La tecnica peel-blot: un metodo di preparazione dei campioni crio-EM per separare singoli strati da campioni biologici multistrato o concentrati

Riepilogo

La tecnica peel-blot è un metodo di preparazione della griglia crio-EM che consente la separazione di campioni biologici multistrato e concentrati in singoli strati per ridurre lo spessore, aumentare la concentrazione del campione e facilitare l'elaborazione delle immagini.

Abstract

La tecnica di preparazione della griglia crio-EM peel-blot è un metodo di back-injection significativamente modificato con l'obiettivo di ottenere una riduzione degli strati di campioni multistrato. Questa rimozione degli strati prima del congelamento a tuffo può aiutare a ridurre lo spessore del campione a un livello adatto alla raccolta di dati crio-EM, migliorando la planarità del campione e facilitando l'elaborazione delle immagini. La tecnica peel-blot consente la separazione di membrane multilamellari in singoli strati, di cristalli 2D stratificati in singoli cristalli e di strutture impilate simili a fogli di proteine solubili da separare allo stesso modo in singoli strati. L'elevato spessore del campione di questi tipi di campioni pone spesso problemi insormontabili per la raccolta di dati crio-EM e l'elaborazione di immagini crio-EM, specialmente quando lo stadio del microscopio deve essere inclinato per la raccolta dei dati. Inoltre, le griglie di alte concentrazioni di uno qualsiasi di questi campioni possono essere preparate per una raccolta efficiente dei dati poiché la concentrazione del campione prima della preparazione della griglia può essere aumentata e la tecnica peel-blot regolata per ottenere una distribuzione densa di campione a strato singolo.

Introduzione

La tecnica peel-blot è stata sviluppata per separare cristalli bidimensionali impilati di proteine di membrana in singoli strati per ottenere campioni adeguatamente sottili per la raccolta di dati crio-EM 2D e 3D e facilitare l'elaborazione delle immagini¹. Il protocollo è adatto allo stesso modo per altri tipi di campioni multilamellari e per ottenere elevate concentrazioni di campioni di entrambi i tipi di campioni sulla griglia senza aumentare lo spessore in Z.

La riduzione degli strati di campione a uno strato si ottiene applicando una combinazione di pressione capillare e forze di taglio in un protocollo che estende e modifica sostanzialmente il metodo di back-injection². Una prima fase di blotting si traduce in uno stretto sandwiching e aderenza al film di carbonio e una barra della griglia su entrambi i lati del campione multistrato durante la blotting su submicron piuttosto che la dimensione dei pori della carta da filtro di 20-25 μm nel metodo di back-injection. La separazione, o peeling, di un singolo strato avviene forzando la separazione degli strati a sandwich una volta che la griglia viene premuta verticalmente su una goccia di trealosio, forzando il film di carbonio lontano dalla barra della griglia (Figura 1). Il riposizionamento del film di carbonio lontano dal punto di contatto originale con la barra della griglia avviene nella fase successiva, quando la griglia viene nuovamente cancellata su carta da filtro submicron. Il numero di iterazioni di questi passaggi può essere ottimizzato per campioni specifici. Inoltre, il protocollo può essere utilizzato per aumentare le concentrazioni del campione evitando l'aggregazione in Z. A causa della dipendenza dall'aderenza alla barra della griglia e al film di carbonio, nonché della separazione forzata, questo approccio potrebbe non essere adatto per molecole altamente fragili come alcune proteine delicate e / o instabili e complessi proteici.

La tecnica peel-blot non richiede attrezzature specializzate né costose forniture. L'applicabilità a campioni specifici richiederà, tuttavia, un'attenta considerazione dei parametri biologici. La decisione è più facile per i cristalli 2D poiché è necessaria una pellicola di carbonio per garantire la planarità, ma la manipolazione tramite la tecnica peel-blot può influire sull'integrità biologica del campione o sull'ordine cristallino. L'idoneità della tecnica peel-blot a singole particelle è limitata e può essere testata per quelle che richiedono pellicola di carbonio e sono stabili alla manipolazione. I campioni con interazioni biologiche critiche tra gli strati potrebbero non essere adatti per la caratterizzazione con l'aiuto della tecnica peel-blot a causa dell'interruzione di tali interazioni.

