כימות של Caspase-9 מוכתם חיסונית ברקמת הרשתית

Summary

מוצג כאן פרוטוקול אימונוהיסטוכימיה מפורט כדי לזהות, לאמת ולמקד קספאזות רלוונטיות מבחינה תפקודית ברקמות מורכבות.

Abstract

ידוע כי משפחת הקספאזות מתווכת מסלולים תאיים רבים מעבר למוות תאי, כולל התמיינות תאים, איתור נתיבים אקסונאליים והתפשטות. מאז זיהוי משפחת הפרוטאזות של מוות תאי, קיים חיפוש אחר כלים לזיהוי והרחבת תפקודם של בני משפחה ספציפיים במצבי התפתחות, בריאות וחולי. עם זאת, רבים מכלי הקספאזה הזמינים כיום באופן מסחרי, הנמצאים בשימוש נרחב, אינם ספציפיים לקספאזה הממוקדת. בדו"ח זה אנו מפרטים את הגישה שבה השתמשנו כדי לזהות, לאמת ולמקד את caspase-9 במערכת העצבים באמצעות מעכב חדשני וגישות גנטיות עם קריאות אימונוהיסטוכימיות. באופן ספציפי, השתמשנו ברקמה העצבית ברשתית כמודל כדי לזהות ולאמת את נוכחותם ותפקודם של קספאזות. גישה זו מאפשרת לחקור תפקודים ספציפיים של קספאז-9 אפופטוטיים ולא-אפופטוטיים מסוג התא, וניתן ליישם אותה על רקמות מורכבות אחרות ועל קספאזות מעניינות. הבנת התפקודים של קספאזות יכולה לסייע בהרחבת הידע הקיים בביולוגיה של התא, ויכולה גם להיות יתרון בזיהוי מטרות טיפוליות פוטנציאליות בשל מעורבותן במחלות.

Introduction

הקספאזות הן משפחה של פרוטאזות המווסתות מוות התפתחותי של תאים, תגובות חיסוניות ומוות תאי סוטה במחלה ^1,2. אמנם ידוע כי בני משפחת הקספאזה מושרים במגוון מחלות נוירודגנרטיביות, אך ההבנה איזה קספאז מניע פתולוגיה של מחלות מאתגרת יותר³. מחקרים כאלה דורשים כלים כדי לזהות, לאפיין ולאמת את תפקודם של בני משפחה קספאזיים בודדים. ניתוח הקספאזות האינדיבידואליות הרלוונטיות חשוב הן מבחינה מכניסטית והן מבחינה טיפולית, שכן בספרות יש מחקרים רבים המספקים עדות לתפקידים המגוונים של caspases ^4,5. לכן, אם המטרה היא למקד קספאז במחלה לתועלת טיפולית, זה קריטי שיהיה מיקוד ספציפי של בני המשפחה הרלוונטיים. טכניקות מסורתיות לזיהוי רמות קספאז ברקמה כוללות כתם מערבי וגישות אנזימטיות ופלואורומטריות ^3,6. עם זאת, אף אחד מהאמצעים הללו אינו מאפשר זיהוי ספציפי לתאים של רמות קספאזה, ובתרחישים מסוימים, לעתים קרובות לא ניתן לזהות קספאזות מבוקעות על ידי אמצעי ניתוח חלבונים מסורתיים. ידוע כי קספאזות יכולות למלא תפקידים אפופטוטיים ולא אפופטוטיים שונים באותה רקמה⁷, ולכן יש צורך באפיון זהיר של רמות הקספאז הספציפיות לתאים להבנה מדויקת של מסלולי התפתחות ומחלות.

מחקר זה מראה הפעלה ותפקוד של קספאז במודל של היפוקסיה-איסכמיה נוירו-וסקולרית - חסימת ורידים ברשתית (RVO)^7,8. ברקמה מורכבת כמו הרשתית, ישנם מספר סוגי תאים שיכולים להיות מושפעים מההיפוקסיה-איסכמיה המושרה ב-RVO, כולל תאי גלייה, נוירונים וכלי דם⁷. ברשתית העכבר הבוגרת, יש מעט מאוד ביטוי של קספאזות הניכר ברקמה בריאה, כפי שנמדד על ידי אימונוהיסטוכימיה (IHC)⁷, אך זה לא המקרה במהלך התפתחות⁹ או במודלים של מחלת רשתית^10,11. IHC היא טכניקה המבוססת היטב במחקר ביו-רפואי ואפשרה אימות של מחלות ומטרות פתולוגיות, זיהוי תפקידים חדשים באמצעות לוקליזציה מרחבית וכימות של חלבונים. במקרים בהם לא ניתן לזהות תוצרי קספאז שסועים על ידי כתם מערבי או ניתוח פלואורומטרי, וגם לא את מיקום התא הספציפי של קספאזות נפרדות או חקירה של מסלולי איתות קספאז באמצעות לוקליזציה, יש להשתמש ב- IHC.

