Die Peel-Blot-Technik: Eine Kryo-EM-Probenvorbereitungsmethode zur Trennung einzelner Schichten von mehrschichtigen oder konzentrierten biologischen Proben

Zusammenfassung

Die Peel-Blot-Technik ist eine Kryo-EM-Gittervorbereitungsmethode, die die Trennung von mehrschichtigen und konzentrierten biologischen Proben in einzelne Schichten ermöglicht, um die Dicke zu reduzieren, die Probenkonzentration zu erhöhen und die Bildverarbeitung zu erleichtern.

Zusammenfassung

Die Peel-Blot-Kryo-EM-Gittervorbereitungstechnik ist eine deutlich modifizierte Rückinjektionsmethode mit dem Ziel, eine Reduzierung der Schichten von mehrschichtigen Proben zu erreichen. Diese Entfernung von Schichten vor dem Einfrieren kann dazu beitragen, die Probendicke auf ein Niveau zu reduzieren, das für die Kryo-EM-Datenerfassung geeignet ist, die Probenebenheit zu verbessern und die Bildverarbeitung zu erleichtern. Die Peel-Blot-Technik ermöglicht die Trennung von mehrschichtigen Membranen in einzelne Schichten, von geschichteten 2D-Kristallen in einzelne Kristalle und von gestapelten, blattartigen Strukturen löslicher Proteine, die ebenfalls in einzelne Schichten getrennt werden können. Die hohe Probendicke dieser Probentypen stellt häufig unüberwindliche Probleme für die Kryo-EM-Datenerfassung und Kryo-EM-Bildverarbeitung dar, insbesondere wenn der Mikroskoptisch für die Datenerfassung geneigt werden muss. Darüber hinaus können Gitter mit hohen Konzentrationen jeder dieser Proben für eine effiziente Datenerfassung vorbereitet werden, da die Probenkonzentration vor der Gittervorbereitung erhöht und die Peel-Blot-Technik angepasst werden kann, um eine dichte Verteilung der einschichtigen Probe zu erreichen.

Einleitung

Die Peel-Blot-Technik wurde entwickelt, um gestapelte zweidimensionale Kristalle von Membranproteinen in einzelne Schichten zu trennen, um entsprechend dünne Proben für die Kryo-EM 2D- und 3D-Datenerfassung zu erhalten und die Bildverarbeitung zu erleichtern¹. Das Protokoll eignet sich in ähnlicher Weise für andere Arten von mehrschaligen Proben sowie zum Erreichen hoher Probenkonzentrationen beider Probentypen auf dem Gitter, ohne die Dicke in Z zu erhöhen.

Die Reduktion der Probenschichten auf eine Schicht wird durch die Anwendung einer Kombination aus Kapillardruck und Scherkräften in einem Protokoll erreicht, das....

Protokoll

1. Vorbereitungsschritte für die Peel-Blot-Technik

HINWEIS: Zur Vorbereitung müssen die folgenden Elemente nebeneinander platziert werden.

1. Stapeln Sie zwei Stück Filterpapier im Porenformat 20-25 μm (siehe Materialtabelle).
2. Legen Sie eine ~8 cm x 10 cm lange Paraffinfolie mit dem Papier nach oben neben das Filterpapier.
3. Legen Sie ein Stück Submikron-Filterpapier auf zwei weitere Stücke Filterpapier #4 (Abbildung 1-1).
4. Positionieren Sie die Antikapillarzange mit dem gebeugten Bein nach oben und dem geraden Bein nach unten.....

Ergebnisse

Ein erfolgreiches Peel-Blot-Experiment führt zu einzelnen Probenschichten mit oft hohen Konzentrationen. Es ist zu erwarten, dass einige Regionen in den meisten Rasterquadraten immer noch mehrere Schichten enthalten, insbesondere bei einer geringeren Anzahl von Iterationen der Peel-Blot-Schritte. Die Mehrheit der Gitterquadrate wird jedoch ausgedehnte Regionen von Einzelschichten enthalten, wie sie für 2D-Kristalle der menschlichen Leukotrien-C4-Synthase (Abbildung 2) und Liposomen (hinzugefügt in Schritt 3.2,

Diskussion

Der Peel-Blot ist eine leistungsstarke Methode, um das Stapeln und die Dicke von mehrschichtigen 2D-Kristallen und ähnlichen Proben für die Kryo-EM-Datenerfassung und Bildverarbeitung zu überwinden. Eine Entscheidung über die Verwendung des Peel-Blots basiert auf biologischen Parametern der Probe und muss ebenfalls bewertet werden, sobald ein 3D-Kryo-EM-Modell verfügbar ist. Die biologische Bedeutung von Kontakten und die potenzielle Flexibilität von Kontaktregionen werden bei dieser Bewertung besonders wichtig sei.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
600-mesh grids	SPI	2060-C-XA
Anti-capillary forceps	Ted Pella	510-5
Carbon to coat mica
Cryo-EM			Cryo-EM grids may be screened at 120 kV or 200 kV.  High-resolution data is collected at 300 kV.
Dumpont #5 forceps	Ted Pella	5622
Grid box for cryo-EM storage	Ted Pella	160-40
Kim Wipes
Liquid nitrogen
Mica	Ted Pella	56	The mica is carbon-coated and cut into squares that are slighlty larger than a TEM grid.  The carbon thickness may require optimization to avoid thin carbon that breaks easily upon multiple peel blots.
Negative stain			1-2% uranyl acetate is suitable for many samples.  Other stains such as phosphotungstic acid can be substituted.
Parafilm
Polystyrene container			Used for vitrifying the peel-blot grid. A polystyrene shipping container can be recycled for this purpose and lined with aluminium foil.
Submicron filter paper	MilliporeSigma	DAWP04700
Transmission electron microscope	JEOL	JEM-1400	Any TEM operated at an accelerating voltage of 80-120 kV will be suitable for screening of negatively stained grids.
Trehalose			Prepare 4% trehalose solution.
Whatman #4 filter paper	MilliporeSigma	WHA1004150	This corresponds to the 20-25 μm pore size filter paper in the protocol.