La tecnica peel-blot ("peel-blot") viene ottimizzata più rapidamente testando e vagliando con macchie negative o campioni non colorati da TEM a temperatura ambiente. Una volta identificato il numero ottimale di iterazioni peel-blot, è possibile determinare il tempo necessario per controllare lo spessore prima della vetrificazione.

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Protocollo

1. Fasi di preparazione per la tecnica peel-blot

Nota : la preparazione richiede che i seguenti elementi siano posizionati adiacenti l'uno all'altro.

1. Impilare due pezzi di carta da filtro da 20-25 μm (vedi Tabella dei materiali).
2. Posizionare un film di paraffina lungo ~ 8 cm x 10 cm adiacente alla carta da filtro con la carta rivolta verso l'alto.
3. Posizionare un pezzo di carta da filtro submicron sopra altri due pezzi di carta da filtro #4 (Figura 1-1).
4. Posizionare la pinza anti-capillare con la gamba piegata rivolta verso l'alto e la gamba dritta rivolta verso il basso. Quindi, selezionare una griglia a 600 maglie con il lato liscio / lucido verso l'alto. Posizionare la pinza su una piastra di Petri o su un'altra superficie rialzata per evitare il contatto della griglia pulita con altri oggetti.
5. Rimuovere la carta dal film di paraffina e tirare i lati (~ 5 mm) per creare un piccolo bordo. Pipettare due gocce da 150 μL di soluzione di trealosio al 4% ~1-2 cm da un lato corto del film di paraffina e ~1 cm di distanza sul film di paraffina.
6. Su una panca separata o sul pavimento, versare azoto liquido in un piccolo contenitore di polistirene espanso (vedi Tabella dei materiali).
   ATTENZIONE: Ricevere una formazione per una corretta manipolazione utilizzando guanti e una visiera per evitare il morso di gelo.
7. Posizionare un piccolo contenitore griglia crio-EM nell'azoto liquido e coprire il contenitore in polistirene espanso con salviette prive di lanugine.

2. Posizionamento del film di carbonio sulla griglia

1. Utilizzare la pinza Dumont #5 (vedi Tabella dei materiali) per far galleggiare il film di carbonio dalla mica toccando un lato della mica con una leggera angolazione verso il basso (~ 20 ° -40 °) su una delle gocce di soluzione di trealosio e lentamente lasciare che la tensione dell'acqua si sollevi dal film di carbonio spostando la mica verso il basso. Rilasciare la mica una volta che il film di carbonio galleggia sulla superficie della goccia.
2. Ispezionare visivamente il film di carbonio per evitare l'uso di carbonio con danni sotto forma di fratture.
3. Inserire la griglia tenuta dalla pinza anti-capillare con un angolo (~20°-30°) in una goccia di trealosio in una posizione adiacente e quindi centrata sotto il film di carbonio. Raccogliere il film di carbonio (Figura 1-2).
4. Mantenere la griglia nello stesso orientamento e abbassarla lentamente sulla superficie della seconda goccia di trealosio senza rompere la tensione superficiale della goccia per rimuovere la pellicola di carbonio non necessaria che potrebbe essersi avvolta attorno al bordo della griglia sul lato ruvido.

