Utilizzo di un elettrodo bipolare per creare un modello murino per l'epilessia del lobo temporale mediante accensione elettrica dell'amigdala

Riepilogo

L'amigdala svolge un ruolo chiave nell'epilessia del lobo temporale, che ha origine e si propaga da questa struttura. Questo articolo fornisce una descrizione dettagliata della fabbricazione di elettrodi cerebrali profondi con funzioni sia di registrazione che di stimolazione. Introduce un modello di epilessia del lobo temporale mediale originato dall'amigdala.

Abstract

L'amigdala è una delle origini più comuni delle convulsioni e il modello murino dell'amigdala è essenziale per l'illustrazione dell'epilessia. Tuttavia, pochi studi hanno descritto il protocollo sperimentale in dettaglio. Questo articolo illustra l'intero processo di creazione di modelli di epilessia elettrica di accensione dell'amigdala, con l'introduzione di un metodo di fabbricazione di elettrodi bipolari. Questo elettrodo può sia stimolare che registrare, riducendo le lesioni cerebrali causate dall'impianto di elettrodi separati per la stimolazione e la registrazione. Per scopi di registrazione dell'elettroencefalogramma a lungo termine (EEG), sono stati utilizzati collettori rotanti per eliminare l'interruzione della registrazione causata da grovigli di cavi e cadute.

Dopo stimolazione periodica (60 Hz, 1 s ogni 15 minuti) dell'amigdala basolaterale (AP: 1,67 mm, L: 2,7 mm, V: 4,9 mm) per 19,83 ± 5,742 volte, è stata osservata un'accensione completa in sei topi (definita come induzione di tre episodi continui di grado V classificati dalla scala di Racine). Un EEG intracranico è stato registrato durante l'intero processo di accensione e una scarica epilettica nell'amigdala della durata di 20-70 s è stata osservata dopo l'accensione. Pertanto, questo è un protocollo robusto per modellare l'epilessia proveniente dall'amigdala e il metodo è adatto per rivelare il ruolo dell'amigdala nell'epilessia del lobo temporale. Questa ricerca contribuisce a studi futuri sui meccanismi dell'epilessia del lobo temporale mesiale e di nuovi farmaci antiepilettogeni.

Introduzione

L'epilessia del lobo temporale (TLE) è il tipo più diffuso di epilessia e ha un alto rischio di conversione in epilessia resistente ai farmaci. La chirurgia, come l'amigdaloippocampectomia selettiva, è un trattamento efficace per la TLE e l'epilettogenesi e l'ictogenesi della malattia sono ancora oggetto di indagine ^1,2. È stato dimostrato che la patogenesi della TLE si verifica non solo nell'ippocampo, ma anche ampiamente nell'amigdala ^3,4. Ad esempio, sia la sclerosi dell'amigdala che l'allargamento dell'amigdala sono stati frequentemente riportati come le origini delle crisi di TLE ^5,6. L'importanza dell'amigdala non può essere sottovalutata; Un modello di amigdala è essenziale per lo studio dell'epilettogenesi e una chiara illustrazione di questo modello è urgentemente necessaria.

Sono stati proposti diversi approcci per indurre convulsioni in modelli animali. In passato, i farmaci convulsivi venivano iniettati per via intraperitoneale in una fase precoce⁷. Sebbene questo metodo fosse conveniente, la posizione dei focolai epilettici era incerta. Con lo sviluppo della tecnologia stereotassica e un atlante cerebrale animale dettagliato, l'iniezione intracranica di farmaci è stata applicata per risolvere il problema della localizzazione⁸. Tuttavia, la mancanza di intervento per le crisi gravi durante la fase acuta ha provocato un alto tasso di mortalità e le crisi spontanee croniche sono state accompagnate dal problema dell'interictale instabile e dalla frequenza delle crisi ^9,10. Infine, è stato sviluppato il metodo di accensione elettrica; Questo metodo stimola periodicamente specifiche regioni cerebrali più volte, consentendo di indurre le convulsioni con un controllo definito sia della posizione che del tempo di insorgenza¹¹.

