Un método biológico semiautomatizado y reproducible para cuantificar la deposición de calcio in vitro

Resumen

Las enfermedades cardiovasculares son la principal causa de muerte en todo el mundo. La calcificación vascular contribuye sustancialmente a la carga de morbilidad y mortalidad cardiovascular. Este protocolo describe un método simple para cuantificar la precipitación de calcio mediada por células del músculo liso vascular in vitro mediante imágenes fluorescentes.

Resumen

La calcificación vascular implica una serie de patologías degenerativas, que incluyen inflamación, cambios en el fenotipo celular, muerte celular y ausencia de inhibidores de la calcificación, que concomitantemente conducen a una pérdida de elasticidad y función de los vasos. La calcificación vascular es un importante contribuyente a la morbilidad y mortalidad en muchas patologías, incluida la enfermedad renal crónica, la diabetes mellitus y la aterosclerosis. Los modelos de investigación actuales para estudiar la calcificación vascular son limitados y solo son viables en las últimas etapas del desarrollo de la calcificación in vivo. Las herramientas in vitro para estudiar la calcificación vascular utilizan mediciones de punto final, lo que aumenta las demandas de material biológico y corre el riesgo de introducir variabilidad en los estudios de investigación. Demostramos la aplicación de una nueva sonda marcada con fluorescencia que se une al desarrollo de calcificación in vitro en células del músculo liso vascular humano y determina el desarrollo en tiempo real de la calcificación in vitro . En este protocolo, describimos la aplicación de nuestro ensayo de calcificación recientemente desarrollado, una herramienta novedosa en el modelado de enfermedades que tiene posibles aplicaciones traslacionales. Prevemos que este ensayo es relevante en un espectro más amplio de investigación de deposición mineral, incluidas las aplicaciones en la investigación ósea, cartílago o dental.

Introducción

La calcificación vascular (VC) es un factor de riesgo independiente para la morbimortalidad cardiovascular ^1,2,3. Considerado durante mucho tiempo un proceso químico pasivo de deposición mineral ectópica, ahora aparece una respuesta de curación tisular modificable que involucra la contribución activa de varias células, incluidas las células activadas del músculo liso vascular (hVSMC) como impulsor de la enfermedad ^4,5. In vivo La VC puede ser medida por tomografía computarizada multicorte como una evaluación de la carga aterosclerótica ^6,7,8. Actualmente, se está produciendo un cambio de paradigma, en el que la gravedad de la VC se está reconociendo como un factor de riesgo en la enfermedad cardiovascular, la diabetes tipo II, la enfermedad renal crónica y el envejecimiento 9,10,11,12,13,14,15.

Los hVSMC son el tipo de célula más abundante en el sistema cardiovascular y un actor principal en el desarrollo de VC. La calcificación inducida por hVSMC in vitro es un modelo de enfermedad ampliamente utilizado para estudiar la enfermedad cardiovascular^16,17. Sin embargo, la mayoría de los protocolos para la detección de calcificación in vitro utilizan mediciones de punto final que pueden limitar la adquisición de datos, requieren un mayor uso de material celular y pueden retrasar la investigación. Los métodos comunes para la detección de calcificación in vitro de hVSMC incluyen el ensayo de o-cresolftaleína, que mide la deposición de calcio solubilizado contra la proteína total y requiere lisis celular¹⁸. Además, se utiliza la tinción Alizarin Red, que se une directamente a los depósitos de calcio en células o tejidos fijos¹⁹. Para estudiar la calcificación de hVSMC a lo largo del tiempo con o-cresolftaleína o rojo de alizarina se requieren lotes de réplicas por punto de tiempo, lo que aumenta la demanda de material biológico y, a su vez, aumenta la posibilidad de variabilidad.