על מנת לקבוע את הקספאזות הרלוונטיות מבחינה תפקודית ב-RVO, IHC שימש עם נוגדנים מאומתים עבור קספאזות וסמנים תאיים. המחקרים הקודמים שבוצעו במעבדה הראו כי caspase-9 הופעל במהירות במודל של שבץ איסכמי ועיכוב של caspase-9 עם מעכב ספציפי מאוד מוגן מפני תפקוד לקוי של נוירונים ומוות¹². מכיוון שהרשתית היא חלק ממערכת העצבים המרכזית (CNS), היא משמשת כמערכת מודל לחקירה וחקירה נוספת של תפקידו של קספאז-9 בפציעות נוירו-וסקולריות¹³. לשם כך, נעשה שימוש במודל העכבר של RVO כדי לחקור את המיקום וההתפלגות הספציפיים לתא של caspase-9 ואת משמעותו בפגיעה נוירו-וסקולרית. RVO הוא גורם נפוץ לעיוורון בקרב מבוגרים עובדים הנובע מפגיעה בכלי הדם¹⁴. נמצא כי קספאז-9 התבטא באופן לא אפופטוטי בתאי אנדותל, אך לא בתאי עצב.

כרקמה, הרשתית יש את היתרון של להיות חזותית כמו שטוח, אשר מאפשר הערכה של רשתות כלי הדם, או כמו חתכים, אשר מדגיש את שכבות הרשתית העצבית. כימות ביטוי חלבון הקספאזה בחתכים מספק הקשר, לגביו קספאז עשוי להיות קריטי בקישוריות העצבית ברשתית ובתפקוד הראייה על ידי זיהוי לוקליזציה של הקספאזה ברשתית. לאחר זיהוי ואימות, מיקוד של caspase של עניין מושגת באמצעות מחיקה ספציפית לתא inducible של caspase מזוהה. עבור פניות טיפוליות פוטנציאליות, הרלוונטיות של הקספאזות המעניינות נבדקה באמצעות כלים ספציפיים כדי לעכב את הקספאזה המופעלת. עבור caspase-9 תא היה מעכב סלקטיבי מאוד ^7,15, Pen1-XBIR3 שימש. לצורך דו"ח זה, נעשה שימוש בזן C57BL/6J זכרי בן חודשיים ובזן נוקאאוט אנדותל קספאז-9 הניתן לטמוקסיפן (iEC Casp9KO) עם רקע C57BL/6J. בעלי חיים אלה נחשפו למודל העכבר של RVO ו-C57BL/6J טופלו במעכב הסלקטיבי קספאז-9, Pen1-XBir3. ניתן ליישם את המתודולוגיה המתוארת על מודלים אחרים של מחלות במערכות המרכזיות וההיקפיות ^7,15.

Protocol

פרוטוקול זה תואם את הצהרת האגודה לחקר ראייה ועיניים (ARVO) לשימוש בבעלי חיים בחקר העיניים והראייה. ניסויים במכרסמים אושרו ונוטרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של אוניברסיטת קולומביה.

