טכניקת ה-peel-blot: שיטת הכנת דגימות Cryo-EM להפרדת שכבות בודדות מדגימות ביולוגיות רב-שכבתיות או מרוכזות

Summary

טכניקת הקילוף-כתם היא שיטת הכנה לרשת cryo-EM המאפשרת הפרדת דגימות ביולוגיות רב-שכבתיות ומרוכזות לשכבות בודדות כדי להפחית את העובי, להגדיל את ריכוז הדגימה ולהקל על עיבוד התמונה.

Abstract

טכניקת הכנת רשת קריו-EM עם כתם קליפה היא שיטת הזרקה אחורית ששונתה באופן משמעותי במטרה להשיג הפחתה בשכבות של דגימות רב שכבתיות. הסרה זו של שכבות לפני הקפאת הדגימה יכולה לסייע בהפחתת עובי הדגימה לרמה המתאימה לאיסוף נתוני cryo-EM, שיפור שטוחות הדגימה והקלה על עיבוד התמונה. טכניקת הקליפה מאפשרת הפרדה של ממברנות מולטי-למלריות לשכבות בודדות, של גבישים דו-ממדיים שכבתיים לגבישים בודדים, ושל מבנים מוערמים דמויי יריעות של חלבונים מסיסים כדי שגם אותם ניתן להפריד לשכבות בודדות. עובי הדגימה הגבוה של דגימות מסוג זה מהווה לעתים קרובות בעיות בלתי עבירות לאיסוף נתונים cryo-EM ועיבוד תמונה cryo-EM, במיוחד כאשר יש להטות את שלב המיקרוסקופ לצורך איסוף נתונים. יתר על כן, רשתות של ריכוזים גבוהים של כל אחת מהדגימות הללו יכולות להיות מוכנות לאיסוף נתונים יעיל מכיוון שניתן להגדיל את ריכוז הדגימות לפני הכנת הרשת ולהתאים את טכניקת הקילוף-כתם כדי לגרום לפיזור צפוף של דגימה חד-שכבתית.

Introduction

טכניקת ה-peel-blot פותחה על מנת להפריד גבישים דו-ממדיים מוערמים של חלבוני ממברנה לשכבות בודדות כדי לקבל דגימות דקות מתאימות לאיסוף נתונים דו-ממדיים ותלת-ממדיים של cryo-EM ולהקל על עיבוד תמונה¹. הפרוטוקול מתאים באופן דומה לסוגים אחרים של דגימות מולטי-לאמלר וכן להשגת ריכוזי דגימה גבוהים של כל אחד מסוגי הדגימה ברשת מבלי להגדיל את העובי ב-Z.

הפחתת שכבות הדגימה לשכבה אחת מושגת על ידי הפעלת שילוב של לחץ נימי וכוחות גזירה בפרוטוקול המרחיב באופן משמעותי את שיטת ההזרקה האחורית² ומשנה אותה. שלב ראשון של הכתמה גורם לכריכה הדוקה ולהיצמדות לסרט הפחמן ולפס רשת משני צדי הדגימה הרב-שכבתית במהלך הכתם על תת-מיקרון במקום גודל הנקבובית של נייר הסינון 20-25 מיקרומטר בשיטת ההזרקה האחורית. ההפרדה, או הקילוף, של שכבה בודדת מתרחש כאשר מכריחים את הפרדת השכבות הדחוקות ברגע שהרשת נלחצת אנכית על טיפת טרהלוז, מה שמאלץ את סרט הפחמן להתרחק מפס הרשת (איור 1). מיקום מחדש של סרט הפחמן הרחק מנקודת המגע המקורית עם סרגל הרשת מתרחש בשלב הבא, כאשר הרשת מוכתמת שוב על נייר סינון תת-מיקרוני. ניתן למטב את מספר האיטרציות של שלבים אלה עבור דוגמאות ספציפיות. יתר על כן, ניתן להשתמש בפרוטוקול כדי להגדיל את ריכוזי הדגימה תוך הימנעות מצבירה ב- Z. בשל ההסתמכות על הדבקות במוט הרשת וביריעת הפחמן, כמו גם הפרדה כוחנית, גישה זו עשויה שלא להתאים למולקולות שבריריות מאוד כגון חלבונים עדינים ו/או לא יציבים וקומפלקסים של חלבונים.

