in vitroでカルシウム沈着を定量するための半自動化された再現性のある生物学的ベースの方法

要約

心血管疾患は、世界中の主要な死因です。血管石灰化は、心血管の罹患率と死亡率の負担に大きく貢献します。.このプロトコルは、蛍光イメージングによって血管平滑筋細胞媒介カルシウム沈殿 をin vitro で定量化する簡単な方法を記載しています。

要約

血管石灰化は、炎症、細胞表現型の変化、細胞死、石灰化阻害剤の欠如を含む一連の変性病理を含み、同時に血管の弾力性および機能の喪失をもたらす。血管石灰化は、慢性腎臓病、真性糖尿病、アテローム性動脈硬化症など、多くの病状における罹患率と死亡率の重要な原因です。血管石灰化を研究するための現在の研究モデルは限られており、in vivoでの石灰化発生の後期段階でのみ実行可能です。血管石灰化を研究するためのin vitroツールは、エンドポイント測定を使用し、生物学的材料に対する要求を高め、研究研究にばらつきを導入するリスクを冒します。ヒト血管平滑筋細胞上でのin vitro石灰化発生に結合し、in vitro石灰化のリアルタイム発生を決定する新しい蛍光標識プローブの応用を実証します。このプロトコルでは、トランスレーショナルアプリケーションの可能性を秘めた疾患モデリングの新しいツールである、新しく開発された石灰化アッセイのアプリケーションについて説明します。このアッセイは、骨、軟骨、歯科研究への応用を含む、より幅広い鉱物沈着研究に関連すると想定しています。

概要

血管石灰化(VC)は、心血管の罹患率と死亡率の独立した危険因子です^1,2,3。長い間、異所性ミネラル沈着の受動的な化学プロセスと考えられていましたが、現在では、疾患のドライバーとして活性化血管平滑筋細胞(hVSMC)を含むさまざまな細胞の積極的な寄与を含む修正可能な組織治癒応答のように見えます^4,5。生体内VCは、アテローム性動脈硬化性負荷の評価としてマルチスライスCTスキャンによって測定することができる⁶、^7、8。現在、VCの重症度が心血管疾患、II型糖尿病、慢性腎臓病、および老化9,10,11,12,13,14,15の危険因子として認識されるようになるというパラダイムシフトが進行中です。

hVSMCは、心血管系で最も豊富な細胞型であり、VCの発生における主要なアクターです。in vitro hVSMC誘発石灰化は、心血管疾患の研究に広く使用されている疾患モデルです^16,17。ただし、in vitro石灰化の検出のためのほとんどのプロトコルは、データ収集を制限し、細胞物質のより多くの使用を必要とし、研究を遅らせる可能性のあるエンドポイント測定を使用します。in vitro hVSMC石灰化を検出するための一般的な方法には、総タンパク質に対する可溶化カルシウム沈着を測定し、細胞溶解を必要とするo-クレゾルフタレインアッセイが含まれます¹⁸。また、アリザリンレッド染色が使用され、これは固定された細胞または組織¹⁹上のカルシウム沈着物に直接結合する。o-クレゾルフタレインまたはアリザリンレッドのいずれかでhVSMC石灰化を経時的に研究するには、時点ごとに反復のバッチが必要であり、生物学的材料の需要が増加し、ひいては変動の可能性が高まります。

本論文では、蛍光イメージングプローブを用いたhVSMCsを利用して、 in vitro VCの進行を決定し、特異な末期石灰化アッセイとして機能する新しいアッセイの適用方法について詳しく説明します。我々は以前に、このアッセイがo-クレゾルフタレインおよびアリザリンレッド法に直接匹敵し、さまざまな培養条件を区別するために使用できることを実証しました²⁰。リアルタイム測定に加えて、このアッセイは、臨床VC開発のための代理マーカーとしての血清または血漿サンプルの傾向を決定するために使用され得る²⁰。これは、心臓血管科学と疾患モデリングの生物学的戦略の適用に役立ちます。アッセイのさらなる用途は、血清または血漿などの血液成分からのVC重症度または進行を評価するためのトランスレーショナルバイオハイブリッドシステムとしてであり得る。