Un vantaggio di questo metodo è che l'impianto intracranico di elettrodi è minimamente invasivo¹². Inoltre, la gravità della crisi è controllabile dalla cessazione degli stimoli, riducendo la mortalità causata dalle convulsioni. Questi cambiamenti hanno risolto le carenze degli approcci precedenti. In particolare, questo modello può imitare adeguatamente le crisi umane ed è particolarmente adatto per lo studio dello stato epilettico (SE) a causa della sua capacità di indurre rapidamente SE¹³. Può anche essere utilizzato per lo screening di farmaci antiepilettici¹⁴ e negli studi sul meccanismo dell'epilessia. Infine, è ben noto che l'amigdala è strettamente associata alla modulazione della memoria, all'elaborazione della ricompensa e alle emozioni¹⁵. I disturbi di queste funzioni mentali si incontrano spesso nei pazienti epilettici e, quindi, il modello di epilessia dell'amigdala può essere una scelta migliore per studiare i problemi emotivi nell'epilessia¹⁶.

Protocollo

Questo esperimento è stato approvato dal Comitato etico sperimentale sugli animali dell'ospedale Xuanwu, Capital Medical University. Tutti i topi sono stati tenuti nel laboratorio animale del Xuanwu Hospital, Capital Medical University. Questo protocollo è diviso in quattro parti. Le prime due parti introducono il metodo di costruzione dell'elettrodo e del circuito elettrico utilizzando un collettore rotante per collegare gli elettrodi e l'apparecchiatura di registrazione/stimolazione EEG. La terza parte descrive il metodo operativo di impianto dell'elettrodo e la quarta parte presenta i parametri di registrazione e stimolazione EEG utilizzati per il modello di epilessia dell'amigdala.

