Une méthode biologique semi-automatisée et reproductible pour quantifier le dépôt de calcium in vitro

Résumé

Les maladies cardiovasculaires sont la principale cause de décès dans le monde. La calcification vasculaire contribue considérablement au fardeau de la morbidité et de la mortalité cardiovasculaires. Ce protocole décrit une méthode simple pour quantifier la précipitation du calcium médiée par les cellules musculaires lisses vasculaires in vitro par imagerie fluorescente.

Résumé

La calcification vasculaire implique une série de pathologies dégénératives, y compris l’inflammation, les modifications du phénotype cellulaire, la mort cellulaire et l’absence d’inhibiteurs de la calcification, qui entraînent simultanément une perte d’élasticité et de fonction des vaisseaux. La calcification vasculaire est un contributeur important à la morbidité et à la mortalité dans de nombreuses pathologies, y compris la maladie rénale chronique, le diabète sucré et l’athérosclérose. Les modèles de recherche actuels pour étudier la calcification vasculaire sont limités et ne sont viables qu’aux derniers stades du développement de la calcification in vivo. Les outils in vitro pour étudier la calcification vasculaire utilisent des mesures de point final, ce qui augmente les exigences en matière de matériel biologique et risque d’introduire de la variabilité dans les études de recherche. Nous démontrons l’application d’une nouvelle sonde marquée par fluorescence qui se lie au développement de la calcification in vitro sur les cellules musculaires lisses vasculaires humaines et détermine le développement en temps réel de la calcification in vitro . Dans ce protocole, nous décrivons l’application de notre nouveau test de calcification, un nouvel outil de modélisation des maladies qui a des applications translationnelles potentielles. Nous envisageons que ce test soit pertinent dans un spectre plus large de la recherche sur les dépôts minéraux, y compris les applications dans la recherche sur les os, le cartilage ou les dents.

Introduction

La calcification vasculaire (CV) est un facteur de risque indépendant de morbidité et de mortalité cardiovasculaires ^1,2,3. Longtemps considéré comme un processus chimique passif de dépôt de minéraux ectopiques, il apparaît aujourd’hui comme une réponse de cicatrisation tissulaire modifiable impliquant la contribution active de diverses cellules, y compris les cellules musculaires lisses vasculaires activées (hVSMC) comme moteur de la maladie ^4,5. In vivo La CV peut être mesurée par tomodensitométrie multicoupes comme évaluation de la charge athéroscléreuse ^6,7,8. Actuellement, un changement de paradigme est en cours, dans lequel la gravité de la CV est de plus en plus reconnue comme un facteur de risque de maladie cardiovasculaire, de diabète de type II, de maladie rénale chronique et de vieillissement 9,10,11,12,13,14,15.

Les hVSMC sont le type cellulaire le plus abondant dans le système cardiovasculaire et un acteur principal dans le développement de la CV. La calcification in vitro induite par hVSMC est un modèle de maladie largement utilisé pour étudier les maladies cardiovasculaires^16,17. Cependant, la plupart des protocoles de détection de la calcification in vitro utilisent des mesures de point final qui peuvent limiter l’acquisition de données, nécessitent une plus grande utilisation de matériel cellulaire et peuvent ralentir la recherche. Les méthodes courantes de détection de la calcification hVSMC in vitro comprennent le test o-crésolphtaléine, qui mesure le dépôt de calcium solubilisé par rapport aux protéines totales et nécessite une lyse cellulaire¹⁸. En outre, la coloration Alizarin Red est utilisée, qui se lie directement aux dépôts de calcium sur les cellules fixes ou les tissus¹⁹. Pour étudier la calcification de l’hVSMC au fil du temps avec l’o-crésolphtaléine ou le rouge d’Alizarine, il faut des lots de répétitions par point temporel, ce qui augmente la demande de matériel biologique et, par conséquent, augmente le risque de variabilité.

