שימוש באלקטרודה דו-קוטבית ליצירת מודל עכבר אפילפסיה של האונה הרקתית על ידי הצתה חשמלית של האמיגדלה

Summary

האמיגדלה ממלאת תפקיד מפתח באפילפסיה של האונה הרקתית, שמקורה במבנה זה ומתפשטת ממנו. מאמר זה מספק תיאור מפורט של ייצור אלקטרודות מוח עמוקות עם פונקציות הקלטה וגירוי כאחד. הוא מציג מודל של אפילפסיה של האונה הרקתית האמצעית שמקורה באמיגדלה.

Abstract

האמיגדלה היא אחד המקורות הנפוצים ביותר של התקפים, ומודל עכבר האמיגדלה חיוני להמחשה של אפילפסיה. עם זאת, מחקרים מעטים תיארו את פרוטוקול הניסוי בפירוט. מאמר זה ממחיש את כל התהליך של יצירת מודל אפילפסיה של הצתה חשמלית באמיגדלה, עם הצגת שיטה לייצור אלקטרודות דו-קוטביות. אלקטרודה זו יכולה גם לגרות וגם להקליט, ולהפחית פגיעה מוחית הנגרמת על ידי השתלת אלקטרודות נפרדות לגירוי והקלטה. למטרות הקלטה ארוכות טווח של אלקטרואנצפלוגרם (EEG), טבעות החלקה שימשו כדי למנוע את הפרעה להקליט הנגרמת על ידי סבכי כבלים ונפילה.

לאחר גירוי תקופתי (60 הרץ, שנייה אחת כל 15 דקות) של האמיגדלה הבזולטרלית (AP: 1.67 מ"מ, L: 2.7 מ"מ, V: 4.9 מ"מ) במשך 19.83 ± 5.742 פעמים, נצפתה הדלקה מלאה בשישה עכברים (המוגדרת כאינדוקציה של שלושה פרקים רציפים בדרגה V המסווגים לפי סולם ראסין). EEG תוך גולגולתי נרשם לאורך כל תהליך ההדלקה, ונצפתה הפרשה אפילפטית באמיגדלה שנמשכה 20-70 שניות לאחר ההדלקה. לכן, זהו פרוטוקול חזק למידול אפילפסיה שמקורה באמיגדלה, והשיטה מתאימה לחשיפת תפקידה של האמיגדלה באפילפסיה של האונה הרקתית. מחקר זה תורם למחקרים עתידיים על המנגנונים של אפילפסיה של האונה הרקתית המזיאלית ותרופות אנטי-אפילפטוגניות חדשניות.

Introduction

אפילפסיה של האונה הרקתית (TLE) היא סוג האפילפסיה השכיח ביותר ויש לה סיכון גבוה להמרה לאפילפסיה עמידה לתרופות. ניתוח, כגון amygdalohippocampectomy סלקטיבי, הוא טיפול יעיל עבור TLE, ואת epileptogenesis ו ictogenesis של המחלה עדיין תחת חקירה ^1,2. פתוגנזה של TLE הוכחה להתרחש לא רק בהיפוקמפוס אלא גם באופן נרחב באמיגדלה ^3,4. לדוגמה, הן טרשת אמיגדלה והן הגדלת אמיגדלה דווחו לעתים קרובות כמקור של התקפי TLE ^5,6. אי אפשר להמעיט בחשיבותה של האמיגדלה; מודל אמיגדלה חיוני לחקר אפילפטוגנזה, ויש צורך דחוף בהמחשה ברורה של מודל זה.

הוצעו מספר גישות לגרימת התקפים במודלים של בעלי חיים. בעבר, תרופות פרכוסיות הוזרקו תוך צפקית בשלב מוקדם⁷. למרות ששיטה זו הייתה נוחה, מיקומם של מוקדים אפילפטיים לא היה ברור. עם התפתחות הטכנולוגיה הסטריאוטקטית ואטלס מוח מפורט של בעלי חיים, יושמה הזרקת תרופות תוך גולגולתית לפתרון בעיית הלוקליזציה⁸. עם זאת, חוסר התערבות בהתקפים קשים בשלב החריף הביא לשיעור תמותה גבוה, והתקפים ספונטניים כרוניים לוו בבעיה של אינטריקטל לא יציב ותדירות התקפים ^9,10. לבסוף פותחה שיטת ההדלקה החשמלית; שיטה זו מגרה מעת לעת אזורים מסוימים במוח מספר פעמים, ומאפשרת לגרום להתקפים עם שליטה מוגדרת הן במיקום והן בזמן ההתחלה¹¹.