プロトコル

1. 細胞の播種、維持、石灰化誘導

1. 初代細胞の培養には、層流キャビネット、手袋、および滅菌装置を使用します。作業の前後に手と作業スペースを消毒します。すべての初代細胞と培地は、特に証明されていない限り、潜在的なバイオハザードとして扱います。好ましくは廃棄前に余剰細胞および培地をオートクレーブする。化学的に不活性化してオートクレーブすると有毒ガスが放出されるため、オートクレーブは行わないでください。
2. コーティングされていない細胞培養プレート上でhVSMCを培養します。
3. 10%-20%FBSおよび1%ペン/連鎖球菌を添加したM199培地からなる増殖培地でhVSMCを日常的に維持し、37°Cおよび5%_CO2でインキュベートします。
4. 70%〜90%のコンフルエントで細胞を分割します。
   1. 分割するには、hVSMC を PBS で 2 回洗浄します。トリプシンを加え、37°Cで2〜5分間インキュベートします。 顕微鏡下で細胞の剥離を確認します。
   2. 血清含有培地を添加してトリプシン反応を阻害する。細胞を350 x g で4分間遠心分離し、ペレットを維持培地に再懸濁します。hVSMC は 1:2 分割スキームに従います。
5. 石灰化実験を開始するには、分割の手順に従って細胞を準備します(ステップ1.4.1)。再懸濁したら、細胞とシードを密度10-15 x^{10 3} 細胞/cm²で48ウェルプレートにカウントします。 補足図1で推奨されているように、外側のウェルの使用を避けて細胞に播種します。
6. 細胞を接着させ、37°Cおよび5%_CO2でインキュベートしながら24時間(一晩)回復させます。
7. 細胞をPBSで2回穏やかに洗浄し、2^回目の 洗浄後に残りのすべてのPBSを注意深く吸引します。
8. 石灰化培地を穏やかに加え、さらに37°Cおよび5%_CO2でインキュベートします。石灰化培地には、石灰化刺激、蛍光標識されたフェチュインA(赤色蛍光タンパク質[RFP]など)(1 μg/mL)、およびHOECHST 33342(0.1 μg/mL)核染色または同様の生蛍光核染色が含まれている必要があります。DAPI は非透過性であるため、使用しないでください。
9. 石灰化が起こるまで光学顕微鏡で毎日チェックしてください。
   注:hVMSCの細胞培養および維持に関する注意事項については、 補足ファイル1を参照してください。

2. イメージングによる石灰化検出

メモ: 次のプロトコルは、準備、イメージング、およびデータ分析で実行する一般的な手順を示しています。自動イメージングプラットフォームと対応する画像解析ソフトウェア(詳細については、資料の表を参照)を使用した各ステップの手順をサポートするスクリーンショットは、補足ファイル2および補足ファイル3に記載されています。このプロトコルを適用するために、他の画像化機器および画像処理ツールを使用してもよい。ただし、各ウェルの同じ場所で繰り返しイメージングを行うことは、意味のあるデータ取得に不可欠です。再現性のある結果を得るには、すべてのイメージングステップで画像石灰化と再利用のためのプロトコルを作成する必要があります。この方法を初めて適用するときは、以下の手順に従ってイメージングの前に準備してください。