1. Fabbricazione di elettrodi

1. Tenere pronti i seguenti materiali preparati in precedenza: due pezzi lunghi 3 cm di filo di tungsteno rivestito in teflon (diametro nudo: 76,2 μm), un pezzo di filo d'argento (diametro nudo: 127 μm) della stessa lunghezza e un set di 2 perni di fila calibro.
2. Utilizzare un accendino per bruciare un'estremità di ciascun filo di tungsteno per rimuovere 5 mm del rivestimento isolante.
   NOTA: Il filo di tungsteno con l'isolamento rimosso diventa nero; Questa parte del filo di tungsteno è indicata come l'estremità superiore.
3. Sbucciare una sezione di filo multifilo ultrafine e avvolgerlo dal basso verso l'estremità superiore dove inizia a diventare scuro, continuando verso l'alto. Combina questo filo superfine (ha una consistenza morbida) con il filo di tungsteno pizzicando un'estremità e ruotando delicatamente l'altra estremità, che consente ai due materiali di essere facilmente intrecciati insieme.
4. Tirare delicatamente per assicurarsi che siano ben avvolti e tagliare il filo superfine in eccesso. Cerca di mantenere il filo di tungsteno dritto durante tutto il processo.
5. Fissare il perno della fila al morsetto sul tavolo di saldatura con il lato più lungo dei perni rivolto verso l'esterno. Utilizzare l'ago della siringa per raccogliere un po 'di pasta saldante e applicarla ai perni. Riscaldare la torcia di saldatura a 320 °C; Sciogliere e spalmare del filo di stagno senza piombo con la punta della torcia.
6. Sovrapporre l'estremità superiore del filo di tungsteno con un ago dei perni di fila e utilizzare la saldatura sulla torcia per legare il filo di tungsteno al perno.
   NOTA: Sarebbe molto difficile saldare direttamente il filo di tungsteno con i perni senza l'aiuto del filo superfine.
7. Saldare un altro filo di tungsteno e un altro filo d'argento al perno della fila nello stesso modo in modo che ogni filo corrisponda ad un ago (vedi figura 1,i).
8. Tagliare due tubi termorestringenti leggermente più lunghi dell'estremità superiore del filo di tungsteno. Metterli sul giunto di saldatura di due fili di tungsteno, assicurandosi che la parte conduttiva sia completamente coperta nel tubo in modo che il circuito dei due fili di tungsteno non sia posizionato in serie.
   NOTA: Sebbene ci siano tre fili, se due di essi sono isolati, i tre fili non saranno in serie; Un tubo può anche essere aggiunto al filo d'argento.
9. Rimuovere l'elettrodo dal morsetto del tavolo di saldatura e tenere delicatamente l'elettrodo con pinze grandi, poiché è facile che gli elettrodi perdano la loro forma quando si riscalda il tubo restringibile, utilizzando un buon morsetto di conducibilità termica con una forza leggermente maggiore.
10. Accendere il condotto dell'aria e riscaldare fino a raggiungere una temperatura di 320 °C. Soffiare il tubo termorestringente per alcuni secondi fino a quando non è serrato (vedere figura 1,ii).
11. Se gli aghi si separano dal corpo plastico durante il processo di saldatura, giuntare la parte di saldatura e il corpo in plastica con un adesivo hot melt (vedi Figura 1,iii). Fare attenzione a non spalmarlo sull'interfaccia in quanto ciò influenzerebbe l'inserimento dell'interfaccia.
12. Tenere i due fili di tungsteno e torcerli insieme, mantenendo le estremità separate (vedi Figura 1,iv). Tagliare i fili di tungsteno intrecciati a circa 10 mm di lunghezza in modo che la separazione alle estremità non superi 0,5 mm.
    NOTA: Questo passaggio può essere eseguito anche prima dell'impianto dell'elettrodo per consentire una regolazione flessibile della lunghezza dell'elettrodo.
13. Riscaldare la pistola per colla e applicare la colla uniformemente attorno all'elettrodo.
14. Controllare gli elettrodi con un multimetro: posizionare una barra del multimetro sul lato non saldato dei perni delle file e toccare delicatamente l'estremità del filo di tungsteno o del filo d'argento sull'altra barra, controllando se il circuito è liscio. Assicurarsi che le linee non siano posizionate in serie.

2. Collegamento del collettore rotante e descrizione del circuito

NOTA: quando gli elettrodi sui mouse sono collegati a un dispositivo EEG tramite cavi in una condizione di movimento libero, i cavi possono aggrovigliarsi mentre i mouse si muovono e girano. Ciò fa sì che i cavi diventino più corti, impedendo infine ai topi di muoversi o causando la caduta dei cavi dalle loro teste. Nel metodo qui descritto, viene introdotto un collettore rotante a quattro canali per evitare che i cavi cadano. I quattro canali sono rappresentati in quattro colori nella Figura 1B.

1. Staccare 5 mm della pelle isolante a ciascuna estremità per esporre il filo metallico all'interno.
2. Aggiungere una sezione di tubo termorestringente a ciascun filo dello statore.
3. Saldare ogni filo con la spina del connettore del dispositivo EEG.
4. Restringere il tubo termorestringente con aria calda.
5. Aggiungere una sezione di tubo termorestringente a ciascun filo del rotore.
6. Avvitare insieme le parti conduttrici dei fili rossi e arancioni e saldarle a un giunto nell'intestazione per adattarsi al perno della fila.
7. Saldare gli altri due fili sulla testata a ciascun giunto.
   NOTA: Il canale marrone che corrisponde al filo d'argento è collegato al dispositivo EEG per la messa a terra. I canali rosso e arancione ricevono segnali dallo stesso filo di tungsteno e il canale arancione funge da riferimento per il dispositivo EEG. I segnali nel canale rosso sono privi di significato, ma devono coesistere con il canale nero per formare uno stimolo di corrente. I segnali nel canale nero sono i veri segnali elettrici nel cervello. Diversi circuiti possono essere progettati con collettori rotanti multicanale per adattarsi a diversi dispositivi.

