Amigdala'nın Elektriksel Çırası ile Temporal Lob Epilepsi Fare Modeli Oluşturmak için Bipolar Elektrot Kullanma

Özet

Amigdala, bu yapıdan kaynaklanan ve yayılan temporal lob epilepsisinde önemli bir rol oynar. Bu makale, hem kayıt hem de uyarıcı işlevlere sahip derin beyin elektrotlarının üretiminin ayrıntılı bir açıklamasını sunmaktadır. Amigdala kaynaklı medial temporal lob epilepsisinin bir modelini sunar.

Özet

Amigdala, nöbetlerin en yaygın kökenlerinden biridir ve amigdala fare modeli, epilepsinin gösterilmesi için gereklidir. Bununla birlikte, az sayıda çalışma deneysel protokolü ayrıntılı olarak tanımlamıştır. Bu yazıda, bipolar elektrot üretimi yönteminin tanıtılmasıyla amigdala elektriksel çıra epilepsi modeli yapımının tüm süreci gösterilmektedir. Bu elektrot hem uyarabilir hem de kaydedebilir, böylece stimülasyon ve kayıt için ayrı elektrotların implante edilmesinin neden olduğu beyin hasarını azaltabilir. Uzun süreli elektroensefalogram (EEG) kayıt amacıyla, kablo karmaşalarının ve düşmenin neden olduğu kayıt kesintisini ortadan kaldırmak için kontak halkaları kullanılmıştır.

Bazolateral amigdala'nın (AP: 1.67 mm, L: 2.7 mm, V: 4.9 mm) 19.83 ± 5.742 kez periyodik olarak uyarılmasından sonra (60 Hz, her 15 dakikada 1 sn), altı farede tam çıra gözlendi (Racine'in ölçeğine göre sınıflandırılan üç sürekli derece V bölümünün indüksiyonu olarak tanımlandı). Tüm çıra işlemi boyunca intrakraniyal EEG kaydedildi ve çıralama sonrası amigdala'da 20-70 s süren epileptik akıntı gözlendi. Bu nedenle, bu, amigdala kaynaklı epilepsiyi modellemek için sağlam bir protokoldür ve yöntem, temporal lob epilepsisinde amigdala'nın rolünü ortaya çıkarmak için uygundur. Bu araştırma, mesial temporal lob epilepsisinin mekanizmaları ve yeni antiepileptojenik ilaçlar üzerine gelecekteki çalışmalara katkıda bulunmaktadır.

Giriş

Temporal lob epilepsisi (TLE) en sık görülen epilepsi türüdür ve ilaca dirençli epilepsiye dönüşme riski yüksektir. Selektif amigdalohipokampektomi gibi cerrahi, TLE'nin etkili bir tedavisidir ve hastalığın epileptogenezi ve iktogenezi hala araştırılmaktadır ^1,2. TLE'nin patogenezinin sadece hipokampusta değil, amigdalada da yaygın olarak görüldüğü gösterilmiştir ^3,4. Örneğin, hem amigdala skleroz hem de amigdala büyümesi sıklıkla TLE nöbetlerinin kökenleri olarak bildirilmiştir ^5,6. Amigdala'nın önemi küçümsenemez; Epileptogenezin incelenmesi için bir amigdala modeli gereklidir ve bu modelin açık bir örneğine acilen ihtiyaç vardır.

Hayvan modellerinde nöbetleri indüklemek için çeşitli yaklaşımlar önerilmiştir. Geçmişte, konvülsan ilaçlar erken evre^7'de intraperitoneal olarak enjekte edildi. Bu yöntem uygun olmasına rağmen, epileptik odakların yeri belirsizdi. Stereotaktik teknolojinin gelişmesi ve detaylı bir hayvan beyin atlası ile lokalizasyon problemini çözmek için kafa içi ilaç enjeksiyonu uygulanmıştır⁸. Bununla birlikte, akut evrede şiddetli nöbetlere müdahale edilmemesi yüksek mortalite oranına neden olmuş ve kronik spontan nöbetlere kararsız interiktal ve nöbet sıklığı ^9,10 sorunu eşlik etmiştir. Son olarak, elektrikli çırpma yöntemi geliştirildi; Bu yöntem periyodik olarak belirli beyin bölgelerini birkaç kez uyarır ve nöbetlerin hem yerin hem de başlangıç zamanının kesin kontrolü ile indüklenmesini sağlar¹¹.