En este documento, detallamos el método para la aplicación de un nuevo ensayo que utiliza hVSMC con una sonda de imagen fluorescente para determinar la progresión in vitro de VC, así como la función como un ensayo de calcificación de etapa terminal singular. Anteriormente demostramos que este ensayo es directamente comparable a los métodos de o-cresolftaleína y rojo de alizarina y puede usarse para distinguir entre condiciones de cultivo variables²⁰. Además de las mediciones en tiempo real, este ensayo puede ser utilizado para determinar la propensión de las muestras de suero o plasma como marcador sustituto para el desarrollo clínico de VC²⁰. Esto ayudará en la aplicación de estrategias biológicas de ciencias cardiovasculares y modelado de enfermedades. Una aplicación adicional del ensayo puede ser como un sistema BioHybrid traslacional para evaluar la gravedad o progresión de VC a partir de componentes sanguíneos como suero o plasma.

Protocolo

1. Siembra celular, mantenimiento e inducción de calcificación

1. Para cultivar células primarias, use un gabinete de flujo de aire laminar, guantes y equipo estéril. Desinfecte las manos y el espacio de trabajo antes y después de realizar cualquier trabajo. Trate todas las células primarias y medios de cultivo como un riesgo biológico potencial, a menos que se demuestre lo contrario. Preferiblemente células y medios excedentes de autoclave antes de su eliminación. No inactivar químicamente y autoclave, ya que esto liberará humos tóxicos.
2. Cultivo de hVSMC en placas de cultivo celular no recubiertas.
3. Mantener rutinariamente hVSMC en medio de crecimiento que consiste en medio M199 suplementado con 10% -20% FBS y 1% Pen/Strep e incubar a 37 °C y 5% CO₂.
4. Dividir las células en una confluencia del 70% -90%.
   1. Para dividir, lave los hVSMC 2x con PBS. Añadir tripsina e incubar durante 2-5 min a 37 °C. Compruebe si hay desprendimiento de células bajo el microscopio.
   2. Inhibir la reacción de tripsina añadiendo medio que contenga suero. Centrifugar las células a 350 x g durante 4 min y resuspender el pellet en medio de mantenimiento. Los hVSMC siguen un esquema de división 1:2.
5. Para iniciar el experimento de calcificación, prepare las células siguiendo las instrucciones para una división (Paso 1.4.1). Tras la resuspensión, contar las células y la semilla en una placa de 48 pocillos a una densidad de 10-15 x 10³ células/cm². Siembre las células evitando el uso de los pocillos externos, como se recomienda en la Figura suplementaria 1.
6. Deje que las células se adhieran y se recuperen durante 24 h (durante la noche) mientras se incuban a 37 °C y 5% de_CO2.
7. Lave suavemente las células 2x con PBS, aspirando cuidadosamente todo el PBS restante después del^2º lavado.
8. Añadir suavemente el medio de calcificación e incubar a 37 °C y 5% de_CO2. El medio de calcificación debe contener un estímulo de calcificación, fetuina-A marcada fluorescentemente (por ejemplo, con proteína fluorescente roja [RFP]) (1 μg / ml) y tinción nuclear HOECHST 33342 (0.1 μg / ml) o tinción nuclear fluorescente viva similar. No use DAPI, ya que no es permeable.
9. Verifique diariamente con un microscopio óptico hasta que se produzca la calcificación.
   NOTA: Para obtener notas sobre el cultivo celular y el mantenimiento de hVMSC, consulte el Archivo complementario 1.

2. Detección de calcificación mediante imágenes

NOTA: El siguiente protocolo proporciona los pasos generales que se deben seguir en la preparación, la creación de imágenes y el análisis de datos. Las capturas de pantalla que respaldan las instrucciones para cada paso utilizando una plataforma automatizada de imágenes y el software de análisis de imágenes correspondiente (consulte la Tabla de materiales para obtener más detalles) se proporcionan en el Archivo complementario 2 y el Archivo complementario 3. Se pueden utilizar otros instrumentos de imagen y herramientas de procesamiento de imágenes para aplicar este protocolo. Sin embargo, las imágenes repetidas en la misma ubicación en cada pozo son cruciales para la adquisición de datos significativos. La creación de un protocolo para la calcificación y reutilización de imágenes en cada paso de la imagen es necesaria para obtener resultados reproducibles. La primera vez que aplique el método, siga los pasos a continuación para prepararse antes de la toma de imágenes.

