Метод пилинга:метод крио-ЭМ-пробоподготовки для отделения отдельных слоев от многослойных или концентрированных биологических образцов

Резюме

Метод пилинга-пятнистости представляет собой метод крио-ЭМ-подготовки сетки, который позволяет разделять многослойные и концентрированные биологические образцы на отдельные слои для уменьшения толщины, увеличения концентрации образца и облегчения обработки изображений.

Аннотация

Метод подготовки крио-ЭМ-сетки с пилингом представляет собой значительно модифицированный метод обратной инъекции с целью достижения уменьшения слоев многослойных образцов. Это удаление слоев перед погружением замораживания может помочь уменьшить толщину образца до уровня, подходящего для сбора крио-ЭМ данных, улучшить плоскостность образца и облегчить обработку изображений. Метод пилинга-блоттинга позволяет разделить многоламеллярные мембраны на отдельные слои, слоистые 2D-кристаллы на отдельные кристаллы и уложенные листообразные структуры растворимых белков также быть разделенными на отдельные слои. Высокая толщина образцов этих типов образцов часто создает непреодолимые проблемы для сбора крио-ЭМ данных и крио-ЭМ обработки изображений, особенно когда ступень микроскопа должна быть наклонена для сбора данных. Кроме того, сетки с высокими концентрациями любого из этих образцов могут быть подготовлены для эффективного сбора данных, поскольку концентрация образца до подготовки сетки может быть увеличена, а метод шелушения-пятна скорректирован таким образом, чтобы привести к плотному распределению однослойного образца.

Введение

Метод пилинга-блоттинга был разработан для того, чтобы разделить сложенные двумерные кристаллы мембранных белков на отдельные слои для получения достаточно тонких образцов для сбора крио-ЭМ 2D и 3D данных и облегчения обработки изображений¹. Протокол также подходит для других типов многоламерных образцов, а также для достижения высоких концентраций образцов любого типа образца на сетке без увеличения толщины в Z.

Уменьшение слоев образца до одного слоя достигается путем применения комбинации капиллярного давления и сил сдвига в протоколе, который существенно расширяет и модифицирует метод обратной инъекции². Первая стадия промокшивания приводит к плотному сэндвичингу и сцеплению с углеродной пленкой и сетчатой полосой по обе стороны многослойного образца во время промокания на субмикроне, а не к размеру пор фильтровальной бумаги 20-25 мкм в методе обратного впрыска. Разделение или отслаивание отдельного слоя происходит при принудительном разделении зажатых слоев после того, как сетка прижимается вертикально к трегалозной капле, выталкивая углеродную пленку от стержня сетки (рисунок 1). Перемещение углеродной пленки в сторону от исходной точки контакта с стержнем сетки происходит на следующем этапе, когда сетка снова смачивается на субмикронной фильтровальной бумаге. Количество итераций этих шагов может быть оптимизировано для конкретных образцов. Кроме того, протокол может быть использован для увеличения концентраций образцов, избегая при этом агрегации в Z. Из-за зависимости от сцепления с сетчатого стержня и углеродной пленки, а также принудительного разделения, этот подход может не подходить для очень хрупких молекул, таких как определенные деликатные и/или нестабильные белки и белковые комплексы.

Техника пилинга не требует ни специализированного оборудования, ни дорогостоящих расходных материалов. Однако применимость к конкретным образцам потребует тщательного рассмотрения биологических параметров. Решение проще для 2D-кристаллов, поскольку для обеспечения плоскостности требуется углеродная пленка, но манипуляции с помощью метода пилинга могут повлиять на биологическую целостность образца или кристаллический порядок. Пригодность метода пилинга-блоттинга к одиночным частицам ограничена и может быть проверена на те, которые требуют углеродной пленки и устойчивы к манипуляциям. Образцы с критическими биологическими взаимодействиями между слоями могут не подходить для характеристики с помощью метода пилинга-блоттинга из-за нарушения таких взаимодействий.

Метод пилинга-блоттинга («пилинг-блотт») наиболее быстро оптимизируется путем тестирования и скрининга с отрицательным пятном или неокрашенными образцами ТЭМ при комнатной температуре. После того, как оптимальное количество итераций шелушения-пятна было определено, можно определить время для контроля толщины до витрификации.

протокол

1. Этапы подготовки к технике пилинг-блоттинг

ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка требует размещения следующих предметов рядом друг с другом.

1. Сложите два куска фильтровальной бумаги размером 20-25 мкм (см. Таблицу материалов).
2. Поместите парафиновую пленку длиной ~8 см х 10 см рядом с фильтровальной бумагой вверх.
3. Поместите кусочек субмикронной фильтровальной бумаги поверх двух дополнительных кусочков фильтровальной бумаги No4 (рисунок 1-1).
4. Расположите антикапиллярные щипцы с согнутой ногой вверх и прямой ногой вниз. Затем выберите сетку из 600 сеток гладкой/блестящей стороной вверх. Поместите щипцы на чашку Петри или другую приподнятую поверхность, чтобы избежать контакта чистой сетки с другими предметами.
5. Снимите бумагу с парафиновой пленки и потяните бока (~5 мм), чтобы создать небольшой ободок. Пипетки две 150 мкл капли 4% раствора трегалозы ~1-2 см с одной короткой стороны парафиновой пленки и ~1 см друг от друга на парафиновой пленке.
6. На отдельной скамейке или на полу насыпьте жидкий азот в небольшой контейнер для пенополистирола (см. Таблицу материалов).
   ВНИМАНИЕ: Пройдите обучение правильному обращению с использованием перчаток и лицевого щитка, чтобы избежать обморожения.
7. Поместите небольшой контейнер с крио-ЭМ сеткой в жидкий азот и накройте контейнер из пенополистирола безворсовыми салфетками.