Bu yöntemin bir avantajı, elektrotların intrakraniyal implantasyonunun minimal invaziv^{olmasıdır 12}. Ayrıca, nöbetin şiddeti, uyaranların sonlandırılmasıyla kontrol edilebilir ve nöbetlerin neden olduğu mortaliteyi azaltır. Bu değişiklikler önceki yaklaşımların eksikliklerini çözdü. Özellikle, bu model insan nöbetlerini yeterince taklit edebilir ve SE'yi hızlı bir şekilde indükleme kabiliyeti nedeniyle status epileptikus (SE) çalışması için özellikle uygundur¹³. Ayrıca anti-epileptik ilaç taraması¹⁴ için ve epilepsi mekanizması üzerine çalışmalarda da kullanılabilir. Son olarak, amigdala'nın hafıza modülasyonu, ödül işleme ve duygu¹⁵ ile yakından ilişkili olduğu iyi bilinmektedir. Bu zihinsel fonksiyonların bozukluklarına epileptik hastalarda sıklıkla rastlanır ve bu nedenle amigdala epilepsi modeli, epilepsideki duygusal sorunları incelemek için daha iyi bir seçim olabilir¹⁶.

Protokol

Bu deney, Başkent Tıp Üniversitesi, Xuanwu Hastanesi Deneysel Hayvan Etik Kurulu tarafından onaylandı. Tüm fareler Başkent Tıp Üniversitesi, Xuanwu Hastanesi'nin hayvan laboratuvarında tutuldu. Bu protokol dört bölüme ayrılmıştır. İlk iki bölüm, elektrotları ve EEG kayıt / stimülasyon ekipmanını bağlamak için bir kontak halkası kullanarak elektrot ve elektrik devresini oluşturma yöntemini tanıtmaktadır. Üçüncü bölümde elektrot implantasyonunun operasyon yöntemi, dördüncü bölümde ise amigdala epilepsi modelinde kullanılan EEG kayıt ve stimülasyon parametreleri sunulmaktadır.