Dans cet article, nous détaillons la méthode d’application d’un nouveau test qui utilise des hVSMC avec une sonde d’imagerie fluorescente pour déterminer la progression in vitro de la CV ainsi que la fonction d’un test de calcification en phase terminale unique. Nous avons précédemment démontré que ce test est directement comparable aux méthodes o-crésolphtaléine et Alizarin Red et peut être utilisé pour distinguer différentes conditions de culture²⁰. En plus des mesures en temps réel, ce test peut être utilisé pour déterminer la propension des échantillons de sérum ou de plasma comme marqueur de substitution pour le développement clinique de CV²⁰. Cela facilitera l’application des stratégies biologiques des sciences cardiovasculaires et de la modélisation des maladies. Une autre application du test peut être en tant que système biohybride translationnel pour évaluer la gravité ou la progression de la CV à partir de constituants sanguins tels que le sérum ou le plasma.

Protocole

1. Ensemencement cellulaire, entretien et induction de calcification

1. Pour la culture des cellules primaires, utilisez une armoire à flux d’air laminaire, des gants et du matériel stérile. Désinfectez les mains et l’espace de travail avant et après tout travail. Traiter toutes les cellules primaires et tous les milieux de culture comme présentant un risque biologique potentiel, sauf preuve contraire. De préférence, autoclaver les cellules et les milieux excédentaires avant l’élimination. Ne pas inactiver chimiquement et autoclaver car cela libérerait des fumées toxiques.
2. Culture hVSMC sur des plaques de culture cellulaire non enrobées.
3. Maintenir systématiquement hVSMC dans un milieu de croissance composé de milieu M199 complété par 10%-20% FBS et 1% Pen/Streptocoque et incuber à 37 °C et 5% CO₂.
4. Divisez les cellules sur une confluence de 70% à 90%.
   1. Pour fractionner, lavez les hVSMC 2x avec du PBS. Ajouter la trypsine et incuber pendant 2-5 min à 37 °C. Vérifiez le détachement des cellules au microscope.
   2. Inhiber la réaction de trypsine en ajoutant un milieu contenant du sérum. Centrifuger les cellules à 350 x g pendant 4 min et remettre la pastille en suspension dans un milieu d’entretien. Les hVSMC suivent un schéma de fractionnement 1:2.
5. Pour démarrer l’expérience de calcification, préparez les cellules en suivant les instructions pour une scission (étape 1.4.1). Lors de la remise en suspension, compter les cellules et les graines dans une plaque de 48 puits à une densité de 10-15 x 10³ cellules/cm². Ensemencer les cellules en évitant d’utiliser les puits extérieurs, comme recommandé dans la figure supplémentaire 1.
6. Laisser les cellules adhérer et récupérer pendant 24 h (toute la nuit) tout en incubant à 37 °C et 5% de CO₂.
7. Lavez doucement les cellules 2x avec du PBS, en aspirant soigneusement tout le PBS restant après le 2ème lavage.
8. Ajouter délicatement le milieu de calcification et incuber à 37 °C et 5% de CO₂. Le milieu de calcification doit contenir un stimulus de calcification, une fœtuine-A marquée par fluorescence (p. ex. avec une protéine fluorescente rouge [RFP]) (1 μg/mL) et une coloration nucléaire HOECHST 33342 (0,1 μg/mL) ou une coloration nucléaire fluorescente vivante similaire. N’utilisez pas de DAPI, car il n’est pas perméable.
9. Vérifiez quotidiennement avec un microscope optique jusqu’à ce que la calcification se produise.
   REMARQUE : Pour obtenir des notes sur la culture cellulaire et l’entretien des CSSGh, veuillez consulter le dossier supplémentaire 1.

2. Détection de calcification par imagerie

Remarque : Le protocole suivant fournit les étapes générales à suivre dans la préparation, l’imagerie et l’analyse des données. Des captures d’écran à l’appui des instructions pour chaque étape à l’aide d’une plateforme d’imagerie automatisée et du logiciel d’analyse d’images correspondant (voir le tableau des matériaux pour plus de détails) sont fournies dans le dossier supplémentaire 2 et le dossier supplémentaire 3. D’autres instruments d’imagerie et outils de traitement d’images peuvent être utilisés pour appliquer ce protocole. Cependant, l’imagerie répétée au même endroit dans chaque puits est cruciale pour l’acquisition de données significatives. La création d’un protocole de calcification et de réutilisation des images à chaque étape de l’imagerie est nécessaire pour obtenir des résultats reproductibles. La première fois que vous appliquez la méthode, suivez les étapes ci-dessous pour vous préparer avant l’imagerie.