3. Chirurgia per l'impianto

1. Animali
   1. Utilizzare topi maschi selvatici C57BL / 6 di 8 settimane, del peso di 24-26 g, per interventi chirurgici.
   2. Ospitarli con un ciclo luce-buio di 12 ore (tempo di luce: 8:00-20:00) in un ambiente a temperatura controllata (22 ± 1 °C) e fornire acqua e alimentazione ad libitum.
   3. Utilizzare un tappetino termico extra per mantenere gli animali caldi durante l'intervento chirurgico.
   4. Dopo l'intervento chirurgico, iniettare meloxicam per via sottocutanea (10 mg/kg) come prima somministrazione di analgesici. Quindi, posizionare gli animali in gabbie separate per ottimizzare il recupero. Aggiungi meloxicam alla dieta dell'animale per la prima settimana dopo l'intervento chirurgico.
   5. Dopo l'esperimento, infondere i ventricoli sinistri dei topi con paraformaldeide al 4% sotto anestesia e raccogliere i tessuti cerebrali per la verifica istologica del bersaglio dell'elettrodo.
2. Pesare il topo e anestetizzarlo mediante iniezione intraperitoneale di soluzione di pentobarbital all'1%. Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici e i materiali di consumo da utilizzare, comprese punte da trapano, elettrodi, cemento dentale, ecc., In autoclave.
3. Quando il mouse è completamente anestetizzato, radere i capelli dall'occhio all'orecchio con un rasoio.
4. Fissare il mouse sulla cornice stereotassica. Inserire i denti superiori anteriori nella barra incisiva e inserire entrambe le barre auricolari ugualmente profondamente nelle orecchie. Applicare unguento oculare eritromicina agli occhi per prevenire secchezza e cecità causate da una luce intensa durante l'intervento chirurgico.
5. Disinfettare l'area chirurgica con tre tamponi alternati di iodophor e alcool al 75% con movimento circolare. Quindi, eseguire un'incisione sagittale in avanti dal centro di questa incisione e tagliare la pelle su entrambi i lati dell'incisione per creare una finestra triangolare.
6. Arrotolare un piccolo pezzo di cotone in una palla e bagnarlo con perossido di idrogeno al 3%. Rimuovere il tessuto molle attaccato al cranio strofinando delicatamente l'area esposta con un piccolo batuffolo di cotone fino a quando la fontanella anteriore e posteriore sono chiaramente visibili.
7. Regolare le altezze anteriore e posteriore in modo che la fontanella anteriore e posteriore sia in posizione orizzontale. Considera la posizione della fontanella anteriore come l'origine degli assi.
8. Fissare una vite in acciaio inossidabile al cranio cerebellare sinistro, usando un trapano per creare una superficie piana. Assicurarsi che la vite sporga a metà del cranio.
9. Assicurarsi che le coordinate per l'accensione dell'amigdala siano -1,67 mm posteriormente, -2,7 mm lateralmente e -4,9 mm ventrale dal bregma. Regolare il dispositivo stereotassico per individuare questo punto e contrassegnarlo.
10. Praticare un foro sul punto contrassegnato con un trapano a teschio da 0,5 mm di diametro.
11. Fissare gli elettrodi all'asta di posizionamento del dispositivo stereotassico, posizionare l'elettrodo verticalmente sopra il foro e abbassare lentamente la posizione a -4,9 mm. Avvolgere il filo d'argento attorno alla vite tre volte, facendo attenzione a non scuotere il corpo dell'elettrodo durante il funzionamento.
12. Mescolare il cemento dentale e applicarlo delicatamente sulla superficie dell'elettrodo e del cranio. Quando il cemento dentale si indurisce, modificare l'esterno fino a quando il cemento che racchiude l'elettrodo fisso si trasforma in un cono.
13. Quando il cemento si è indurito, rilasciare l'elettrodo dal dispositivo stereotassico. Somministrare meloxicam per via sottocutanea 10mg/kg per alleviare il disagio causato dal dolore negli animali. Somministrare meloxicam al cibo per animali per effetto analgesico nella prima settimana dopo l'intervento chirurgico. Rimuovere il mouse e rimetterlo nella gabbia, tenendolo separato dagli altri topi.