1. Elektrotların imalatı

1. Önceden hazırlanmış aşağıdaki malzemeleri hazır bulundurun: iki adet 3 cm uzunluğunda Teflon kaplı tungsten tel parçası (çıplak çap: 76,2 μm), aynı uzunlukta bir parça gümüş tel (çıplak çap: 127 μm) ve bir set 2 x 2 ölçülü sıra pim.
2. İzolasyon kaplamasının 5 mm'sini çıkarmak için her tungsten telin bir ucunu yakmak için bir çakmak kullanın.
   NOT: İzolasyon çıkarılmış tungsten tel siyaha döner; tungsten telinin bu kısmı üst uç olarak adlandırılır.
3. Ultra ince çok telli telin bir bölümünü soyun ve alttan üst uca doğru sarın ve kararmaya başlayın, üste doğru devam edin. Bu süper ince teli (yumuşak bir dokuya sahip) tungsten tel ile bir ucunu sıkıştırarak ve diğer ucunu hafifçe bükerek birleştirin, bu da iki malzemenin kolayca birbirine dolanması sağlanır.
4. Sıkıca sarıldıklarından emin olmak için yavaşça çekin ve fazla süper ince teli kesin. İşlem boyunca tungsten telini düz tutmaya çalışın.
5. Sıra pimini, pimlerin uzun tarafı dışa bakacak şekilde kaynak tablasındaki kelepçeye sabitleyin. Bazı lehim macunlarını almak ve pimlere uygulamak için şırınga iğnesini kullanın. Kaynak torcunu 320 °C'ye ısıtın; torç ucu ile kurşunsuz bir miktar kalay teli eritin ve sürün.
6. Tungsten telinin üst ucunu sıra pimlerinin bir iğnesiyle örtüştür ve tungsten telini pime bağlamak için meşale üzerindeki lehimi kullanın.
   NOT: Tungsten telini, süper ince telin yardımı olmadan doğrudan pimlerle kaynak yapmak çok zor olacaktır.
7. Sıra pimine başka bir tungsten teli ve başka bir gümüş teli aynı şekilde kaynak yapın, böylece her tel bir iğneye karşılık gelir (bkz. Şekil 1,i).
8. Isı ile büzülebilen iki tüpü tungsten telinin üst ucundan biraz daha uzun kesin. Bunları iki tungsten telin lehim eklemine koyun, iletken parçanın tüpün içinde tamamen kaplandığından emin olun, böylece iki tungsten telin devresi seri olarak yerleştirilmez.
   NOT: Üç tel olmasına rağmen, bunlardan ikisi yalıtılmışsa, üç tel seri olmayacaktır; gümüş tellere bir tüp de eklenebilir.
9. Elektrodu kaynak masası kelepçesinden çıkarın ve elektrodu büyük penselerle yavaşça tutun, çünkü büzülebilir tüpü ısıtırken elektrotların şekillerini kaybetmeleri kolaydır, biraz daha fazla kuvvete sahip iyi bir termal iletkenlik kelepçesi kullanarak.
10. Hava kanalını açın ve 320 °C sıcaklığa ulaşana kadar ısıtın. Isı ile büzülebilen tüpü sıkılana kadar birkaç saniye üfleyin (bkz. Şekil 1,ii).
11. Kaynak işlemi sırasında iğneler plastik gövdeden ayrılırsa, kaynak parçasını ve plastik gövdeyi sıcak eriyik yapıştırıcı ile ekleyin (bkz. Şekil 1,iii). Arabirim eklemeyi etkileyeceğinden, arabirime bulaştırmamaya dikkat edin.
12. İki tungsten teli tutun ve uçlarını birbirinden ayrı tutarak bir araya getirin (bkz. Şekil 1,iv). Bükülmüş tungsten telleri yaklaşık 10 mm uzunluğa kadar kesin, böylece uçlardaki ayırma 0,5 mm'yi geçmez.
    NOT: Bu adım, elektrot uzunluğunun esnek bir şekilde ayarlanmasını sağlamak için elektrot implantasyonundan önce de gerçekleştirilebilir.
13. Tutkal tabancasını ısıtın ve yapıştırıcıyı elektrotun etrafına eşit şekilde uygulayın.
14. Elektrotları bir multimetre ile kontrol edin: multimetrenin bir çubuğunu sıra pimlerinin kaynaksız tarafına yerleştirin ve devrenin pürüzsüz olup olmadığını kontrol ederek tungsten telinin veya gümüş telin ucunu diğer çubuğa hafifçe dokunun. Çizgilerin seri olarak yerleştirilmediğinden emin olun.

2. Kontak halkası bağlantısı ve devre açıklaması

NOT: Fareler üzerindeki elektrotlar, serbest hareket eden bir durumda kablolar aracılığıyla bir EEG cihazına bağlandığında, fareler hareket ettikçe ve döndükçe kablolar karışabilir. Bu, kabloların kısalmasına neden olur, sonunda farelerin hareket etmesini engeller veya kabloların kafalarından düşmesine neden olur. Burada açıklanan yöntemde, kabloların düşmesini önlemek için dört kanallı bir kontak halkası tanıtılmıştır. Dört kanal, Şekil 1B'de dört renkte gösterilmiştir.

1. İçindeki metal teli açığa çıkarmak için her iki uçtaki yalıtım derisinin 5 mm'sini soyun.
2. Her stator teline bir parça ısı ile büzülebilir tüp ekleyin.
3. Her kabloyu EEG aygıt konektörü fişi ile kaynaklayın.
4. Isıl büzülebilir tüpü sıcak hava ile küçültün.
5. Her rotor teline bir parça ısı ile büzülebilir tüp ekleyin.
6. Kırmızı ve turuncu tellerin iletken parçalarını birbirine vidalayın ve sıra pimine sığacak şekilde başlıktaki bir bağlantıya kaynak yapın.
7. Başlıktaki diğer iki teli her bir bağlantıya kaynaklayın.
   NOT: Gümüş kabloya karşılık gelen kahverengi kanal, topraklama için EEG cihazına bağlanır. Kırmızı ve turuncu kanallar aynı tungsten telden sinyal alır ve turuncu kanal EEG cihazı için referans görevi görür. Kırmızı kanaldaki sinyaller anlamsızdır, ancak mevcut bir uyaran oluşturmak için siyah kanalla bir arada bulunmaları gerekir. Siyah kanaldaki sinyaller beyindeki gerçek elektrik sinyalleridir. Farklı cihazlara uyacak şekilde çok kanallı kontak halkaları ile farklı devreler tasarlanabilir.