1. プロトコルのセットアップ
   1. ソフトウェアを開き、[プロトコル] と [新規作成] を選択します。
   2. [手順]を選択し、[温度の設定]をクリックします。ポップアップウィンドウで、温度を37°C、勾配を1°Cに設定し、[OK]をクリックします。ドロップダウンメニューから選択したプレートタイプを選択します。[画像] をクリックして、イメージング ステップを追加します。反転イメージャを選択し、「OK」をクリックします。
   3. 3つのイメージングチャンネルを追加し、DAPI(377、447 nm)、RFP(531、593 nm)、および明視野に設定します。[ モンタージュ ]ボックスにチェックマークを付けて、画像の目的の数と場所を設定します。48ウェルプレートの場合は2 x 2が一般的な選択肢です。オーバーラップを変更して、各井戸のカバレッジを改善します。イメージングするウェルを選択します。新しいウィンドウが開き、目的のウェルを選択できます。
   4. [フォーカスオプション]をクリックして、フォーカスモードを設定します。新しいウィンドウが開きます。各チャンネルを個別に設定します。一般的に、井戸は「DAPI」チャネルに自動焦点を合わせます。他のすべてのチャンネルを最初のチャンネルから焦点距離を固定に設定し、「OK」をクリックして設定します。ウィンドウを閉じます。
   5. [データ削減]をクリックして事前設定 データ削減 手順を開始し、[ 画像前処理]を選択します。このステップを設定すると、蛍光バックグラウンドが減少します。[ OK] を選択して既定の設定をそのまま使用します。プレフィックス "TSF" が付いた新しいイメージのセットが作成されます。元の画像は保持されます。
   6. セルラー分析を選択して、細胞をカウントするステップを設定します。[チャネル] ドロップダウン メニューから [TSF DAPI イメージ] を選択します。イメージングの実行後にさらに詳細を設定します。このステップは、データ削減と見なすこともできます。常に元の画像を保持するようにしてください。
   7. 統計を選択してRFP(石灰化)信号の分析を準備します。ポップアップ ウィンドウで、[ステップ] というラベルを付け、入力チャネルとして [TSF RFP] を選択します。[上限値] ボックスと [下限値] ボックスにチェックマークを付けます。下のリストの[総面積]チェックボックスをオンにします。[色の効果] 列で [なし] を選択します。ポップアップウィンドウで、[カスタム]をクリックし、[背景]ボックスにチェックマークを付けます。これにより、評価を容易にするために、低高の結果が色分けされます。OKを押します。
   8. 公平に読み出すには、セルごとにRFP信号を正規化します。その際、セルごとに総面積が分割されます。このステップを設定するには、左側の 比率 を押します。ポップアップ ウィンドウで、ドロップダウン メニューから [データ入力 1 RFP 定量化: 総面積 ] を選択します。さらに、データ入力として セルカウント を選択します 2.
   9. 最後に、新しいデータセット名を選択し、[OK]と[OK]をもう一度押します。前述のように [色の効果] を選択します。左上隅にある [ファイル] を選択し、ファイルをプロトコル (.prt ファイルの種類) として保存します。
2. 最初の石灰化が起こった後の毎日
   1. すべての時点について、これらの手順を繰り返します。スタートアップソフトウェアで、[ 今すぐ読む ]と [既存のプロトコル]を押します。前の手順で作成したプロトコルを選択します。プログラムは実験を保存するように求めます。これは、このステップで実行できますが、後のステップで左上の[ 保存 ]ボタンをクリックして手動で実行することもできます。
   2. ポップアップウィンドウは、システムが熱くなるのを待つように求めます。CO₂ ガスコントローラーの電源を入れ、5%に設定します。
   3. システムが設定温度に達すると、プレートを挿入して読み取るように求めるプロンプトが表示されます。 キャンセルを押します。これは、各時点で、各蛍光色素の露出を個別に調整する必要があるためです。
   4. プレートをインキュベーターからイメージャーに輸送し、破損やこぼれに強く、事故が発生した場合に生細胞を輸送するための地域のバイオセーフティ規制に準拠した安全なボックスに入れます。プレートをプレートリーダーに入れます。
   5. キャンセル後、[手順]をクリックします。ポップアップウィンドウで、[イメージングステップのプリセット]を選択します。最初に DAPI チャネルのフォーカスと露出を調整します。すべてのチャンネルで[自動露出]ボックスのチェックを外します。次に、DAPIチャンネルの横にある顕微鏡アイコンをクリックします。新しいウィンドウが開きます。
   6. 焦点を当てる井戸を選択します。このステップでは、中程度から高い石灰化のウェルを使用してください。信号がすでに表示されている場合は、最初に [オートフォーカス ]、[ 自動露出]の順にクリックします。そうでない場合は、最初に露出を上げて、 オートフォーカス と 自動露出を繰り返します。必要に応じて、露出ドロップダウンメニューを選択して手動で露出を調整できます。複数のウェルの設定を確認してください。満足したら、設定を保存します。
   7. すべてのチャンネルで同じ方法で露出を調整します。
      注意: 他のチャネルに焦点を合わせないでください。露出のみを調整します。フォーカスプレーンは、すべてのチャネルで同じである必要があります。
   8. プロシージャ ウィンドウを閉じます。上部のタスク バーにある緑色の [ 今すぐ読む ] ボタンを選択します。ソフトウェアで示されているように実験を保存します。
      注意: ソフトウェアは、選択した設定で選択したすべてのウェルを自動的に読み取るようになります。

3.データ分析

注:自動イメージングプラットフォームと対応する画像解析ソフトウェアを使用してデータ分析を実行する方法の詳細なスクリーンショットについては、補足ファイル4を参照してください。 代替のイメージング機器または分析ソフトウェアを使用する場合は、画像をエクスポートしてバッチ処理し、露出、蛍光閾値、または強度が比較データセット内のすべての画像で均等に調整されるようにする必要があります。