היתרון של שיטה זו הוא שההשתלה התוך גולגולתית של אלקטרודות היא זעיר פולשנית¹². יתר על כן, חומרת ההתקף ניתנת לשליטה על ידי הפסקת הגירויים, מה שמקטין את התמותה הנגרמת על ידי ההתקפים. שינויים אלה פתרו את החסרונות של הגישות הקודמות. יש לציין כי מודל זה יכול לחקות כראוי התקפים אנושיים והוא מתאים במיוחד לחקר סטטוס אפילפטיקוס (SE) בשל יכולתו לגרום לחומצה סליצילית במהירות¹³. זה יכול לשמש גם לבדיקת תרופות אנטי אפילפטיות¹⁴ ובמחקרים על מנגנון האפילפסיה. לבסוף, ידוע היטב שהאמיגדלה קשורה קשר הדוק עם אפנון זיכרון, עיבוד תגמול ורגש¹⁵. הפרעות של תפקודים מנטליים אלה נתקלים לעתים קרובות בחולי אפילפסיה, ולכן, מודל אפילפסיה של האמיגדלה עשוי להיות בחירה טובה יותר לחקר בעיות רגשיות באפילפסיה¹⁶.

Protocol

ניסוי זה אושר על ידי ועדת האתיקה הניסויית של בעלי חיים בבית החולים Xuanwu, האוניברסיטה הרפואית של הבירה. כל העכברים הוחזקו במעבדת החיות של בית החולים Xuanwu, האוניברסיטה הרפואית של הבירה. פרוטוקול זה מחולק לארבעה חלקים. שני החלקים הראשונים מציגים את שיטת בניית האלקטרודה והמעגל החשמלי באמצעות טבעת החלקה לחיבור האלקטרודות וציוד הקלטה/גירוי EEG. החלק השלישי מתאר את שיטת הפעולה של השתלת אלקטרודות, והחלק הרביעי מציג את פרמטרי הרישום והגירוי של EEG המשמשים למודל אפילפסיה של האמיגדלה.