3. İmplantasyon cerrahisi

1. Hayvan
   1. Ameliyatlar için 24-26 g ağırlığında 8 haftalık C57BL/6 vahşi tip erkek fareler kullanın.
   2. Onları sıcaklık kontrollü bir ortamda (22 ± 1 °C) 12 saatlik bir açık-karanlık döngüsü (ışık süresi: 8:00-20:00) ile barındırın ve su sağlayın ve ad libitum besleyin.
   3. Ameliyat sırasında hayvanları sıcak tutmak için ekstra bir ısı paspası kullanın.
   4. Ameliyattan sonra, analjeziklerin ilk uygulaması olarak deri altından (10 mg / kg) meloksikam enjekte edin. Ardından, iyileşmeyi optimize etmek için hayvanları ayrı kafeslere yerleştirin. Ameliyattan sonraki ilk hafta boyunca hayvanın diyetine meloksikam ekleyin.
   5. Deneyden sonra, farelerin sol ventriküllerini anestezi altında% 4 paraformaldehit ile aşılayın ve elektrot hedefinin histolojik doğrulaması için beyin dokularını toplayın.
2. Fareyi tartın ve% 1 pentobarbital çözeltinin intraperitoneal enjeksiyonu ile anestezi yapın. Matkap uçları, elektrotlar, diş çimentosu vb. dahil olmak üzere kullanılacak tüm cerrahi aletleri ve sarf malzemelerini otoklavlama ile sterilize edin.
3. Fare tamamen uyuşturulduğunda, saçları gözden kulak bölgesine tıraş ederek tıraş edin.
4. Fareyi stereotaksik çerçeveye sabitleyin. Ön üst dişleri kesici çubuğa yerleştirin ve her iki kulak çubuğunu da kulaklara eşit derecede derin yerleştirin. Ameliyat sırasında parlak bir ışığın neden olduğu kuruluk ve körlüğü önlemek için gözlere eritromisin göz merhemi uygulayın.
5. Cerrahi bölgeyi dairesel bir hareketle üç alternatif iyodofor çubuğu ve% 75 alkol ile dezenfekte edin. Ardından, bu insizyonun ortasından ileriye doğru bir sagital kesi yapın ve üçgen bir pencere oluşturmak için insizyonun her iki tarafındaki cildi kesin.
6. Küçük bir pamuk parçasını bir topun içine yuvarlayın ve% 3 hidrojen peroksit ile ıslatın. Ön ve arka fontanel açıkça görülene kadar açıkta kalan bölgeyi küçük bir pamuk topu ile hafifçe ovalayarak kafatasına bağlı yumuşak dokuyu çıkarın.
7. Ön ve arka yükseklikleri, ön ve arka fontanel yatay konumda olacak şekilde ayarlayın. Ön fontanelin konumunun eksenlerin kökeni olduğunu düşünün.
8. Düz bir yüzey oluşturmak için bir matkap kullanarak sol serebellar kafatasına paslanmaz çelik bir vida sabitleyin. Vidanın kafatasının yarısına kadar çıkıntı yaptığından emin olun.
9. Amigdala çırası için koordinatların bregmadan -1.67 mm posterior, -2.7 mm lateral ve -4.9 mm ventral olduğundan emin olun. Bu noktayı bulmak ve işaretlemek için stereotaksik cihazı ayarlayın.
10. 0,5 mm çapında kafatası matkabı ile işaretli noktaya bir delik açın.
11. Elektrotları stereotaksik cihazın konumlandırma çubuğuna sabitleyin, elektrodu dikey olarak deliğin üzerine yerleştirin ve konumu yavaşça -4,9 mm'ye bırakın. Gümüş teli vidanın etrafına üç kez sarın, çalışma sırasında elektrot gövdesini sallamamaya dikkat edin.
12. Diş çimentosunu karıştırın ve yavaşça elektrot ve kafatası yüzeyine uygulayın. Diş çimentosu sertleştiğinde, sabit elektrodu çevreleyen çimento bir koniye dönüşene kadar dışını değiştirin.
13. Çimento sertleştiğinde, elektrodu stereotaksik cihazdan serbest bırakın. Hayvanlarda ağrının neden olduğu rahatsızlığı gidermek için deri altından meloksikam 10mg / kg uygulanır. Ameliyattan sonraki ilk hafta içinde analjezik etki için hayvan yemlerine meloksikam uygulayın. Fareyi çıkarın ve diğer farelerden ayrı tutarak kafese geri yerleştirin.

