפקט צבע כפי שתואר קודם לכן. בפינה הימנית העליונה, בחר קובץ ושמור את הקובץ כפרוטוקול (סוג קובץ .prt).
2. מדי יום לאחר ההסתיידות הראשונה מתרחשת
   1. עבור כל נקודת זמן, חזור על שלבים אלה. בתוכנת האתחול, לחץ על קרא כעת ועל פרוטוקול קיים.... בחר את הפרוטוקול שנוצר בשלב הקודם. התוכנית תבקש להציל את הניסוי. ניתן לעשות זאת בשלב זה אך גם בכל שלב מאוחר יותר באופן ידני על ידי לחיצה על להציל כפתור בפינה השמאלית העליונה.
   2. חלון קופץ יבקש להמתין עד שהמערכת תתחמם. הפעל את בקר הגז CO₂ והגדר אותו ל -5%.
   3. לאחר שהמערכת הגיעה לטמפרטורה שנקבעה, תופיע הנחיה להכניס צלחת ולקרוא. לחץ על ביטול. הסיבה לכך היא שעבור כל נקודת זמן, יש להתאים את החשיפה של כל פלואורוכרום בנפרד.
   4. העבירו את הצלחת מהאינקובטור אל ההדמיה בכספת המתנגדת לשבירה ולשפיכה ותואמת את תקנות הבטיחות הביולוגית המקומיות להובלת תאים חיים, במקרה של תאונה. הכניסו את הצלחת לקורא הצלחות.
   5. לאחר הביטול, לחץ על הליך. בחלון המוקפץ, בחרו ' שלב הדמיה מוגדר מראש'. התאם תחילה את המיקוד והחשיפה בערוץ DAPI . נקה את התיבה חשיפה אוטומטית בכל הערוצים. לאחר מכן, לחץ על סמל המיקרוסקופ לצד ערוץ DAPI . חלון חדש ייפתח.
   6. בחר את הבאר להתמקד בה. השתמש באר עם הסתיידות בינונית עד גבוהה עבור שלב זה. אם אות כבר גלוי, לחץ תחילה על מיקוד אוטומטי ולאחר מכן על חשיפה אוטומטית. אם לא, תחילה הגדל את החשיפה וחזור על המיקוד האוטומטי ועל החשיפה האוטומטית. אם תרצה, ניתן לכוונן את החשיפה באופן ידני על ידי בחירת התפריט הנפתח של החשיפה. בדוק את ההגדרות במספר בארות. לאחר שתהיה מרוצה, שמור את ההגדרות.
   7. התאם את החשיפה באותו אופן לכל הערוצים.
      התראה: אל תתמקד בערוצים אחרים; התאימו את החשיפה בלבד. מישור המיקוד צריך להיות זהה עבור כל הערוצים.
   8. סגור את חלון ההליך. בחר בלחצן הירוק 'קרא כעת' בשורת המשימות העליונה. שמור את הניסוי כפי שצוין על ידי התוכנה.
      הערה: התוכנה תקרא כעת באופן אוטומטי את כל הבארות שנבחרו בהגדרות שנבחרו.

3. ניתוח נתונים

הערה: לקבלת צילומי מסך מפורטים על אופן ביצוע ניתוח הנתונים באמצעות פלטפורמת הדמיה אוטומטית ותוכנת ניתוח תמונה מתאימה (ראה טבלת חומרים לפרטים), ראה קובץ משלים 4. אם משתמשים במכשירי הדמיה או בתוכנת ניתוח חלופיים, יש לייצא את התמונות ולעבד אותן באצווה כדי להבטיח שהחשיפה, סף הפלואורסצנטיות או העוצמה יותאמו באופן שווה לכל התמונות בערכת נתונים השוואתית.

