אין ויוו זיהוי חדירות כלי דם בבלוטה תת-מנדיבולרית של עכבר

Summary

בפרוטוקול הנוכחי, פונקציית מחסום האנדותל של הבלוטה התת-מנדיבולרית (SMG) הוערכה על ידי הזרקת עוקבים פלואורסצנטיים משוקללים מולקולריים שונים לוורידים הזוויתיים של מודלים של חיות ניסוי in vivo תחת מיקרוסקופ סריקת לייזר של שני פוטונים.

Abstract

לרוק תפקיד חשוב בבריאות הפה ובבריאות הכללית. תפקוד מחסום האנדותל השלם של כלי הדם מאפשר הפרשת רוק, בעוד שתפקוד לקוי של מחסום האנדותל קשור להפרעות רבות בהפרשת בלוטת הרוק. הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטת זיהוי חדירות פארא-תאית in vivo להערכת תפקודם של צמתים הדוקים של האנדותל (TJs) בבלוטות תת-מנדיבולריות של עכברים (SMG). ראשית, דקסטראנס עם תוויות פלואורסצנטיות עם משקלים מולקולריים שונים (4 kDa, 40 kDa או 70 kDa) הוזרקו לוורידים הזוויתיים של עכברים. לאחר מכן, ה-SMG החד-צדדי נותח ותוקן במחזיק המותאם אישית תחת מיקרוסקופ סריקת לייזר של שני פוטונים, ולאחר מכן צולמו תמונות עבור כלי דם, אצ'יני וצינורות. באמצעות שיטה זו, נצפתה הדליפה הדינמית בזמן אמת של העוקבים בגדלים שונים מכלי הדם לצדדים הבסיסיים של האצ'יני ואפילו על פני אפיתליה האצ'ינארית לתוך הצינורות כדי להעריך את השינוי בתפקוד מחסום האנדותל בתנאים פיזיולוגיים או פתופיזיולוגיים.

Introduction

בלוטות הרוק השונות מייצרות רוק, המשמש בעיקר כקו ההגנה הראשון מפני זיהומים ומסייע לעיכול, ובכך ממלא תפקיד חיוני בבריאות הפה ובבריאות הכללית¹. אספקת הדם חיונית להפרשת בלוטת הרוק מכיוון שהיא מספקת כל הזמן מים, אלקטרוליטים ומולקולות היוצרים את הרוק הראשוני. תפקוד מחסום האנדותל, המווסת על ידי קומפלקס הצומת ההדוק (TJ), מגביל בקפדנות ובעדינות את חדירתם של נימים, שהם חדירים מאוד למים, מומסים, חלבונים ואפילו תאים הנעים מכלי הדם במחזור הדם לרקמות בלוטת הרוק ^2,3. מצאנו בעבר כי פתיחת ה- TJs של האנדותל בתגובה לגירוי כולינרגי מקלה על הפרשת הרוק, ואילו הפגיעה בתפקוד מחסום האנדותל קשורה להיפו-הפרשה וחדירה לימפוציטית בבלוטות התת-מנדיבולריות (SMGs) בתסמונת סיוגרן⁴. נתונים אלה מצביעים על כך שתרומתו של תפקוד מחסום האנדותל צריכה להיות מוקדשת מספיק תשומת לב לגבי מגוון מחלות בלוטת הרוק.