1. הכנת רקמת רשתית והקפאה

1. להרדים את בעלי החיים על ידי מתן הרדמה תוך-צפקית (קטמין (80-100 מ"ג/ק"ג) וקסילזין (5-10 מ"ג/ק"ג)), ולחדור לעכברים הנתונים ל-RVO (ראו⁸ פרטים) עם 4% פרפורמלדהיד (PFA) באמצעות משאבה פריסטלטית.
   הערה: צבוט את הבוהן של החיה כדי לאשר את עומק ההרדמה לפני שתמשיך בהמתת חסד וזליפה. פרטים על זלוף ניתן למצוא ב¹⁶.
2. לקצור את העיניים על ידי enucleation זהיר באמצעות מלקחיים ולשים את כדור הארץ 1 מ"ל של 4% PFA. השאירו את העיניים ללילה ב 4 מעלות צלזיוס. שטפו את העיניים שלוש פעמים במשך 10 דקות, הוסיפו 1 מ"ל של 1x PBS והניחו אותן בשייקר.
3. לטבול את העיניים ב 1 מ"ל של 30% סוכרוז במשך 3 ימים, עד שהם לשקוע לתחתית הצינור, המציין ספיגה של סוכרוז.
4. מלאו את העיניים בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית באמצעות מזרק של 30 גרם, עד שהעין בעלת מראה מעוגל (כ-50 μL).
5. הטמע את העיניים בקריומולד עם תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית עד שהעיניים מכוסות וקופאות ב -80 מעלות צלזיוס עד שהן מוכנות לקריוסקציה.
6. חתך הטביע את העיניים ב-20 מיקרומטר על שקופיות זכוכית באמצעות קריוסטאט.
   1. הסר את בלוק טמפרטורת החיתוך האופטימלית מן cryomold.
   2. מניחים אותו על צ'אק קריוסטאט על ידי הוספת תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית והנחת הבלוק על הצ'אק. השאירו אותו בתוך cryostat עד שהוא קופא.
   3. המשך לחתוך את הבלוק ב 20 μm עד רקמת הרשתית הוא נראה.
      הערה: ניתן לאשר זאת באמצעות מיקרוסקופ אור בהגדלה של 30x (3x מטרה, 10x עיניות). ניתן להבחין בין רקמות לבין מדיית OCT לפי צבע וצורה.
   4. לאסוף את רקמת הרשתית במיקרוסקופ שקופיות בסדרה של ארבעה חלקים בכל שקופית.
      הערה: ראו איור 1A להצבה מוצעת של מקטעי רשתית.
7. תייג את השקופיות עם מזהה שמבטל את זיהוי הטיפול והגנוטיפ.
8. יש לאחסן את השקופיות בטמפרטורה של -20°C עד להכתמת.

2. אימונוהיסטוכימיה

הערה: השתמש ברקמה קבועה בהקפאה לאימונוהיסטוכימיה כדי לשמור על מורפולוגיה של התא. בחר מקטעים ברמה של תמונות טומוגרפיה קוהרנטית אופטית (OCT) שנרכשו ב- vivo⁷. השתמש בשתי הסדרות הראשונות של שקופיות שנאספו מהקריוסטאט או מקטעים של 150 מיקרומטר לתוך רקמת הרשתית.

1. מקם את המגלשות בתא שקופיות חשוך ולח.
2. חלחול וחסימה: שטפו את חתכי הרשתית עם 300 μL של 1x PBS למשך 5 דקות כדי להסיר את ה-OCT ולהשליך לאחר מכן.
3. חלחלו לרקמה על ידי הוספת 300 μL של 1x PBS עם 0.1% Triton X-100 למשך שעתיים בטמפרטורת החדר (RT) והשליכו לאחר מכן.
4. חסום את הרקמה על ידי הוספת 300 μL של מאגר חוסם (10% סרום עזים רגיל (NGS), 1% אלבומין בסרום בקר (BSA) ב-PBS אחד, מסונן) ולהשאיר למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
5. נוגדנים ראשוניים: דילול נוגדנים ראשוניים בחסימת חיץ. נוגדנים עיקריים בשימוש כוללים אנטי-קל-קספאז-9 ב-1:800, אנטי-CD31 ב-1:50 ואנטי-קספאז-7-488 (נוגדן עם תווית ישירה) ב-1:150.
   הערה: עקוב אחר המלצת היצרן לדילול מתאים של נוגדנים ראשוניים.
   1. יוצקים את המאגר החוסם מהמקטעים ומחילים 100 μL של קוקטייל הנוגדנים העיקרי על החלקות הרשתית.
   2. לדגום את חתכי הרוחב במשך הלילה ב 4 מעלות צלזיוס.
6. לשטוף את החלקים ארבע פעמים במשך 5 דקות עם 300 μL של 1x PBS.
   הערה: אם מקטעי הרקמה שבירים מאוד, יש להסיר את השטיפות באמצעות פעולה נימית על ידי החלת רקמה על פינת המגלשה כדי למנוע תזוזה של מקטעי הרשתית.
7. כדי להימנע מתיוג צולב של נוגדנים ראשוניים שגודלו באותו מין פונדקאי, השלימו את ההכתמה עם נוגדנים משניים לפני הפעלת הנוגדנים המסומנים ישירות.
8. נוגדנים משניים: לדלל את הנוגדנים המשניים בחסימת חיץ בריכוז של 0.1%. לדוגמה, כדי לזהות anti-cl-caspase-9, נוגדן שגדל בארנב, השתמש עז-אנטי-ארנב-568 משני.
   1. יש למרוח 200 μL של קוקטייל הנוגדנים המשני על הרשתיות.
   2. דגירה של הרקמה למשך שעתיים ב-RT.
   3. לשטוף את החלקים ארבע פעמים במשך 5 דקות עם 300 μL של 1x PBS.
   4. הכתימו את הגרעינים במשך 5 דקות עם 300 μL של DAPI בדילול של 0.02%.
9. יש לשטוף פעם אחת במשך 5 דקות עם 300 μL של PBS אחד.
10. הניחו כיסוי על חלקי הרשתית באמצעות 500 μL של מדיה פלואורומאונט-G, המשמרת את האות הפלואורסצנטי, והניחו בזהירות את הכיסוי על החלק העליון של המגלשה, תוך הימנעות מבועות.