1. Configuración del protocolo
   1. Abra el software y, a continuación, seleccione Protocolos y Crear nuevo.
   2. Seleccione Procedimiento y haga clic en Establecer temperatura. En la ventana emergente, ajuste la temperatura a 37 °C y el degradado a 1 °C y haga clic en Aceptar. Seleccione el tipo de placa de su elección en el menú desplegable. Agregue el paso de imagen haciendo clic en Imagen. Seleccione el generador de imágenes invertido y haga clic en Aceptar.
   3. Agregue tres canales de imágenes y configúrelos en DAPI (377, 447 nm), RFP (531, 593 nm) y campo claro. Marque la casilla Montaje y establezca el número y la ubicación deseados de las imágenes. 2 x 2 para una placa de 48 pocillos es una opción común. Cambie la superposición para representar una mejor cobertura de cada pozo. Seleccione qué pozos se van a fotografiar. Se abrirá una nueva ventana donde se pueden seleccionar los pozos de interés.
   4. Haga clic en Opciones de enfoque para establecer el modo de enfoque . Se abrirá una nueva ventana. Establezca cada canal individualmente. Comúnmente, los pozos se enfocan automáticamente en el canal "DAPI". Establezca todos los demás canales en Altura focal fija desde el primer canal y configúrelos haciendo clic en Aceptar. Cierre la ventana.
   5. Inicie los pasos de reducción de datos preestablecidos haciendo clic en Reducción de datos y seleccione Preprocesamiento de imágenes. La configuración de este paso reduce el fondo de fluorescencia. Acepte la configuración predeterminada seleccionando Aceptar. Se creará un nuevo conjunto de imágenes con el prefijo "TSF". Las imágenes originales serán preservadas.
   6. Configure un paso para contar las celdas seleccionando Análisis celular. Seleccione imágenes TSF DAPI en el menú desplegable Canal . Establezca más detalles después de que se hayan realizado las imágenes. Este paso también puede considerarse reducción de datos; Siempre asegúrese de mantener las imágenes originales.
   7. Prepare el análisis de la señal RFP (calcificación) seleccionando Estadísticas. En la ventana emergente, etiquete Paso y seleccione TSF RFP como canal de entrada. Marque las casillas Valor superior y Valor inferior. Marque la casilla Área total en la lista inferior. Seleccione Ninguno en la columna Efecto de color. En la ventana emergente, haga clic en Personalizado y marque la casilla Fondo. Esto codificará por colores los resultados de bajo-alto para facilitar la evaluación. Pulse OK.
   8. Para una lectura justa, normalice la señal RFP por celda. Al hacerlo, se divide un área total por celda. Para configurar este paso, presione Ratio en el lado izquierdo. En la ventana emergente, seleccione para la entrada de datos 1 Cuantificación de RFP: Área total en el menú desplegable. Además, seleccione Recuento de celdas como entrada de datos 2.
   9. Finalmente, seleccione un nuevo nombre de conjunto de datos y presione OK y OK nuevamente. Seleccione Efecto de color como se describió anteriormente. En la esquina superior izquierda, seleccione Archivo y guárdelo como protocolo (tipo de archivo .prt).
2. Diariamente después de que se produce la primera calcificación
   1. Para cada punto de tiempo, repita estos pasos. En el software de inicio, pulse Leer ahora y Protocolo existente.... Seleccione el protocolo que se ha creado en el paso anterior. El programa le pedirá que guarde el experimento. Esto se puede hacer en este paso, pero también en cualquier paso posterior manualmente haciendo clic en el botón Guardar en la parte superior izquierda.
   2. Una ventana emergente le pedirá que espere a que el sistema se caliente. Encienda el controlador de gas CO₂ y configúrelo al 5%.
   3. Una vez que el sistema haya alcanzado la temperatura establecida, aparecerá un mensaje para insertar una placa y leerla. Presione Cancelar. Esto se debe a que, para cada punto de tiempo, la exposición de cada fluorocromo debe ajustarse individualmente.
   4. Transporte la placa desde la incubadora hasta el generador de imágenes en una caja segura que resista la rotura y el derrame y que cumpla con las normas locales de bioseguridad para el transporte de células vivas, en caso de accidente. Coloque la placa en el lector de placas.
   5. Después de cancelar, haga clic en Procedimiento. En la ventana emergente, seleccione Paso de imagen preestablecido. Ajuste primero el enfoque y la exposición en el canal DAPI . Desmarque la casilla Exposición automática en todos los canales. Luego, haga clic en el icono Microscopio junto al canal DAPI . Se abrirá una nueva ventana.
   6. Seleccione el pozo en el que desea centrarse. Use un pocillo con calcificación media a alta para este paso. Si una señal ya está visible, primero haga clic en Enfoque automático y, a continuación, en Exposición automática. Si no es así, primero aumente la exposición y repita el enfoque automático y la exposición automática. Si lo desea, la exposición se puede ajustar manualmente seleccionando el menú desplegable de exposición. Verifique la configuración en varios pozos. Una vez satisfecho, guarde la configuración.
   7. Ajuste la exposición de la misma manera para todos los canales.
      PRECAUCIÓN: No se centre en otros canales; Solo ajuste la exposición. El plano de enfoque debe ser el mismo para todos los canales.
   8. Cierre la ventana del procedimiento. Seleccione el botón verde Leer ahora en la barra de tareas superior. Guarde el experimento como indica el software.
      NOTA: El software ahora leerá automáticamente todos los pozos seleccionados en la configuración seleccionada.