1. システムがプレートを読み取る間、すべての画像はバックグラウンドで自動的に処理されます。表示する TSF DAPI イメージを選択して、セル数の設定を調整します。ダブルクリックして目的のウェルを選択します。新しいウィンドウがポップアップします。いずれかの画像を選択します。
2. [ 分析 ] タブを選択します。ポップアップウィンドウで、[細胞 解析:細胞数]を選択します。 OK をクリックします。RFP チャンネルと明視野チャンネルの選択を解除します。[ ハイライトオブジェクト ]ボックスにチェックマークを付けます。
3. [ オプション ] をクリックしてメニューを開きます。サイズと強度のしきい値を調整して、すべての原子核を含め、破片は除外します。 OK をクリックします。左下の[ 変更を適用 ]をクリックして、設定を他のすべての画像にも転送します。
4. 以前と同様の方法で、中程度から大量の石灰化を伴うウェルと画像を選択して、信号対雑音比を最適に調整します。タスクメニューの[ 分析 ]タブをクリックします。
   1. 今回は [画像統計] を選択します。DAPIと明視野チャンネルの選択を解除します。[ オプション ] をクリックしてメニューを開きます。[ しきい値の外れ値] ボックスにチェックを入れます。しきい値の上限値と下限値を調整します。信号がバックグラウンドより上にある場合にのみ信号をカウントし、破片/アーティファクトがある場合は除外します。
   2. バックグラウンドより上の信号に非主観的なしきい値を設定するには、タスクバーからラインツールを選択します。ウィンドウがポップアップします。信号のパッチに線を引きますが、背景の領域も含めてください。
      注意: ポップアップウィンドウにグラフが表示され、背景線より上の信号を表すピークが表示されます。25% のピーク高さの値は、推奨されるしきい値を表します。また、適切なスレッショルドを確実に選択するために、複数の信号パッチを測定することをお勧めします。信号のパッチを選択する際に、信号強度が非常に高い領域を選択すると、中程度またはそれ以下の信号を無視するしきい値が発生する可能性があります。したがって、バックグラウンドより上の中程度から低信号のパッチを選択することをお勧めします。高すぎる、低すぎる、および正確なしきい値の例を 補足ファイル 4 に示します。
   3. 問題がなければ、[ OK ]と[ 変更を適用 ]をクリックして、設定を他のすべてのウェルに転送します。他のウェルで閾値が正確に選択されているかどうかを確認します。
5. セル数と RFP しきい値を設定したら、データをエクスポートします。目的のプレートを選択します。ドロップダウンメニューでは、エクスポートする複数のパラメータを選択できます。関連するのは、セル数、RFP面積、およびグループ間の比較に使用されるメトリックである「面積/セル」です。ドロップダウン メニューの横にある [Excel ] ボタンをクリックして、データをスプレッドシートに直接エクスポートします。
   注:ドロップダウンメニューで、セル数の計算値、RFP信号の総面積(石灰化の面積を反映)、およびセルあたりのRFP信号の総面積の正規化された比率を個別に選択してスプレッドシートにエクスポートできるようになりました。結果をセルあたりのRFP信号の総面積の比として表示し、可視化します(棒グラフなど)。対応のないスチューデントのt検定を適用して2つのグループを比較するか、対応のない分散分析を適用して異なるグループを同時に比較します。異なる時点で同じグループを比較するには、対応のある統計分析が必要になる場合があります。

結果

結果には、HOECHST染色核の元の画像、RFP標識石灰化、および明視野画像が含まれます。低(図2)から高(図3)までの石灰化のさまざまな段階を検出および分析できます。石灰化は通常、光学顕微鏡を使用して黒い斑点として発見することができ(図2D および 図3B、矢印は石灰化を示します)、一次評価およびイ?...

ディスカッション

本稿では, in vitro 石灰化判定のための半自動法について述べる。この方法では、hVSMC石灰化の3つの重要なステップを最適化する必要があります。まず、細胞密度はhVSMC石灰化の発生に重要です。hVSMCの密度が低いと、細胞間接触の欠如と石灰化条件下で誘発されるストレスにより、石灰化が遅いかまったくないか、細胞死が発生します²¹。細胞密度が高いと過剰コンフ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Calcium chloride, 93%, anhydrous	Thermo Fisher Scientific	349615000
Costar 6-well Clear TC-treated well plates	Corning	3516
Cytation 3 System	BioTek, Abcoude, The Netherlands
Fetal Bovine Serum	Merck	F7524-100ML
Fetuin-A-Alexa Fluor-546	Prepared in-house
Gen5 Software v3.10	BioTek
Gibco Medium 199	Thermo Fisher Scientific	11150059
Hoechst 33342, Trihydrochloride	Thermo Fisher Scientific	H3570
PBS (10X), pH 7.4	Thermo Fisher Scientific	70011044
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Thermo Fisher Scientific	25300062