מיקרוסקופ סריקת לייזר בעל שני פוטונים הוא כלי רב עוצמה להתבוננות בדינמיקה של תאים ברקמה שלמה in vivo. אחד היתרונות של טכניקה זו הוא שלאור אינפרה-אדום קרוב (NIR) יש חדירה עמוקה יותר לרקמות מאשר לאור נראה או אולטרה סגול כאשר דגימות מעוררות על ידי NIR ואינו גורם נזק אור ברור לרקמות בתנאים מתאימים ^5,6. ואכן, בלוטות הרוק הן רקמה הומוגנית ושטחית מאוד, שבה תאי האסינאר על פני השטח נמצאים במרחק של כ-30 מיקרומטר בלבד משטח הבלוטה ^7,8. הוכח כי מיקרוסקופיה קונפוקלית תוך-חיונית יכולה לחקור הפרשה אקסוקרינית ושלד אקטין בבלוטות רוק של עכברים חיים ברזולוציה תת-תאית⁸. עם זאת, למיקרוסקופיה של סריקת לייזר דו-פוטונית יש לא רק את היתרון של מיקרוסקופיה קונפוקלית קונבנציונלית, אלא ניתן להשתמש בה גם כדי לזהות רקמות עמוקות יותר ותמונה בצורה ברורה יותר. כאן, dextrans מסומן פלואורסצנציה, אשר משמשים לעתים קרובות כמו עקבות חדירות paracellular ויש להם את היתרון של גדלים שונים, ניתן להשתמש כדי לבדוק את גודל של נקבובית TJ⁹. במחקר הנוכחי נקבעה טכניקת מיקרוסקופיה תוך-חיונית בזמן אמת של סריקת לייזר דו-פוטונית לצורך הערכה באתרה של תפקוד מחסום האנדותל ב-SMGs של עכברים. כל שלב עבודה עבור זיהוי חדירות כלי דם in vivo ב- SMGs עכבר מתואר בפרוטוקול הנוכחי. הנה דוגמה לזיהוי פונקציית מחסום אנדותל במודל קשירת צינור SMG של העכבר.

Protocol

כל הליכי הניסוי אושרו על ידי ועדת האתיקה של מחקר בבעלי חיים, מרכז מדעי הבריאות של אוניברסיטת פקין, וצייתו למדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה (פרסום NIH מס '85-23, מתוקן 1996). עכברים זכרים מסוג בר (WT) בקבוצת הגיל של 8-10 שבועות שימשו למחקר הנוכחי. חיות הניסוי טופלו בקפידה כדי למזער את הכאב ואי הנוחות שלהן.