3. Análisis de datos

NOTA: Para obtener capturas de pantalla detalladas sobre cómo realizar el análisis de datos utilizando una plataforma automatizada de imágenes y el software de análisis de imágenes correspondiente (consulte la Tabla de materiales para obtener más detalles), consulte el Archivo complementario 4. Si se utilizan instrumentos de imagen alternativos o software de análisis, las imágenes deben exportarse y procesarse por lotes, asegurando que la exposición, el umbral de fluorescencia o la intensidad se ajusten por igual para todas las imágenes en un conjunto de datos comparativos.

1. Mientras el sistema lee la placa, todas las imágenes se procesan automáticamente en segundo plano. Ajuste la configuración del recuento de celdas seleccionando las imágenes TSF DAPI que desea mostrar. Seleccione el pozo de su elección haciendo doble clic. Aparecerá una nueva ventana. Seleccione una de las imágenes.
2. Seleccione la pestaña Análisis . En la ventana emergente, seleccione Análisis celular: recuento de células. Haga clic en Aceptar. Anule la selección de los canales RFP y brightfield. Marque la casilla Resaltar objetos .
3. Haga clic en Opciones para abrir el menú. Ajuste el umbral de tamaño e intensidad para incluir todos los núcleos pero excluir los desechos. Haga clic en Aceptar. Haga clic en Aplicar cambios en la parte inferior izquierda para transferir también la configuración a todas las demás imágenes.
4. De manera similar a como antes, seleccione un pocillo y una imagen con una cantidad media a alta de calcificación para ajustar mejor la relación señal-ruido; haga clic en la ficha Análisis del menú de tareas.
   1. Esta vez seleccione Estadísticas de imagen. Anule la selección del canal DAPI y brightfield. Haga clic en Opciones para abrir el menú. Marque la casilla Valores atípicos de umbral. Ajuste los valores superior e inferior del umbral. Solo cuente la señal si está por encima del fondo y excluya si hay escombros / artefactos.
   2. Para establecer un valor de umbral no subjetivo para la señal sobre el fondo, seleccione la herramienta de línea en la barra de tareas. Aparecerá una ventana. Dibuja una línea a través de un parche de señal, pero asegúrate de incluir también un área de fondo.
      NOTA: Aparecerá un gráfico en la ventana emergente, que muestra un pico que representa la señal sobre la línea de fondo. El valor de altura máxima del 25% representa el umbral recomendado. También se recomienda medir múltiples parches de señal para garantizar la selección del umbral correcto. Al seleccionar parches de señal, la selección de regiones con una intensidad de señal muy alta puede dar como resultado un umbral que descuida las señales medias o bajas. Por lo tanto, se recomienda seleccionar parches de señal media a baja por encima del fondo. Ejemplos de umbrales demasiado altos, demasiado bajos y precisos se muestran en el archivo complementario 4.