1. ייצור אלקטרודות

1. שמור את החומרים הבאים מוכנים מראש: שתי חתיכות באורך 3 ס"מ של חוט טונגסטן מצופה טפלון (קוטר חשוף: 76.2 מיקרומטר), חתיכה אחת של חוט כסף (קוטר חשוף: 127 מיקרומטר) באותו אורך, וסט אחד של 2 x 2 פיני שורה מודדים.
2. השתמש במצית כדי לשרוף קצה אחד של כל חוט טונגסטן כדי להסיר 5 מ"מ מציפוי הבידוד.
   הערה: חוט הטונגסטן עם הבידוד שהוסר הופך לשחור; חלק זה של חוט הטונגסטן מכונה הקצה העליון.
3. מקלפים קטע של חוט רב-גדילי דק במיוחד ועוטפים אותו מלמטה לקצה העליון, שם מתחיל להחשיך, וממשיכים למעלה. שלבו את החוט הסופר-דק הזה (בעל מרקם רך) עם חוט הטונגסטן על ידי צביטה של קצה אחד וסיבוב עדין של הקצה השני, מה שמאפשר לחבר בקלות את שני החומרים יחד.
4. משוך בעדינות כדי לוודא שהם עטופים היטב וחתכו חוטים עדינים עודפים. נסו לשמור על חוט טונגסטן ישר לאורך כל התהליך.
5. קבע את סיכת השורה למהדק בשולחן הריתוך כאשר הצד הארוך יותר של הפינים פונה כלפי חוץ. השתמש במחט המזרק כדי להרים משחת הלחמה ולמרוח אותה על הסיכות. מחממים את לפיד הריתוך ל 320 מעלות צלזיוס; ממיסים ומרחו חוט פח נטול עופרת עם קצה הלפיד.
6. חפפו את הקצה העליון של חוט הטונגסטן עם מחט אחת של פיני השורה והשתמשו בהלחמה שעל הפנס כדי לחבר את חוט הטונגסטן לסיכה.
   הערה: יהיה קשה מאוד לרתך את חוט הטונגסטן ישירות עם הפינים ללא עזרת החוט הדק.
7. רתכו חוט טונגסטן נוסף וחוט כסף נוסף לסיכת השורה באותו אופן, כך שכל חוט יתאים למחט (ראו איור 1,i).
8. חותכים שני צינורות מתכווצים בחום מעט יותר מהקצה העליון של חוט הטונגסטן. שים אותם על מפרק הלחמה של שני חוטי טונגסטן, להבטיח כי החלק המוליך מכוסה במלואו בצינור, כך המעגל של שני חוטי טונגסטן אינו ממוקם בסדרה.
   הערה: למרות שיש שלושה חוטים, אם שניים מהם מבודדים, שלושת החוטים לא יהיו בסדרה; ניתן להוסיף גם צינור לחוט הכסף.
9. הסר את האלקטרודה מהדק שולחן הריתוך והחזק את האלקטרודה בעדינות עם צבת גדולה, שכן קל לאלקטרודות לאבד את צורתן בעת חימום הצינור הניתן לכיווץ, באמצעות מהדק מוליכות תרמית טובה עם מעט יותר כוח.
10. הפעל את צינור האוויר וחמם עד לטמפרטורה של 320 מעלות צלזיוס. נשפו את הצינור המתכווץ בחום למשך מספר שניות עד שהוא מהודק (ראו איור 1,ii).
11. אם המחטים נפרדות מגוף הפלסטיק במהלך תהליך הריתוך, חתכו את חלק הריתוך ואת גוף הפלסטיק בעזרת דבק מותך חם (ראו איור 1,iii). היזהר לא למרוח אותו על הממשק מכיוון שזה ישפיע על הכנסת הממשק.
12. החזיקו את שני חוטי הטונגסטן וסובבו אותם יחד, תוך שמירה על הקצוות שלהם בנפרד (ראו איור 1,iv). חתכו את חוטי הטונגסטן המעוותים לאורך של כ-10 מ"מ, כך שההפרדה בקצוות לא תעלה על 0.5 מ"מ.
    הערה: ניתן לבצע שלב זה גם לפני השתלת אלקטרודה כדי לאפשר התאמה גמישה של אורך האלקטרודה.
13. מחממים את אקדח הדבק ומורחים את הדבק באופן שווה סביב האלקטרודה.
14. בדוק את האלקטרודות עם מולטימטר: הנח מוט אחד של המולטימטר בצד הלא מרותך של פיני השורות, וגע בעדינות בקצה חוט טונגסטן או חוט כסף למוט השני, בדוק אם המעגל חלק. ודא שהקווים אינם ממוקמים בסדרות.

2. חיבור טבעת החלקה ותיאור מעגל

הערה: כאשר האלקטרודות על העכברים מחוברות להתקן EEG באמצעות כבלים במצב תנועה חופשית, הכבלים יכולים להסתבך כאשר העכברים נעים ומסתובבים. זה גורם לכבלים להיות קצרים יותר, ובסופו של דבר מפריע לעכברים לזוז או גורם לכבלים ליפול מראשיהם. בשיטה המתוארת כאן, טבעת החלקה בעלת ארבעה ערוצים מוצגת כדי למנוע את נפילת הכבלים. ארבעת הערוצים מיוצגים בארבעה צבעים באיור 1B.

1. יש לקלף 5 מ"מ מהעור המבודד בכל קצה כדי לחשוף את חוט המתכת שבתוכו.
2. הוסף קטע של צינור מתכווץ בחום לכל חוט סטטור.
3. רתך כל חוט באמצעות תקע מחבר התקן EEG.
4. כווצו את הצינור המתכווץ בחום עם אוויר חם.
5. הוסף קטע של צינור מתכווץ בחום לכל חוט רוטור.
6. הברג את החלקים המוליכים של החוטים האדומים והכתומים יחד ורתך אותם למפרק בכותרת כדי להתאים לסיכת השורה.
7. רתכו את שני החוטים האחרים על הכותרת לכל מפרק.
   הערה: התעלה החומה המתאימה לחוט הכסף מחוברת למכשיר EEG להארקה. הערוצים האדומים והכתומים מקבלים אותות מאותו חוט טונגסטן, והערוץ הכתום משמש כנקודת ייחוס למכשיר ה-EEG. האותות בערוץ האדום הם חסרי משמעות, אך הם חייבים להתקיים יחד עם הערוץ השחור כדי ליצור גירוי נוכחי. האותות בערוץ השחור הם האותות החשמליים האמיתיים במוח. ניתן לתכנן מעגלים שונים עם טבעות החלקה רב ערוציות כך שיתאימו למכשירים שונים.