1. נהלים לבעלי חיים

1. הכינו וניהלו את חומרי ההרדמה והמעקב.
   1. לשמור על תנאים סטריליים לאורך כל המחקר לעקר את המכשירים על ידי autoclaving. חלקו את העכברים לשתי קבוצות.
      הערה: קבוצת הביקורת נותרה ללא טיפול, והקבוצה השנייה עם קשירת צינור SMG חד-צדדית למשך יום אחד שימשה כקבוצת הניסוי. בעת הקיבוץ, יש לבחור עכברים עם משקל גוף וגיל דומים כדי להפחית את השפעת המשקל והגיל על חדירות כלי הדם.
   2. בחר עוקבים מתאימים כגון פלואורסצין איזותיוציאנט (FITC) עם תווית דקסטרן (משקל מולקולרי: 4 kDa; FD4) ורודמין B-מסומן דקסטרן (משקל מולקולרי: 70 kDa; RD70) (ראה טבלת חומרים) עם ספקטרום עירור/פליטה מובהק כדי למזער את ההפרעה בין אותות פלואורסצנטיים (באמצעות מסנן FITC או רודמין B, בהתאמה) לבדיקת החדירות.
      הערה: אורכי גל העירור של FD4 ו- RD70 הם 488 ננומטר ו- 594 ננומטר, בהתאמה, ואורכי גל הפליטה שנבחרו הם 511-564 ננומטר ו- 617-669 ננומטר, בהתאמה.
   3. לדלל את העקבות בתמיסת מלח סטרילית עם אגירת פוספטים (1x PBS) למלאי של 100 מ"ג/מ"ל ולאחסן את האליקוטים המוגנים מפני אור בטמפרטורה של 20°C-.
      הערה: דקסטרן עם משקל מולקולרי כגון 4 kDa ידלוף במהירות מהדם ב- SMGs של עכברים גם ללא תנאים פתולוגיים¹⁰.
   4. תוך כדי הצפק להזריק את tribromoethanol (המינון עבור עכבר 25 גרם היה כ 600 μL) כדי להרדים את העכברים. לספק משככי כאבים כפי שהומלץ על ידי הוועדה המקומית לאתיקה של בעלי חיים.
      הערה: לאחר אינדוקציה של הרדמה, יש להשתמש במשחה וטרינרית על העיניים כדי למנוע יובש. שמור היטב על בעלי החיים¹¹. המתן עד שהעכבר יסבול גירוי מכני, למשל צביטה בבוהן ללא תגובה מוטורית.
   5. להזריק תערובת של שני עוקבי חדירות פארא-תאית עם משקלים מולקולריים שונים (FD4 ו-RD70) לתוך הווריד הזוויתי (0.5 מ"ג/גרם משקל גוף). הזריקו לכל עכבר תערובת תמיסת מעקב של 100 μL, כאשר 50 μL מכל צבע מעורבבים ביחס של 1:1.
      1. לאחר ההרדמה, החזק בעדינות את הראש והצוואר של העכבר כדי לגרום לצד אחד של גלגל העין לבלוט מעט. יש להחדיר מזרק אינסולין המכיל עוקבים פלואורסצנטיים (יש להיזהר שלא להכניס אוויר למזרק) לאורך זווית העין בזווית ישרה לעין.
         הערה: אם הווריד הזוויתי מוכנס כראוי, תמיסת הצבע תוזרק בקלות לווריד, ולא תהיה התנגדות במהלך ההזרקה. בנוסף, הזרקת וריד זנב בעכברים עשויה גם היא להיות מועמדת למולקולות מעקב תוך ורידיות.
2. בצע את בידוד SMG בהתאם לשלבים הבאים.
   הערה: השתמש בכלים סטריליים, כולל מספריים לרקמות וניקל הפרדה, לניתוח.
   1. הפרד בלוטה חד צדדית בזהירות כדי לא לפגוע בכלי הדם ובעצבים שמסביב תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי.
      1. לאחר הזרקה של עוקבי חדירות paracellular, במהירות לשים את העכברים על הקרטון ומניחים אותם במצב שכיבה עם איבריהם וראשיהם מודבקים. יש למרוח קרם להסרת שיער על עור הצוואר כדי להסיר את שיער העכבר. השתמש 75% אתנול כדי לחטא את העור לפני הניתוח.
      2. לאחר מכן, תחת סטריאומיקרוסקופ, לחתוך את האפידרמיס של הצוואר עם מספריים רקמה כללית כדי לחשוף את שני הצדדים של SMGs (הבלוטה הימנית טופלה בניסוי זה). לאחר מכן, השתמש בניקל הפרדת רקמות קהה (ראה טבלת חומרים) כדי להפריד בעדינות את הקפסולה מפני השטח של הבלוטה, תוך הקפדה שלא לפגוע ברקמת הבלוטה ובכלי הדם.
      3. הפרד את הקפסולה מפני השטח של הבלוטה מבלי לפגוע במבנה הבלוטות. בנוסף, ודא כי כל התהליך של ריסון העכבר והפרדת הבלוטה נעשה תוך 10 דקות.

2. מערך מיקרוסקופ דו-פוטוני

1. חבר את המחזיק המותאם אישית להתקן הלחץ השלילי, ובדוק אם אפקט הלחץ השלילי מושג כראוי מראש.
   הערה: המחזיק מעוצב כמו זכוכית מגדלת מיניאטורית עם חתיכת זכוכית עגולה שטוחה במרכז (קוטר: 4.32 מ"מ, איור 1). מכשיר הלחץ השלילי תוכנן בתוך הבית באופן כזה שהמחזיק מחובר לצינור גומי, המחובר לבקבוק ניקוז, והבקבוק מחובר לבקר הלחץ השלילי באמצעות צינור גומי קצר. בדרך זו, בקר הלחץ השלילי יכול להתאים את הלחץ כדי להבטיח שהרקמה תישאב לתוך המחזיק.
   1. קשר צד אחד של המחזיק עם מכשיר הלחץ השלילי. כדי לבדוק אם מכשיר הלחץ השלילי תקין ומתאים, הפוך את המחזיק, הוסף טיפת מים והגדר את ערך הלחץ השלילי ל -20 יחידות. אם המים נשאבים לחלוטין ובמהירות, מכשיר הלחץ השלילי מותקן בהצלחה עם המחזיק.
2. הניחו בעדינות את ה-SMG החשוף של העכבר על המחזיק המותאם אישית, ושאבו את הרקמה על ידי שאיבה בלחץ שלילי רחוק ככל האפשר מגוף העכבר כדי להפחית את תוצרי התנועה הנגרמים על ידי נשימה ותנאים אחרים.
3. דמיינו את חומר התמיכה המחובר לבלוטה תחת מטרת טבילה במים של 25x/NA 1.0 (מיוחדת עבור קרינה בלתי מייננת).
   הערה: השתמש במיקרוסקופ זקוף בעל שני פוטונים (ראו טבלת חומרים) בניסוי זה. כלי הדם חייבים להיות גלויים מיד עם פלואורסצנטיות ברורה לאחר הזרקת המעקב.