1. Configuration du protocole
   1. Ouvrez le logiciel, puis sélectionnez Protocoles et créer nouveau.
   2. Sélectionnez Procédure et cliquez sur Définir la température. Dans la fenêtre contextuelle, réglez la température sur 37 °C et le dégradé sur 1 °C, puis cliquez sur OK. Sélectionnez le type d’assiette de votre choix dans le menu déroulant. Ajoutez l’étape d’imagerie en cliquant sur Image. Sélectionnez l’imageur inversé, puis cliquez sur OK.
   3. Ajoutez trois canaux d’imagerie et réglez-les sur DAPI (377, 447 nm), RFP (531, 593 nm) et fond clair. Cochez la case Montage et définissez le nombre et l’emplacement souhaités des images. 2 x 2 pour une plaque de 48 puits est un choix courant. Modifier le chevauchement pour représenter une meilleure couverture de chaque puits. Sélectionnez les puits à imager. Une nouvelle fenêtre s’ouvrira où les puits d’intérêt pourront être sélectionnés.
   4. Cliquez sur Options de mise au point pour définir le mode de mise au point . Une nouvelle fenêtre s’ouvrira. Définissez chaque canal individuellement. Généralement, les puits sont autofocalisés sur le canal « DAPI ». Réglez tous les autres canaux sur Hauteur focale fixe à partir du premier canal et définissez en cliquant sur OK. Fermez la fenêtre.
   5. Démarrez les étapes de préréglage de la réduction des données en cliquant sur Réduction des données et sélectionnez Prétraitement d’image. La configuration de cette étape réduit le fond de fluorescence. Acceptez les paramètres par défaut en sélectionnant OK. Un nouvel ensemble d’images sera créé avec le préfixe « TSF ». Les images originales seront conservées.
   6. Configurez une étape pour compter les cellules en sélectionnant Analyse cellulaire. Sélectionnez les images DAPI TSF dans le menu déroulant Channel . Définissez d’autres détails après l’exécution de l’imagerie. Cette étape peut également être considérée comme une réduction des données; Assurez-vous toujours de conserver les images originales.
   7. Préparez l’analyse du signal RFP (calcification) en sélectionnant Statistiques. Dans la fenêtre contextuelle, étiquetez Étape et sélectionnez TSF RFP comme canal d’entrée. Cochez les cases Valeur supérieure et Valeur inférieure. Cochez la case Surface totale dans la liste inférieure. Sélectionnez Aucun dans la colonne Effet de couleur. Dans la fenêtre contextuelle, cliquez sur Personnalisé et cochez la case Arrière-plan. Cela permettra de coder par couleur les résultats de faible à haut pour une évaluation facile. Appuyez sur OK.
   8. Pour une lecture équitable, normalisez le signal RFP par cellule. Ce faisant, une surface totale est divisée par cellule. Pour configurer cette étape, appuyez sur Ratio sur le côté gauche. Dans la fenêtre contextuelle, sélectionnez pour la saisie de données 1 Quantification de l’appel d’offres : Superficie totale dans le menu déroulant. Sélectionnez ensuite Nombre de cellules comme entrée de données 2.