3. הדמיה קונפוקלית

1. קבל תמונות של החלקים המוכתמים עם מיקרוסקופיה קונפוקלית.
   1. הפעל את המיקרוסקופ הקונפוקלי.
   2. הנח את השקופית על הבמה.
   3. כוונן את המיקוד כדי לראות את מקטע הרשתית בבירור.
      הערה: צלם לפחות ארבע תמונות לכל מקטע ותמונה ארבעה מקטעים לכל רשתית. ראו את סכמת הדמיית הרשתית עבור אזורי הדמיה מוצעים (איור 1B, C).
2. תמונה של קספאזה, כלי דם והכתמה גרעינית באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי בעל רכישת מחסנית Z, תוך שימוש במטרה של פי 20 או 40.
   הערה: פרמטרי ההדמיה והגדרת התוכנה צריכים להיות קבועים עבור כל ההדמיה בניסוי. מטרת 20x מספקת סקירה כללית של שכבות הרשתית, המוגדרות היטב על ידי הכתם הגרעיני. המטרה 40x מספקת יותר פרטים סלולריים.
   1. הגדר זמני חשיפה ועוצמת לייזר מתאימים לכל ערוץ על-ידי לחיצה על הגדרות רכישה.
   2. הגדר את ערימת Z כדי להמחיש את כל הקטע על-ידי לחיצה על סדרת Z והגדר פרמטרים למעלה ולמטה כדי לכסות את עומק הרקמה.
3. שמור את התמונות בהתאם למזהה עם המסיכה שהוקצה במהלך ההקפאה.

4. כימות רמות הקספאזה

1. גרור קובצי תמונה של ערוצי 405, 470, 555 ו- 640 לקונסולה של FIJI.
2. לחצו על ' תמונה' > 'צבע' > 'מיזוג ערוצים'.
3. הקצה צבעים לקבצים באופן הבא: אדום ל- 555, ירוק ל- 470, אפור ל- 405, ציאן ל- 640.
4. דחוס את מחסנית Z על-ידי לחיצה על Image > Stack > Z Project.
5. לחץ על סוג הקרנה: עוצמה מרבית.
6. פתחו את ממשק הערוצים בלחיצה על הכלי תמונה > ערוצים צבעוניים.
7. פתח את ממשק הבהירות והניגודיות .
8. בחר פרמטרים לכל ערוץ.
   1. עבור אל ערוצים ובחר ערוץ אחד.
   2. מקם את הסמן מעל התא המבוטא caspase והוסף ביאורים לערך הפיקסלים.
   3. מקם את הסמן על גבי הרקע והוסף ביאורים לערך הפיקסלים.
9. פרמטרים לבדיקה
   1. עבור אל ממשק הבהירות והניגודיות.
   2. לחץ על בחר.
   3. חבר את הערך המינימלי המוצג (ערך פיקסלים מבואר של תא מבוטא caspase).
   4. חבר את הערך המרבי המוצג (ערך הפיקסלים המבואר של הרקע).
   5. לחץ על אישור.
10. חזור על שלבים 4.8-4.9 עבור כל הערוצים.
11. בדוק את הפרמטרים על ידי בחירת תמונות אקראיות מרקמה עיוורת.
    הערה: ערוך פרמטרי בהירות וניגודיות רק אם ערך הרקע אינו מתאים לתמונות אחרות.
12. לאחר הגדרת הפרמטרים, פתח את קובצי התמונה ודחוס את Z-stack.
13. הוסף את פרמטרי הבהירות והניגודיות עבור ערוץ caspase ואת איזולקטין, ערוץ סמן כלי הדם.
14. השתמש בכלי הנקודה כדי לכמת את מספר האזורים החיוביים של כלי הדם באמצעות קולוקליזציה של סמן כלי הדם עם ביטוי קספאז כקריאה של אזורים חיוביים.
15. חזור על שלב 4.14 אך השתמש ב- Hoechst כסמן של אזורים חיוביים עצביים.
16. הוסף ביאורים לערכים בגיליון אלקטרוני לכל תמונה.
17. ממוצע הערכים לפי סעיף.
18. ממוצע ערכי המקטע - זו תהיה הקריאה לכל עין.