3. הדמיית כלי שיט וזיהוי חדירות

1. יש להתחיל בהדמיה זמן קצר לאחר שנבחרה מראה הבלוטה.
   הערה: בדרך כלל, סדרות זמן של 45-50 תמונות ב-20 שניות או יותר מצולמות בדרך כלל, בהתאם לתכנון הניסוי.
2. קבל תמונות עוקבות לאורך ציר Z, צעד 2 מיקרומטר זה מזה, מפני השטח של הבלוטה עד 70-140 מיקרומטר לתוך הרקמה כדי ליצור מבנה תלת מימדי (3D).
3. לרכוש הדמיה בהילוך מהיר של כלי הדם כדי למדוד חדירות כלי הדם ב- SMG.
   הערה: הגדר את התנאים של תפריט התוכנית באופן הבא לאחר הפעלת תוכנת המיקרוסקופ (ראה טבלת חומרים).
   1. בתיבת הדו-שיח Explorer, לחץ על הוסף תיקיה חדשה ושנה את שם הקובץ.
   2. חזור לעמודה רכישה . ב- XY, הפורמט הוא 512 x 512, והמהירות היא 400 הרץ. הפעל X דו-כיווני .
   3. הגדר את גורם הזום ל- 0.75 ו- 1.5 עבור זום.
   4. כדי לרכוש הדמיה בהילוך מהיר, בחר xyt תחת מצב רכישה. הגדר את משך הזמן ל- 20 שניות, 30 דקות או יותר בהתאם לצורך הניסוי.
   5. כדי לבצע את הבנייה התלת-ממדית, הגדר את מצב הרכישה ל - xyz. ניתן להגדיר את גודל Z-Step בהתאם למצב בפועל.
   6. לאחר הגדרת התנאים, לחץ על Live כדי לצפות בהדמיית כלי הדם של שני ערוצים וערוצים חופפים במסגרת יצירת התמונה ובחר את תחומי העניין.
   7. לחץ על התחל כדי להתחיל בהדמיה.
      הערה: אין להשאיר את העכבר ללא השגחה במהלך תהליך ההדמיה תחת הרדמה.

4. ניתוח נתונים

1. כדי להעריך את חדירות כלי הדם, השתמש בתוכנת Image J כדי לחשב את יחס עוצמת הפלואורסצנטיות של FD4 ו- RD70 בין כלי הדם החיצוניים והפנימיים וציין אותם כעוצמה חוץ-וסקולרית⁴.
   הערה: השינוי בחדירות כלי הדם באמצעות מעקב אחר הובלת הדקסטרנס משקף את השינוי בתפקוד מחסום האנדותל. יתר על כן, שימו לב למורפולוגיה ולצפיפות כלי הדם על ידי חישוב הקוטר ומספר השינויים בכלי הדם.
   1. הפעל את תוכנת Image J (ראה טבלת חומרים).
   2. לחץ על קובץ ובחר פתח כדי לפתוח את תמונות כלי הדם שצולמו תחת מיקרוסקופ שני פוטונים.
   3. בחר תמונה והגדר את Type ל- 16 סיביות כדי להמיר את תבנית התמונה.
   4. בחר נתח ובחר אזור, ממוצע, IntDen תחת קבע מדידות. לחץ על אישור כדי לאשר.
   5. תחת נתח, בחר כלים, פתח את אבוס החזר ההשקעה ובחר הצג הכל ותוויות.
   6. מדוד את ערך עוצמת הפלואורסצנציה התוך-וסקולרית: לחץ על כלי הלאסו בממשק הראשי כדי לשרטט את קווי המתאר של כלי הדם. לחץ על הוסף במנהל החזר ההשקעה. בצע שלב זה כדי להמשיך לבחור כלי שיט מרובים. בחר את כל האובייקטים של מנהל ההחזר על ההשקעה ולחץ על מדוד.
   7. מדידת ערך עוצמת הפלואורסצנציה הכולל: תאר את התמונה כולה, לחץ על מדוד, והתוצאה היא ערך עוצמת הפלואורסצנציה הכולל של התמונה.
   8. חישוב ערך עוצמת הפלואורסצנציה החוץ-וסקולרית. העתק את הנתונים ל- Excel לצורך חישוב. יחס עוצמת פלואורסצנציה חוץ-וסקולרית = (1 − ערך עוצמת פלואורסצנציה תוך-וסקולרית/ערך עוצמת פלואורסצנציה כוללת) × 100%.