1. בזמן שהמערכת קוראת את הצלחת, כל התמונות מעובדות באופן אוטומטי ברקע. התאם את ההגדרות עבור ספירת התאים על-ידי בחירת תמונות TSF DAPI להצגה. בחר את הבאר המועדפת על-ידי לחיצה כפולה. חלון חדש יופיע. בחרו אחת מהתמונות.
2. בחר בכרטיסיה ניתוח . בחלון המוקפץ, בחר ניתוח סלולארי: ספירת תאים. לחץ על OK. בטלו את הבחירה בערוצי RFP וב-brightfield. סמן את התיבה סמן אובייקטים .
3. לחץ על אפשרויות כדי לפתוח את התפריט. התאם את סף הגודל והעוצמה כך שיכלול את כל הגרעינים, אך אל תכלול לכלוך. לחץ על OK. לחצו על 'החל שינויים' בפינה הימנית התחתונה כדי להעביר את ההגדרות גם לכל התמונות האחרות.
4. באופן דומה לקודם, בחר באר ותמונה עם כמות בינונית עד גבוהה של הסתיידות כדי להתאים בצורה הטובה ביותר את יחס האות לרעש; לחץ על הכרטיסיה ניתוח בתפריט המשימה.
   1. הפעם בחר סטטיסטיקת תמונות. בטלו את הבחירה בערוץ DAPI ובערוץ brightfield. לחץ על אפשרויות כדי לפתוח את התפריט. סמן את התיבה חריגות סף. התאם את הערכים העליונים והתחתונים של הסף. לספור את האות רק אם הוא מעל הרקע ולא לכלול אם יש פסולת / חפצים.
   2. כדי להגדיר ערך סף לא סובייקטיבי עבור האות שמעל הרקע, בחר בכלי הקו משורת המשימות. חלון יופיע. שרטט קו דרך טלאי של אות, אך הקפד לכלול גם אזור רקע.
      הערה: גרף יופיע בחלון המוקפץ, ויציג שיא המייצג את האות מעל קו הרקע. ערך שיא הגובה של 25% מייצג את הסף המומלץ. מומלץ גם למדוד מספר טלאי אות כדי להבטיח את בחירת הסף הנכון. בעת בחירת טלאים של אות, בחירת אזורים עם עוצמת אות גבוהה מאוד עלולה לגרום לסף שמזניח אותות בינוניים או נמוכים יותר. לכן, מומלץ לבחור טלאים של אות בינוני עד נמוך מעל הרקע. דוגמאות לסף גבוה מדי, נמוך מדי ומדויק מוצגות בקובץ משלים 4.
   3. לאחר שתהיה מרוצה, לחץ על אישור והחל שינויים כדי להעביר את ההגדרות לכל הבארות האחרות. בדוק אם הסף נבחר במדויק בבארות האחרות.
5. לאחר הגדרת ספירת התאים וסף ה- RFP, יצא את הנתונים. בחר את צלחת העניין. בתפריט הנפתח, ניתן לבחור פרמטרים מרובים לייצוא. רלוונטיים עשויים להיות ספירת תאים, אזור RFP ו"אזור/תא" שהוא המדד המשמש להשוואה בין קבוצות. לחץ על לחצן Excel לצד התפריט הנפתח כדי לייצא את הנתונים ישירות לגיליון אלקטרוני.
   הערה: בתפריט הנפתח, ניתן לבחור בנפרד את הערכים המחושבים עבור ספירת התאים, את השטח הכולל של אות RFP (המשקף את שטח ההסתיידות), וכן את היחס המנורמל של השטח הכולל של אות RFP לתא ולייצא אותם לגיליון אלקטרוני. הצג את התוצאות כיחס בין השטח הכולל של אות RFP לתא והצג אותן באופן חזותי (לדוגמה, תרשימי עמודות). החל מבחן t של סטודנט לא מותאם כדי להשוות בין שתי קבוצות או ANOVA לא מזווג כדי להשוות בין קבוצות שונות באותה נקודת זמן. השוואה בין אותה קבוצה בנקודות זמן שונות עשויה לדרוש ניתוח סטטיסטי זוגי.

תוצאות

התוצאה כוללת תמונות מקוריות של גרעינים מוכתמים ב-HOECHST, הסתיידות עם תווית RFP ותמונות שדה בהיר. ניתן לזהות ולנתח שלבים שונים של הסתיידות הנעים בין נמוך (איור 2) לגבוה (איור 3). בדרך כלל ניתן לזהות הסתיידות ככתמים שחורים באמצעות מיקרוסקופיית אור (איור 2...

Discussion

בכתב יד זה אנו מתארים שיטה חצי אוטומטית לקביעת הסתיידות במבחנה . עבור שיטה זו, יש לייעל שלושה שלבים קריטיים של הסתיידות hVSMC. ראשית, צפיפות התאים היא קריטית להתפתחות הסתיידות hVSMC. צפיפות נמוכה של hVSMCs תגרום להסתיידות איטית או ללא הסתיידות ולמוות של תאים עקב היעדר מגע בין תא לתא והלחץ המוש?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Calcium chloride, 93%, anhydrous	Thermo Fisher Scientific	349615000
Costar 6-well Clear TC-treated well plates	Corning	3516
Cytation 3 System	BioTek, Abcoude, The Netherlands
Fetal Bovine Serum	Merck	F7524-100ML
Fetuin-A-Alexa Fluor-546	Prepared in-house
Gen5 Software v3.10	BioTek
Gibco Medium 199	Thermo Fisher Scientific	11150059
Hoechst 33342, Trihydrochloride	Thermo Fisher Scientific	H3570
PBS (10X), pH 7.4	Thermo Fisher Scientific	70011044
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Thermo Fisher Scientific	25300062