5. אישור גנטי של הרלוונטיות של תא האנדותל caspase-9

1. השתמש ברשתיות שהתקבלו מעכברי Casp9FL/FL-VECad-CreERT2 שהיו נתונים ל-RVO⁷.
2. אימונוסטין הרשתיות עבור caspase-9 (caspase שנמחק), caspase-7 (קספאז בעל השפעה במורד הזרם), סמני כלי דם ו- DAPI כמתואר לעיל בסעיף 2.
3. תמונה וכימות כמתואר לעיל בסעיפים 3 ו-4.

6. מיקוד קספאז-9 ב-RVO

1. יש להשיג עיניים מהעכברים הנתונים ל-RVO ולאחר מכן למרוח את מעכב הקספאז-9 Pen1-XBir3 באופן מקומי על העיניים כמו^ב-7.
2. אימונוסטין הרשתיות עבור caspase-7 (קספאז בעל השפעה במורד הזרם), סמני כלי דם ו- DAPI כמתואר לעיל בסעיף 2.
3. תמונה וכימות כמתואר לעיל בסעיפים 3 ו-4.

תוצאות

הפרוטוקול המתואר מאפשר למשתמש לנתח ולכמת את רמות caspase-9 ברקמת הרשתית. בנוסף, הוא מציג כלים לזיהוי, אימות והתמקדות ספציפית במצעי קספאז-9 ובמורד הזרם. הצעדים המסוכמים מאפשרים ניתוח ניתן לכימות של רמות הקספאז והספציפיות התאית בפוטומיקרוגרפים פלואורסצנטיים. כל הנתונים מראים פוטומיקרוגרפים מי...

Discussion

קספזות הן משפחה מרובת חברים של פרוטאזות הנחקרות בצורה הטובה ביותר בשל תפקידן במוות של תאים ובדלקת; עם זאת, לאחרונה נחשפו מגוון פונקציות שאינן מוות עבור חלק מבני המשפחה ^4,5. חלק גדול מהבנתנו את תפקוד הקספאז נגזר מעבודה בתרבית תאים ומנתונים הסקה ממחלות אנושיות...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
anti-Caspase-7 488	Novus Biologicals	NB-56529AF488	use at 1:150
anti-cl-Caspase-9	Cell Signaling	9505-S	use at 1:800
anti-CD31	BD Pharmingen	553370	use at 1:50
Confocal Spinning Disc Microscope	Biovision
FIJI 2.3.0	open source
Fluormount G	Fisher	50-187-88
Forcep	Roboz	RS-5015
iCasp9FL/FL X VECad-CreERT2 mice	lab generated		see Avrutsky 2020
Isolectin (594, 649)	Vector	DL-1207	use at 1:200
Ketamine Hydrochloride	Henry Schein	NDC: 11695-0702-1
Perfusion pump	Masterflex
Pen1-XBir3	lab generated		see Avrutsky 2020
Prism 9.1	GraphPad
Tissue-Tek O.C.T.	Fisher	14-373-65
Vis-a-View 4.0	Visitron Systems
Xylazine	Akorn	NDCL 59399-110-20