5. יישומים במורד הזרם

1. במהלך הניסוי, חשב את קצב זרימת הדם על ידי מדידת המרחק שתא אדום (המוצג כנקודה שחורה תחת מיקרוסקופ שני פוטונים)⁴ עובר במשך זמן.
2. כדי להמחיש את תנועת תאי הדם על פני תאי האנדותל, תייג את תאי הדם על ידי פלואורסצנציה. לאחר מכן, הזריקו לתאים המסומנים בפלואורסצנציה FD4 או RD70 דרך וריד זנב העכבר. לאחר מחזור במשך 5 דקות, לעקוב אחר התאים המעוניינים במשך תקופה.
   הערה: סך של 2 x 10⁶ CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl ester, צבע פלואורסצנטי חדיר ממברנה) המסומנים בלימפוציטים שמקורם בטחול של עכברים תורמים הועברו למושתלים על ידי הזרקת וריד זנב, וחדירת לימפוציטים ל- SMGs נחקרה במודלים ניסיוניים של בעלי חיים⁴.

6. טיפול בבעלי חיים והתאוששות

1. טפלו היטב בבעלי החיים לאורך כל הניסוי.
   הערה: ודא שבעל החיים שעבר ניתוח לא יוחזר לחברתם של בעלי חיים אחרים עד להחלמה מלאה במהלך הניסוי.
2. אין להשאיר את החיה ללא השגחה עד שהיא חוזרת להכרה מספקת.
   הערה: שימו לב למצב הנשימה של העכברים באופן רציף ושמרו על חום גופם על ידי הנחתם על כרית החימום של בעלי החיים. לספק דיור להתאוששות מכאבים לאחר הניתוח ומשככי כאבים, בהתאם להמלצת ועדת האתיקה המקומית לבעלי חיים.

תוצאות

בעקבות הפרוטוקול, ה-SMG החד-צדדי חובר למחזיק בהתאמה אישית, והבלוטה נשמרה רחוק ככל האפשר מגוף העכבר כדי למנוע מהנשימה לגרום לתוצרי תנועה. הזרימה המהירה של תאי הדם האדומים (נקודות שחורות) בכלי הדם נצפתה תחת המיקרוסקופ. לאחר מציאת שדה הרקמה מתחת לעדשה עינית, יש לעבור כדי לתפעל את תוכנת המיקרוסק?...

Discussion

תחזוקה וויסות של תפקוד מחסום אנדותל חיוניים להומאוסטזיס וסקולרי. תאי האנדותל והצמתים הבין-תאיים שלהם ממלאים תפקיד קריטי בשמירה ובבקרה על שלמות כלי הדם¹². כוח הגזירה של זרימת הדם, גורמי גדילה וגורמים דלקתיים יכול לגרום לשינויים בחדירות כלי הדם, ובכך להשתתף בהתרחשות והתפתחות ש?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-photon microscope (TCS-SP8 DIVE)	Leica, Germany
4 kDa FITC-labeled dextran	Sigma Aldrich	46944
70 kDa rhodamine B-labeled dextran	Sigma Aldrich	R9379
Blunt tissue separation nickel	Bejinghuabo Company	NZW28
Depilatory cream	Veet
Disposable sterile syringe	Zhiyu Company		1 mL
Image J software	National Institutes of Health
Insulin syringe	Becton, Dickinson and Company	0253316	1 mL
Leica Application Suite X software	Leica Microsystems
Microtubes	Axygen	MCT-150-C	1.5 mL
Phosphate buffered saline 1x	Servicebio	G4207-500
Tissue scissors	Bejinghuabo Company	M286-05
Tribromoethanol	JITIAN Bio	JT0781