   3. Una vez satisfecho, haga clic en Aceptar y Aplicar cambios para transferir la configuración a todos los demás pozos. Compruebe si el umbral está seleccionado con precisión en los otros pozos.
5. Una vez establecidos los umbrales de recuento de celdas y RFP, exporte los datos. Seleccione la placa de interés. En el menú desplegable, se pueden seleccionar varios parámetros para exportar. De relevancia podría ser el recuento de células, el área de RFP y "área / celda", que es la métrica utilizada para la comparación entre grupos. Haga clic en el botón Excel junto al menú desplegable para exportar los datos directamente a una hoja de cálculo.
   NOTA: En el menú desplegable, los valores calculados para el recuento de celdas, el área total de la señal RFP (que refleja el área de calcificación), así como la relación normalizada del área total de la señal RFP por celda ahora se pueden seleccionar individualmente y exportar a una hoja de cálculo. Muestre los resultados como la proporción del área total de la señal RFP por celda y visualice (por ejemplo, gráficos de barras). Aplique una prueba t de Student no pareada para comparar dos grupos o un ANOVA no pareado para comparar diferentes grupos en el mismo punto de tiempo. La comparación del mismo grupo en diferentes puntos de tiempo puede requerir un análisis estadístico pareado.

Resultados

El resultado incluye imágenes originales de núcleos teñidos con HOECHST, calcificación marcada con RFP e imágenes de campo claro. Se pueden detectar y analizar diferentes etapas de calcificación que van desde baja (Figura 2) a alta (Figura 3). La calcificación generalmente se puede detectar como manchas negras utilizando microscopía óptica (Figura 2D y Figura 3B, las flechas indican calcificaci...

Discusión

En este manuscrito, describimos un método semiautomatizado para la determinación de calcificación in vitro . Para este método, se deben optimizar tres pasos críticos de calcificación de hVSMC. En primer lugar, la densidad celular es crítica para el desarrollo de la calcificación de hVSMC. Las bajas densidades de hVSMCs resultarán en calcificación lenta o nula y muerte celular debido a la falta de contacto célula a célula y al estrés inducido en condiciones calcificantes²¹. La...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Calcium chloride, 93%, anhydrous	Thermo Fisher Scientific	349615000
Costar 6-well Clear TC-treated well plates	Corning	3516
Cytation 3 System	BioTek, Abcoude, The Netherlands
Fetal Bovine Serum	Merck	F7524-100ML
Fetuin-A-Alexa Fluor-546	Prepared in-house
Gen5 Software v3.10	BioTek
Gibco Medium 199	Thermo Fisher Scientific	11150059
Hoechst 33342, Trihydrochloride	Thermo Fisher Scientific	H3570
PBS (10X), pH 7.4	Thermo Fisher Scientific	70011044
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Thermo Fisher Scientific	25300062