4. Elektrikli çıra

1. Postoperatif iyileşmeye izin vermek ve iltihabın azalmasına izin vermek için farelerin ameliyattan sonra çıralamadan önce en az 1 hafta dinlenmesine izin verin.
   NOT: Genel olarak, yeterince iyileşmemiş fareler çıralamaya iyi yanıt vermez.
2. Fareyi, elektrodu farenin kafasına ve EEG cihazına bağlayan kontak halkalı kablolarla özelleştirilmiş bir kutuya koyun. Kabloyu kutunun kapağındaki bir delikten geçirin ve farenin serbestçe hareket etmesini sağlamak için kutuda kalan uzunluğu ayarlayın.
3. EEG cihazını açın ve düzgün çalışıp çalışmadığını kontrol edin. Stimülatörü, 1 s tren süresi boyunca 60 Hz'de 1 ms monofazik kare dalga darbesi verecek şekilde ayarlayın.
4. İlk stimülasyon için 50 μA'lık bir akım yoğunluğu ile başlayın; EEG'yi, yüksek frekanslı ani artışlarla karakterize edilen deşarj sonrası için izleyin. Akıntı sonrası gözlenmezse, bir sonraki uyarana 25 μA ekleyin ve bir sonraki deşarj gözlenene ve 5 s sürene kadar her 10 dakikada bir bu işleme devam edin.
   NOT: Deney bir deşarj gerektirmiyorsa, adım 4.4 atlanabilir; 300 μA çıra için yeterince güçlüdür.
5. Fareyi, günde en fazla 20 kez, her 15 dakikada bir adım 4.3'te belirlenen akım yoğunluğuyla uyarın.
6. Uyarana verilen davranışsal tepkileri izleyin.
   NOT: Ardışık üç derece V bölümünün ortaya çıkması, Racine rütbe standardı¹⁷ ile birlikte tam çıra olarak kabul edilir.

Sonuçlar

Elektrot ve devre, EEG'nin kaydedilmesini ve bir stimülasyon olarak işlev görmesini sağlar (Şekil 1); Bu kurulum, kayıt ve uyarıcı elektrotların ayrı ayrı implante edilmesinin karmaşıklığını önler ve beyin dokusuna verilen hasarı en aza indirir. Kontak halkalarının uygulanması, her türlü cihazla elektrot bağlantısına izin verir.

Altı sağlıklı yetişkin erkek C57BL/6 fareye elektrot implantasyon ameliyatı yaptık ve ameliyattan 2 haf...

Tartışmalar

Epilepsi, birden fazla belirtisi ve çeşitli nedenleri olan bir grup hastalıktır¹⁸; Tüm epilepsi türleri için tek bir modelin kullanılamayacağı ve araştırmacıların kendi özel çalışmaları için uygun bir model seçmeleri gerektiği belirtilmelidir. Bu çalışma, elektrot üretiminin en erişilebilir yöntemlerinden birini tanıtmaktadır. Bu yöntemin çeşitli bölümleri, farklı deneysel koşullara uyum sağlamak için ayarlanabilir.

Bu yöntem, hem...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488-conjugated Donkey anti-Rabbit IgG	invitrogen	A-21206
c-Fos antibody		ab222699
Cranial drill	SANS	SA302
dental cement	NISSIN
EEG recording and stimulation equipment	Neuracle Technology (Changzhou) Co., Ltd	NSHHFS-210803
lead-free tin wire	BAKON
Pin header/Female header	XIANMISI		spacing of 1.27 mm
Silver wire	A-M systems	786000
Slip ring	Senring Electronics Co.,Ltd	SNM008-04
Tungsten wire	A-M systems	796000
ultrafine multi-stand wire	Shenzhen Chengxing wire and cable	UL10064-FEP
welding equipment	BAKON	BK881