טכניקת הקליפה אינה דורשת ציוד מיוחד או אספקה יקרה. עם זאת, תחולת דגימות ספציפיות תדרוש שיקולים זהירים של פרמטרים ביולוגיים. ההחלטה קלה יותר עבור גבישים דו-ממדיים מכיוון שסרט פחמן נדרש כדי להבטיח שטוחות, אך מניפולציה באמצעות טכניקת הקליפה-כתם עשויה להשפיע על השלמות הביולוגית של הדגימה או הסדר הגבישי. התאמת טכניקת הקילוף-כתם לחלקיקים בודדים מוגבלת וניתן לבחון אותה עבור אלה הזקוקים לסרט פחמן ויציבים למניפולציה. דגימות עם אינטראקציות ביולוגיות קריטיות בין שכבות עשויות שלא להתאים לאפיון בעזרת טכניקת הקילוף-כתם בשל השיבוש של אינטראקציות כאלה.

טכניקת הקלף-כתם ("peel-blot") ממוטבת במהירות הרבה ביותר על ידי בדיקה וסינון עם כתם שלילי או דגימות לא מוכתמות על ידי TEM בטמפרטורת החדר. לאחר זיהוי המספר האופטימלי של איטרציות כתמי קליפה, ניתן לקבוע את הזמן לשליטה בעובי לפני הוויטריפיקציה.

Protocol

1. שלבי הכנה לטכניקת כתם הקליפה

הערה: ההכנה דורשת שהפריטים הבאים יוצבו בצמוד זה לזה.

1. ערמו שתי חתיכות של נייר מסנן נקבוביות בגודל 20-25 מיקרומטר (ראו טבלת חומרים).
2. מניחים סרט פרפין באורך ~8X10 ס"מ בצמוד לנייר הסינון כשהנייר פונה כלפי מעלה.
3. הניחו פיסת נייר סינון תת-מיקרוני על גבי שתי פיסות נוספות של נייר סינון #4 (איור 1-1).
4. מקמו את המלקחיים נגד נימים כאשר הרגל הכפופה פונה כלפי מעלה והרגל הישרה פונה כלפי מטה. לאחר מכן, בחרו רשת של 600 רשתות עם הצד החלק/מבריק כלפי מעלה. מניחים את המלקחיים על צלחת פטרי או משטח מוגבה אחר כדי למנוע מגע של הרשת הנקייה עם פריטים אחרים.
5. מוציאים את הנייר מסרט הפרפין ומושכים את הצדדים (~5 מ"מ) ליצירת שפה קטנה. פיפטה שתי טיפות 150 μL של 4% תמיסת טרהלוז ~ 1-2 ס"מ מצד אחד קצר של סרט הפרפין ו ~ 1 ס"מ זה מזה על סרט הפרפין.
6. על ספסל נפרד או על הרצפה, יוצקים חנקן נוזלי במיכל קצף פוליסטירן קטן (ראו טבלת חומרים).
   אזהרה: קבל הדרכה לטיפול נכון באמצעות כפפות ומגן פנים על מנת למנוע עקיצת כפור.
7. הניחו מיכל רשת קריו-EM קטן בחנקן הנוזלי וכסו את מיכל הקצף פוליסטירן במגבונים נטולי מוך.

2. הנחת סרט הפחמן על הרשת

1. השתמש במלקחיים של Dumont #5 (ראו טבלת חומרים) כדי לצוף את סרט הפחמן מהנציץ על ידי נגיעה בצד אחד של הנציץ בזווית קלה כלפי מטה (~20°-40°) על אחת מטיפות תמיסת הטרהלוז ולאט לאט תן למתח המים להרים את סרט הפחמן על ידי הזזת הנציץ כלפי מטה. שחררו את הנציץ ברגע שסרט הפחמן צף על פני השטח של הטיפה.
2. בדוק חזותית את סרט הפחמן כדי למנוע שימוש בפחמן עם נזק בצורה של שברים.
3. הכנס את הרשת המוחזקת על ידי מלקחיים אנטי נימיים בזווית (~ 20°-30°) לתוך טיפת טרהלוז במיקום סמוך, ולאחר מכן ממורכז מתחת לסרט הפחמן. הרימו את סרט הפחמן (איור 1-2).
4. שמרו על הרשת באותו כיוון והורידו אותה באיטיות על פני השטח של טיפת הטרהלוז השנייה מבלי לשבור את מתח הפנים של הטיפה כדי להסיר סרט פחמן מיותר שאולי עטף את שפת הרשת לצד המחוספס.