   9. Enfin, sélectionnez un nouveau nom d’ensemble de données et appuyez à nouveau sur OK et OK . Sélectionnez Effet de couleur comme décrit précédemment. Dans le coin supérieur gauche, sélectionnez Fichier et enregistrez le fichier en tant que protocole (type de fichier .prt).
2. Tous les jours après la première calcification
   1. Pour chaque point temporel, répétez ces étapes. Dans le logiciel de démarrage, appuyez sur Lire maintenant et Protocole existant.... Sélectionnez le protocole qui a été créé à l’étape précédente. Le programme demandera de sauvegarder l’expérience. Cela peut être fait à cette étape, mais aussi à n’importe quelle étape ultérieure manuellement en cliquant sur le bouton Enregistrer en haut à gauche.
   2. Une fenêtre contextuelle vous demandera d’attendre que le système chauffe. Allumez le contrôleur de gaz CO₂ et réglez-le sur 5%.
   3. Une fois que le système a atteint la température réglée, une invite apparaîtra pour insérer une plaque et lire. Appuyez sur Annuler. En effet, pour chaque point temporel, l’exposition de chaque fluorochrome doit être ajustée individuellement.
   4. Transportez la plaque de l’incubateur à l’imageur dans une boîte sûre qui résiste à la rupture et au déversement et qui est conforme aux réglementations locales en matière de biosécurité pour le transport de cellules vivantes, en cas d’accident. Placez la plaque dans le lecteur de plaques.
   5. Après l’annulation, cliquez sur Procédure. Dans la fenêtre contextuelle, sélectionnez Étape d’imagerie prédéfinie. Ajustez d’abord la mise au point et l’exposition sur le canal DAPI . Décochez la case Exposition automatique sur tous les canaux. Cliquez ensuite sur l’icône Microscope en regard du canal DAPI . Une nouvelle fenêtre s’ouvrira.
   6. Sélectionnez le puits sur lequel vous souhaitez vous concentrer. Utilisez un puits avec une calcification moyenne à élevée pour cette étape. Si un signal est déjà visible, cliquez d’abord sur Autofocus , puis sur Autoexposure. Si ce n’est pas le cas, augmentez d’abord l’exposition et répétez l’autofocus et l’exposition automatique. Si vous le souhaitez, l’exposition peut être ajustée manuellement en sélectionnant le menu déroulant d’exposition. Vérifiez les paramètres sur plusieurs puits. Une fois satisfait, enregistrez les paramètres.
   7. Ajustez l’exposition de la même manière pour tous les canaux.
      ATTENTION : Ne vous concentrez pas sur d’autres canaux; Ajustez seulement l’exposition. La mise au point doit être la même pour tous les canaux.
   8. Fermez la fenêtre de procédure. Sélectionnez le bouton vert Lire maintenant dans la barre des tâches supérieure. Enregistrez l’expérience comme indiqué par le logiciel.
      REMARQUE: Le logiciel va maintenant lire automatiquement tous les puits sélectionnés dans les paramètres sélectionnés.