3. ניתוח להשתלה

1. חיות
   1. יש להשתמש בעכברי בר זכרים בני 8 שבועות מסוג C57BL/6, במשקל 24-26 גרם, לניתוחים.
   2. אחסנו אותם עם מחזור אור-חושך של 12 שעות (זמן אור: 8:00-20:00) בסביבה מבוקרת טמפרטורה (22 ± 1 מעלות צלזיוס) וספקו מים והזנה עד לליביטום.
   3. השתמש בשטיחון חום נוסף כדי לשמור על חום בעלי החיים במהלך הניתוח.
   4. לאחר הניתוח, להזריק meloxicam תת עורית (10 מ"ג / ק"ג) כמו מתן הראשון של משככי כאבים. לאחר מכן, הניחו את בעלי החיים בכלובים נפרדים כדי לייעל את ההתאוששות. הוסף meloxicam לתזונה של החיה בשבוע הראשון לאחר הניתוח.
   5. לאחר הניסוי, להחדיר את החדרים השמאליים של העכברים עם 4% paraformaldehyde תחת הרדמה, ולאסוף את רקמות המוח לאימות היסטולוגי של המטרה אלקטרודה.
2. לשקול את העכבר להרדים אותו על ידי הזרקה intraperitoneal של 1% פתרון pentobarbital. לעקר את כל כלי הניתוח והחומרים המתכלים שיש להשתמש בהם, כולל מקדחים, אלקטרודות, מלט דנטלי וכו ', על ידי autoclaving.
3. כאשר העכבר מורדם לחלוטין, לגלח את השיער מהעין לאזור האוזן עם סכין גילוח.
4. תקן את העכבר על המסגרת הסטריאוטקסית. הכניסו את השיניים העליונות הקדמיות למוט החותכת והכניסו את שני פסי האוזניים באופן שווה עמוק לתוך האוזניים. החל משחת עיניים אריתרומיצין על העיניים כדי למנוע יובש ועיוורון הנגרם על ידי אור בהיר במהלך הניתוח.
5. יש לחטא את אזור הניתוח בשלושה מקלונים מתחלפים של יודופור ו-75% אלכוהול בתנועה מעגלית. לאחר מכן, בצע חתך sagittal קדימה מאמצע חתך זה, לחתוך את העור משני הצדדים של החתך כדי ליצור חלון משולש.
6. גלגלו חתיכת כותנה קטנה לכדור והרטיבו אותה במי חמצן 3%. הסר את הרקמה הרכה המחוברת לגולגולת על ידי שפשוף עדין של האזור החשוף עם כדור צמר גפן קטן עד שהפונטנל הקדמי והאחורי נראים בבירור.
7. התאימו את הגבהים הקדמיים והאחוריים כך שהפונטנל הקדמי והאחורי יהיה במצב אופקי. שקול את המיקום של פונטנל קדמי להיות המקור של הצירים.
8. קבע בורג נירוסטה לגולגולת המוח הקטן השמאלית, באמצעות מקדחה ליצירת משטח שטוח. ודא שהבורג בולט באמצע הדרך החוצה מהגולגולת.
9. ודא שהקואורדינטות להדלקת האמיגדלה הן -1.67 מ"מ אחורי, -2.7 מ"מ רוחבי, ו -4.9 מ"מ גחוני מהברגמה. התאם את ההתקן הסטריאוטקסי כדי לאתר נקודה זו ולסמן אותה.
10. קדח חור במקום המסומן עם מקדח גולגולת בקוטר 0.5 מ"מ.
11. מקבעים את האלקטרודות למוט האיתור של המכשיר הסטריאוטקסי, מניחים את האלקטרודה במאונך מעל החור, ומורידים את המיקום ל -4.9 מ"מ לאט. לעטוף את חוט הכסף סביב הבורג שלוש פעמים, נזהר לא לטלטל את גוף האלקטרודה במהלך הפעולה.
12. מערבבים את המלט הדנטלי ומורחים אותו בעדינות על משטח האלקטרודה והגולגולת. כאשר המלט הדנטלי מתקשה, שנו את החלק החיצוני עד שהמלט התוחם את האלקטרודה הקבועה יהפוך לחרוט.
13. כאשר המלט התקשה, שחררו את האלקטרודה מהמכשיר הסטריאוטקסי. תת עורית לתת meloxicam 10mg / kg כדי להקל על אי נוחות הנגרמת על ידי כאב אצל בעלי חיים. מתן meloxicam מזון מן החי עבור אפקט משכך כאבים בשבוע הראשון לאחר הניתוח. הסר את העכבר והחזיר אותו לכלוב, תוך שמירה על הפרדה משאר העכברים.