3. Separazione di cristalli 2D multistrato in singoli strati

1. Ruotare le pinze anti-capillari (vedi Tabella dei materiali) e posizionarle su una piastra di Petri con il lato in carbonio della griglia rivolto verso il basso (Figura 1-3).
2. Pipettare 1,3 μL del campione nel leggero menisco del trealosio sulla parte superiore della griglia. Pipettare la soluzione ~ 8-10 volte per mescolare e distribuire il trealosio e il campione su entrambi i lati della griglia.
3. Durante l'incubazione della soluzione per 1 minuto, pipettare una o più gocce da 1,7 μL di soluzione di trealosio sul film di paraffina.
4. Ruotare la griglia nella sua posizione originale con il film di carbonio rivolto verso l'alto.
5. Utilizzare la pinza anti-capillare per premere la griglia sulla carta da filtro submicronica (Figura 1-4). Una volta che la soluzione è stata assorbita dalla carta da filtro e il film di carbone è piatto, attendere 3 secondi prima di sollevare la griglia e spostarla verticalmente sulla goccia da 1,7 μL della soluzione di trealosio (Figura 1-5).
   NOTA: ripetere questo passaggio più volte per campioni altamente impilati o la griglia viene preparata per la vetrificazione nei passaggi successivi.
6. Asciugare la griglia sui due pezzi di carta da filtro, quindi sollevare la griglia dalla carta da filtro (Figura 1-6). Dopo circa 13 secondi, a seconda dell'umidità e del tampone del campione, immergere la griglia nell'azoto liquido nel piccolo contenitore di polistirolo e posizionare la griglia nel contenitore della griglia crio-EM o trasferirla direttamente per lo screening crio-EM o la raccolta dei dati.
   NOTA: Per ottimizzare rapidamente il protocollo, colorare negativamente la griglia bucciata in questa fase piuttosto che immergerla nell'azoto liquido. Colorare negativamente il campione applicando 3 μL di acetato di uranile all'1% alla griglia, incubare la griglia per 30 s e asciugarla con un pezzo strappato di carta da filtro da 20-25 μm pore. Le griglie di cristalli 2D vetrificati in trealosio, tannino o glucosio vengono regolarmente immerse a mano per la vetrificazione poiché trealosio, tannino e glucosio impediscono la formazione di ghiaccio cristallino alle velocità utilizzate per l'immersione manuale².

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Risultati

Un esperimento di successo peel-blot si tradurrà in singoli strati di campioni a concentrazioni spesso elevate. È prevedibile che alcune regioni nella maggior parte dei quadrati della griglia conterranno ancora più livelli, specialmente a un numero inferiore di iterazioni delle fasi peel-blot. La maggior parte dei quadrati della griglia, tuttavia, conterrà estese regioni di singoli strati come osservato per i cristalli 2D di leucotriene C₄ sintasi umana (Figura 2) e liposomi (aggiunti nel passaggio

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Discussione

Il peel-blot è un metodo potente per superare l'impilamento e lo spessore di cristalli 2D multistrato e campioni simili per la raccolta di dati crio-EM e l'elaborazione delle immagini. Una decisione sull'uso del peel-blot sarà basata sui parametri biologici del campione e richiederà anche una valutazione una volta che sarà disponibile un modello crio-EM 3D. L'importanza biologica dei contatti e la potenziale flessibilità delle regioni di contatto saranno particolarmente importanti in questa valutazione.

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
600-mesh grids	SPI	2060-C-XA
Anti-capillary forceps	Ted Pella	510-5
Carbon to coat mica
Cryo-EM			Cryo-EM grids may be screened at 120 kV or 200 kV.  High-resolution data is collected at 300 kV.
Dumpont #5 forceps	Ted Pella	5622
Grid box for cryo-EM storage	Ted Pella	160-40
Kim Wipes
Liquid nitrogen
Mica	Ted Pella	56	The mica is carbon-coated and cut into squares that are slighlty larger than a TEM grid.  The carbon thickness may require optimization to avoid thin carbon that breaks easily upon multiple peel blots.
Negative stain			1-2% uranyl acetate is suitable for many samples.  Other stains such as phosphotungstic acid can be substituted.
Parafilm
Polystyrene container			Used for vitrifying the peel-blot grid. A polystyrene shipping container can be recycled for this purpose and lined with aluminium foil.
Submicron filter paper	MilliporeSigma	DAWP04700
Transmission electron microscope	JEOL	JEM-1400	Any TEM operated at an accelerating voltage of 80-120 kV will be suitable for screening of negatively stained grids.
Trehalose			Prepare 4% trehalose solution.
Whatman #4 filter paper	MilliporeSigma	WHA1004150	This corresponds to the 20-25 μm pore size filter paper in the protocol.