3. Analyse des données

REMARQUE : Pour des captures d’écran détaillées sur la façon d’effectuer l’analyse des données à l’aide d’une plate-forme d’imagerie automatisée et du logiciel d’analyse d’images correspondant (voir le tableau des matériaux pour plus de détails), veuillez consulter le dossier supplémentaire 4. Si vous utilisez d’autres instruments d’imagerie ou logiciels d’analyse, les images doivent être exportées et traitées par lots en veillant à ce que l’exposition, le seuil de fluorescence ou l’intensité soient ajustés de manière égale pour toutes les images d’un ensemble de données comparatives.

1. Pendant que le système lit la plaque, toutes les images sont automatiquement traitées en arrière-plan. Ajustez les paramètres du nombre de cellules en sélectionnant les images TSF DAPI à afficher. Sélectionnez le puits de votre choix en double-cliquant. Une nouvelle fenêtre apparaîtra. Sélectionnez l’une des images.
2. Sélectionnez l’onglet Analyse . Dans la fenêtre contextuelle, sélectionnez Analyse cellulaire : Nombre de cellules. Cliquez sur OK. Désélectionnez l’appel d’offres et les canaux en fond clair. Cochez la case Mettre en surbrillance les objets .
3. Cliquez sur Options pour ouvrir le menu. Ajustez le seuil de taille et d’intensité pour inclure tous les noyaux, mais exclure les débris. Cliquez sur OK. Cliquez sur Appliquer les modifications en bas à gauche pour transférer également les paramètres vers toutes les autres images.
4. De la même manière que précédemment, sélectionnez un puits et une image avec une calcification moyenne à élevée pour ajuster au mieux le rapport signal sur bruit; cliquez sur l’onglet Analyse dans le menu des tâches.
   1. Cette fois, sélectionnez Statistiques d’image. Désélectionnez le DAPI et le canal de fond clair. Cliquez sur Options pour ouvrir le menu. Cochez la case Valeurs aberrantes de seuil. Ajustez les valeurs supérieures et inférieures du seuil. Ne comptez le signal que s’il est au-dessus de l’arrière-plan et excluez s’il y a des débris / artefacts.
   2. Pour définir une valeur de seuil non subjective pour le signal au-dessus de l’arrière-plan, sélectionnez l’outil Ligne dans la barre des tâches. Une fenêtre apparaîtra. Tracez une ligne à travers une parcelle de signal, mais assurez-vous d’inclure également une zone d’arrière-plan.
      REMARQUE: Un graphique apparaîtra dans la fenêtre contextuelle, montrant un pic représentant le signal au-dessus de la ligne d’arrière-plan. La valeur de la hauteur maximale de 25 % représente le seuil recommandé. Il est également recommandé de mesurer plusieurs patchs de signal pour s’assurer de la sélection du bon seuil. Lors de la sélection de patchs de signal, la sélection de régions avec une intensité de signal très élevée peut entraîner un seuil qui néglige les signaux moyens et/ou inférieurs. Il est donc recommandé de sélectionner des patchs de signal moyen à faible au-dessus de l’arrière-plan. Des exemples de seuils trop élevés, trop bas et précis sont présentés dans le dossier supplémentaire 4.
   3. Une fois satisfait, cliquez sur OK et appliquer les modifications pour transférer les paramètres vers tous les autres puits. Vérifiez si le seuil est sélectionné avec précision dans les autres puits.
5. Une fois le nombre de cellules et les seuils d’appel d’offres définis, exportez les données. Sélectionnez la plaque qui vous intéresse. Dans le menu déroulant, plusieurs paramètres peuvent être sélectionnés pour l’exportation. Le nombre de cellules, la zone de DP et la « zone/cellule », qui est la mesure utilisée pour la comparaison entre les groupes, pourraient être pertinents. Cliquez sur le bouton Excel en regard du menu déroulant pour exporter les données directement dans une feuille de calcul.
   REMARQUE: Dans le menu déroulant, les valeurs calculées pour le nombre de cellules, la surface totale du signal RFP (reflétant la zone de calcification), ainsi que le rapport normalisé de la surface totale du signal RFP par cellule peuvent maintenant être sélectionnés individuellement et exportés vers une feuille de calcul. Affichez les résultats sous forme de rapport entre la surface totale du signal RFP par cellule et visualisez (p. ex., graphiques à barres). Appliquez un test t de Student non apparié pour comparer deux groupes ou une ANOVA non appariée pour comparer différents groupes au même moment. La comparaison du même groupe à différents moments peut nécessiter une analyse statistique par paires.

Résultats

Le résultat comprend des images originales de noyaux colorés par HOECHST, une calcification marquée par RFP et des images en fond clair. Différents stades de calcification allant de faible (Figure 2) à élevé (Figure 3) peuvent être détectés et analysés. La calcification peut généralement être repérée sous forme de taches noires à l’aide de la microscopie optique (Figure 2D et Figure 3B

Discussion

Dans ce manuscrit, nous décrivons une méthode semi-automatisée pour la détermination de la calcification in vitro . Pour cette méthode, trois étapes critiques de la calcification hVSMC doivent être optimisées. Premièrement, la densité cellulaire est essentielle au développement de la calcification hVSMC. De faibles densités de VSMC hmc entraîneront une calcification lente ou nulle et la mort cellulaire en raison de l’absence de contact de cellule à cellule et du stress induit dans des conditions ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Calcium chloride, 93%, anhydrous	Thermo Fisher Scientific	349615000
Costar 6-well Clear TC-treated well plates	Corning	3516
Cytation 3 System	BioTek, Abcoude, The Netherlands
Fetal Bovine Serum	Merck	F7524-100ML
Fetuin-A-Alexa Fluor-546	Prepared in-house
Gen5 Software v3.10	BioTek
Gibco Medium 199	Thermo Fisher Scientific	11150059
Hoechst 33342, Trihydrochloride	Thermo Fisher Scientific	H3570
PBS (10X), pH 7.4	Thermo Fisher Scientific	70011044
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Thermo Fisher Scientific	25300062