2. Размещение углеродной пленки на сетке

1. Используйте щипцы Дюмона No 5 (см. Таблицу материалов), чтобы всплыть из углеродной пленки из слюды, коснувшись одной стороны слюды под небольшим углом вниз (~ 20 °-40°) на одной из капель раствора трегалозы и медленно позвольте натяжению воды снять углеродную пленку, переместив слюду вниз. Выпустите слюду, как только углеродная пленка всплывет на поверхности капли.
2. Визуально осмотрите углеродную пленку, чтобы избежать использования углерода с повреждениями в виде трещин.
3. Вставьте сетку, удерживаемую антикапиллярными щипцами под углом (~20°-30°), в трегалозную каплю в положении, прилегающем к углеродной пленке, а затем центрируйте под ней. Подберите углеродную пленку (рисунок 1-2).
4. Держите сетку в той же ориентации и медленно опустите ее на поверхность второй капли трегалозы, не нарушая поверхностного натяжения капли, чтобы удалить ненужную углеродную пленку, которая, возможно, обернулась вокруг края сетки в шероховатую сторону.

3. Разделение многослойных 2D кристаллов на однослойные

1. Поверните антикапиллярные щипцы (см. Таблицу материалов) и поместите их на чашку Петри углеродной стороной сетки лицом вниз (рисунок 1-3).
2. Пипетка 1,3 мкл образца в легкий трегалозный мениск поверх сетки. Пипетку раствором ~8-10 раз перемешать и распределить трегалозу и образец по обеим сторонам сетки.
3. При инкубации раствора в течение 1 мин пипетку одной или более капель 1,7 мкл раствора трегалозы на парафиновую пленку.
4. Поверните сетку обратно в исходное положение, повернув углеродную пленку вверх.
5. Используйте антикапиллярные щипцы, чтобы надавить сеткой на субмикронную фильтровальную бумагу (рисунок 1-4). После того, как раствор был поглощен фильтровальной бумагой и углеродная пленка лежит ровно, подождите 3 секунды, прежде чем поднимать сетку и перемещать ее вертикально на каплю раствора трегалозы объемом 1,7 мкл (рисунок 1-5).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Повторите этот шаг несколько раз для образцов с высокой степенью штабелирования, или сетка будет подготовлена для витрификации на следующих этапах.
6. Промокните сетку на двух листах фильтровальной бумаги, а затем снимите сетку с фильтровальной бумаги (рисунок 1-6). Примерно через 13 с, в зависимости от влажности и буфера образца, погрузите сетку в жидкий азот в небольшой контейнер из пенополистирола и поместите сетку в контейнер для крио-ЭМ-сетки или передайте ее непосредственно для крио-ЭМ скрининга или сбора данных.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы быстро оптимизировать протокол, отрицательно окрашивайте пятнистую сетку на этом этапе, а не погружайте ее в жидкий азот. Отрицательно окрашивают образец, нанося на сетку 3 мкл 1% уранилацетата, инкубируют сетку в течение 30 с и промокают ее оторванным куском фильтровальной бумаги размером 20-25 мкм. Сетки из 2D-кристаллов, остеклованных в трегалозе, танине или глюкозе, обычно погружаются вручную для витрификации, поскольку трегалоза, танин и глюкоза предотвращают образование кристаллического льда со скоростью, используемой для ручного погружения².

Результаты

Успешный эксперимент с шелушением приведет к созданию отдельных слоев образцов в часто высоких концентрациях. Следует ожидать, что некоторые области в большинстве квадратов сетки по-прежнему будут содержать несколько слоев, особенно при меньшем количестве итераций шагов отслаивания...

Обсуждение

Пил-блоттинг является мощным методом преодоления укладки и толщины многослойных 2D-кристаллов и аналогичных образцов для сбора крио-ЭМ данных и обработки изображений. Решение об использовании пилинга будет основываться на биологических параметрах образца, а также потребует оценки по?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
600-mesh grids	SPI	2060-C-XA
Anti-capillary forceps	Ted Pella	510-5
Carbon to coat mica
Cryo-EM			Cryo-EM grids may be screened at 120 kV or 200 kV.  High-resolution data is collected at 300 kV.
Dumpont #5 forceps	Ted Pella	5622
Grid box for cryo-EM storage	Ted Pella	160-40
Kim Wipes
Liquid nitrogen
Mica	Ted Pella	56	The mica is carbon-coated and cut into squares that are slighlty larger than a TEM grid.  The carbon thickness may require optimization to avoid thin carbon that breaks easily upon multiple peel blots.
Negative stain			1-2% uranyl acetate is suitable for many samples.  Other stains such as phosphotungstic acid can be substituted.
Parafilm
Polystyrene container			Used for vitrifying the peel-blot grid. A polystyrene shipping container can be recycled for this purpose and lined with aluminium foil.
Submicron filter paper	MilliporeSigma	DAWP04700
Transmission electron microscope	JEOL	JEM-1400	Any TEM operated at an accelerating voltage of 80-120 kV will be suitable for screening of negatively stained grids.
Trehalose			Prepare 4% trehalose solution.
Whatman #4 filter paper	MilliporeSigma	WHA1004150	This corresponds to the 20-25 μm pore size filter paper in the protocol.