4. הדלקה חשמלית

1. אפשרו לעכברים לנוח לפחות שבוע לאחר הניתוח לפני ההדלקה כדי לאפשר התאוששות לאחר הניתוח ולאפשר לדלקת לשכך.
   הערה: באופן כללי, עכברים שלא התאוששו כראוי אינם מגיבים היטב להדלקה.
2. הכנס את העכבר לקופסה מותאמת אישית עם כבלי טבעת החלקה המחברים את האלקטרודה שעל ראש העכבר ואת התקן ה- EEG. העבר את הכבל דרך חור במכסה הקופסה והתאם את האורך שנותר בתיבה כדי לאפשר לעכבר לנוע בחופשיות.
3. הפעל את מכשיר ה- EEG ובדוק אם הוא פועל כראוי. הגדר את הממריץ לספק פולסים של גל מרובע מונופאזי של 1 אלפית השנייה ב- 60 הרץ למשך רכבת של 1 שניות.
4. התחל עם עוצמת זרם של 50 μA עבור הגירוי הראשון; לפקח על EEG עבור פריקה לאחר פריקה, אשר מאופיין קוצים בתדירות גבוהה. אם לא נצפתה פריקה לאחר מכן, הוסף 25 μA לגירוי הבא, והמשך בתהליך זה כל 10 דקות עד שנצפתה פריקה שלאחר מכן ונמשכת 5 שניות.
   הערה: אם הניסוי אינו דורש פריקה, ניתן לדלג על שלב 4.4; 300 μA חזק מספיק להדלקה.
5. לעורר את העכבר עם עוצמת הנוכחי שנקבעה בשלב 4.3 כל 15 דקות, לא יותר מ 20 פעמים ביום.
6. עקוב אחר התגובות ההתנהגותיות לגירוי.
   הערה: הופעתם של שלושה פרקים רצופים בדרגה V נחשבת להדלקה מלאה, בשילוב עם תקן ראסין דרגה¹⁷.

תוצאות

האלקטרודה והמעגל מאפשרים ל-EEG להיקלט ולתפקד כגירוי (איור 1); מערך זה מונע את המורכבות של השתלת אלקטרודות, הקלטה וגירוי בנפרד וממזער את הנזק לרקמת המוח. יישום טבעות החלקה מאפשר חיבור אלקטרודות עם כל סוגי המכשירים.

ביצענו ניתוח השתלת אלקטרודות בשישה עכברים בוגר...

Discussion

אפילפסיה היא קבוצה של מחלות עם ביטויים מרובים וגורמים מגוונים¹⁸; יש לציין כי לא ניתן להשתמש במודל יחיד לכל סוגי האפילפסיה, ועל החוקרים לבחור מודל מתאים למחקר הספציפי שלהם. המחקר הנוכחי מציג את אחת השיטות הנגישות ביותר לייצור אלקטרודות. ניתן להתאים חלקים שונים של שיטה זו כדי לה?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488-conjugated Donkey anti-Rabbit IgG	invitrogen	A-21206
c-Fos antibody		ab222699
Cranial drill	SANS	SA302
dental cement	NISSIN
EEG recording and stimulation equipment	Neuracle Technology (Changzhou) Co., Ltd	NSHHFS-210803
lead-free tin wire	BAKON
Pin header/Female header	XIANMISI		spacing of 1.27 mm
Silver wire	A-M systems	786000
Slip ring	Senring Electronics Co.,Ltd	SNM008-04
Tungsten wire	A-M systems	796000
ultrafine multi-stand wire	Shenzhen Chengxing wire and cable	UL10064-FEP
welding equipment	BAKON	BK881