3. הפרדת גבישים דו-ממדיים רב-שכבתיים לשכבות בודדות

1. סובבו את המלקחיים האנטי-נימיים (ראו טבלת חומרים) והניחו אותם על צלחת פטרי כשצד הפחמן של הרשת פונה כלפי מטה (איור 1-3).
2. פיפטה 1.3 μL של הדגימה לתוך מניסקוס טרהלוז קל על גבי הרשת. Pipette את הפתרון ~ 8-10 פעמים כדי לערבב ולהפיץ את trehalose ודגימה משני צידי הרשת.
3. תוך כדי דגירה של התמיסה במשך דקה אחת, פיפטה טיפה אחת או יותר של 1.7 μL של תמיסת טרהלוז על סרט הפרפין.
4. סובב את הרשת בחזרה למקומה המקורי כאשר סרט הפחמן פונה כלפי מעלה.
5. השתמשו במלקחיים נגד נימים כדי ללחוץ את הרשת על נייר הסינון התת-מיקרוני (איור 1-4). לאחר שהתמיסה נספגה על-ידי נייר הסינון וסרט הפחמן שוכב שטוח, המתן 3 שניות לפני שתרים את הרשת ותעביר אותה אנכית אל טיפת 1.7 μL של תמיסת טרהלוז (איור 1-5).
   הערה: חזור על שלב זה מספר פעמים עבור דגימות בערימה גבוהה, או שהרשת מוכנה לוויטריפיקציה בשלבים הבאים.
6. הכתימו את הרשת על שתי פיסות נייר הסינון ולאחר מכן הרימו את הרשת מנייר הסינון (איור 1-6). לאחר כ-13 שניות, בהתאם ללחות ולמאגר הדגימה, צללו את הרשת לתוך החנקן הנוזלי במיכל הקלקר הקטן והניחו את הרשת במיכל הרשת cryo-EM או העבירו אותו ישירות לסינון cryo-EM או לאיסוף נתונים.
   הערה: על מנת לייעל במהירות את הפרוטוקול, הכתימו לרעה את הרשת המוכתמת בקליפה בשלב זה במקום לצלול אותה לחנקן נוזלי. מכתימים את הדגימה באופן שלילי על ידי החלת 3 μL של 1% אורניל אצטט על הרשת, דגירה של הרשת במשך 30 שניות, והכתמתו עם חתיכה קרועה של נייר סינון נקבוביות בגודל 20-25 מיקרומטר. רשתות של גבישים דו-ממדיים המכילים טרהלוז, טאנין או גלוקוז צוללות באופן שגרתי ביד לצורך ויטריפיקציה, שכן טרהלוז, טאנין וגלוקוז מונעות היווצרות של קרח גבישי בקצבים המשמשים לצניחה ידנית².

תוצאות

ניסוי מוצלח של כתמי קילוף יביא לשכבות בודדות של דגימות בריכוזים גבוהים לעתים קרובות. יש לצפות כי אזורים מסוימים ברוב ריבועי הרשת עדיין יכילו שכבות מרובות, במיוחד במספר קטן יותר של איטרציות של מדרגות הכתמים. עם זאת, רוב ריבועי הרשת יכילו אזורים נרחבים של שכבות בודדות כפי שנצפה עבור גבישים ד...

Discussion

כתם הקליפה הוא שיטה רבת עוצמה להתגבר על ערימה ועובי של גבישים דו-ממדיים רב-שכבתיים ודגימות דומות לאיסוף נתונים cryo-EM ועיבוד תמונה. החלטה על השימוש בכתם הקליפה תתבסס על פרמטרים ביולוגיים של הדגימה ותדרוש גם הערכה ברגע שיהיה מודל קריו-EM תלת-ממדי זמין. החשיבות הביולוגית של מגעים וגמישות פוטנצ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
600-mesh grids	SPI	2060-C-XA
Anti-capillary forceps	Ted Pella	510-5
Carbon to coat mica
Cryo-EM			Cryo-EM grids may be screened at 120 kV or 200 kV.  High-resolution data is collected at 300 kV.
Dumpont #5 forceps	Ted Pella	5622
Grid box for cryo-EM storage	Ted Pella	160-40
Kim Wipes
Liquid nitrogen
Mica	Ted Pella	56	The mica is carbon-coated and cut into squares that are slighlty larger than a TEM grid.  The carbon thickness may require optimization to avoid thin carbon that breaks easily upon multiple peel blots.
Negative stain			1-2% uranyl acetate is suitable for many samples.  Other stains such as phosphotungstic acid can be substituted.
Parafilm
Polystyrene container			Used for vitrifying the peel-blot grid. A polystyrene shipping container can be recycled for this purpose and lined with aluminium foil.
Submicron filter paper	MilliporeSigma	DAWP04700
Transmission electron microscope	JEOL	JEM-1400	Any TEM operated at an accelerating voltage of 80-120 kV will be suitable for screening of negatively stained grids.
Trehalose			Prepare 4% trehalose solution.
Whatman #4 filter paper	MilliporeSigma	WHA1004150	This corresponds to the 20-25 μm pore size filter paper in the protocol.