4. Accensione elettrica

1. Lasciare riposare i topi per almeno 1 settimana dopo l'intervento chirurgico prima di accendersi per consentire il recupero postoperatorio e consentire all'infiammazione di diminuire.
   NOTA: In generale, i topi che non hanno recuperato adeguatamente non rispondono bene all'accensione.
2. Inserire il mouse in una scatola personalizzata con cavi collettori che collegano l'elettrodo sulla testa del mouse e il dispositivo EEG. Far passare il cavo attraverso un foro nel coperchio della scatola e regolare la lunghezza rimasta nella scatola per consentire al mouse di muoversi liberamente.
3. Accendere il dispositivo EEG e verificare se funziona correttamente. Impostare lo stimolatore per fornire impulsi monofasici a onda quadra da 1 ms a 60 Hz per una durata del treno di 1 s.
4. Inizia con un'intensità di corrente di 50 μA per la prima stimolazione; monitorare l'EEG per la post-scarica, che è caratterizzata da picchi ad alta frequenza. Se non si osserva alcuna post-scarica, aggiungere 25 μA allo stimolo successivo e continuare questo processo ogni 10 minuti fino a quando non si osserva una post-scarica che dura 5 s.
   NOTA: se l'esperimento non richiede una scarica, il passaggio 4.4 può essere saltato; 300 μA è abbastanza forte per l'accensione.
5. Stimolare il mouse con l'intensità di corrente determinata al punto 4.3 ogni 15 minuti, non più di 20 volte al giorno.
6. Monitorare le risposte comportamentali allo stimolo.
   NOTA: Il verificarsi di tre episodi consecutivi di grado V è considerato accensione completa, combinato con lo standard¹⁷ di rango Racine.

Risultati

L'elettrodo e il circuito consentono di registrare l'EEG e di funzionare come stimolazione (Figura 1); Questa configurazione evita la complessità di impiantare separatamente la registrazione e la stimolazione degli elettrodi e riduce al minimo i danni al tessuto cerebrale. L'applicazione di collettori rotanti consente il collegamento degli elettrodi con tutti i tipi di dispositivi.

Abbiamo eseguito un intervento chirurgico di impianto di elettrodi su sei topi adu...

Discussione

L'epilessia è un gruppo di malattie con manifestazioni multiple e cause diverse¹⁸; Va notato che nessun singolo modello può essere utilizzato per tutti i tipi di epilessia e i ricercatori devono selezionare un modello appropriato per il loro studio specifico. Il presente studio introduce uno dei metodi più accessibili di fabbricazione degli elettrodi. Varie parti di questo metodo possono essere regolate per adattarsi a diverse condizioni sperimentali.

Questo metodo u...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488-conjugated Donkey anti-Rabbit IgG	invitrogen	A-21206
c-Fos antibody		ab222699
Cranial drill	SANS	SA302
dental cement	NISSIN
EEG recording and stimulation equipment	Neuracle Technology (Changzhou) Co., Ltd	NSHHFS-210803
lead-free tin wire	BAKON
Pin header/Female header	XIANMISI		spacing of 1.27 mm
Silver wire	A-M systems	786000
Slip ring	Senring Electronics Co.,Ltd	SNM008-04
Tungsten wire	A-M systems	796000
ultrafine multi-stand wire	Shenzhen Chengxing wire and cable	UL10064-FEP
welding equipment	BAKON	BK881