Quantificação da Caspase-9 Imunocorada em Tecido Retiniano

Resumo

Apresenta-se aqui um protocolo imuno-histoquímico detalhado para identificar, validar e direcionar caspases funcionalmente relevantes em tecidos complexos.

Resumo

A família das caspases é conhecida por mediar muitas vias celulares além da morte celular, incluindo diferenciação celular, pathfinding axonal e proliferação. Desde a identificação da família das proteases de morte celular, tem havido uma busca por ferramentas para identificar e expandir a função de membros específicos da família em estados de desenvolvimento, saúde e doença. No entanto, muitas das ferramentas de caspase atualmente disponíveis comercialmente que são amplamente utilizadas não são específicas para a caspase alvo. Neste relato, delineamos a abordagem que usamos para identificar, validar e direcionar a caspase-9 no sistema nervoso usando um novo inibidor e abordagens genéticas com leituras imuno-histoquímicas. Especificamente, utilizamos o tecido neuronal da retina como modelo para identificar e validar a presença e a função das caspases. Essa abordagem permite o interrogatório de funções específicas da caspase-9 apoptóticas e não apoptóticas do tipo celular e pode ser aplicada a outros tecidos complexos e caspases de interesse. Compreender as funções das caspases pode ajudar a expandir o conhecimento atual em biologia celular, e também pode ser vantajoso para identificar potenciais alvos terapêuticos devido ao seu envolvimento na doença.

Introdução

As caspases são uma família de proteases que regulam a morte celular do desenvolvimento, as respostas imunes e a morte celular aberrante na doença ^1,2. Embora seja bem sabido que os membros da família da caspase são induzidos em uma variedade de doenças neurodegenerativas, entender qual caspase impulsiona a patologia da doença é mais desafiador³. Tais estudos requerem ferramentas para identificar, caracterizar e validar a função de membros individuais da família caspase. A análise das caspases individuais relevantes é importante tanto do ponto de vista mecanicista quanto terapêutico, pois a literatura possui múltiplos estudos que fornecem evidências dos diversos papéis das caspases ^4,5. Assim, se o objetivo é direcionar uma caspase em uma doença para um benefício terapêutico, é fundamental ter um direcionamento específico do(s) membro(s) relevante(s) da família. As técnicas tradicionais para detectar os níveis de caspase no tecido incluem western blotting e abordagens enzimáticas e fluorométricas ^3,6. No entanto, nenhuma dessas medidas permite a detecção específica de células dos níveis de caspase e, em alguns cenários, as caspases clivadas muitas vezes não podem ser detectadas pelas medidas tradicionais de análise de proteínas. Sabe-se que as caspases podem desempenhar diferentes papéis apoptóticos e não apoptóticos no mesmo tecido⁷, portanto, é necessária uma caracterização cuidadosa dos níveis de caspase específicos das células para a compreensão precisa das vias de desenvolvimento e da doença.

Este estudo mostra a ativação e a função da caspase em um modelo de hipóxia-isquemia neurovascular - oclusão da veia retiniana (RVO)^7,8. Em um tecido complexo como a retina, existem vários tipos de células que podem ser afetadas pela hipóxia-isquemia induzida no RVO, incluindo células gliais, neurônios e vasculatura⁷. Na retina adulta de camundongos, há muito pouca expressão de caspases evidentes no tecido saudável, medida pela imuno-histoquímica (IHC)⁷, mas esse não é o caso durante o desenvolvimento⁹ ou em modelos de doença retiniana^10,11. A IHC é uma técnica bem estabelecida na pesquisa biomédica e tem permitido a validação de alvos patológicos e patológicos, a identificação de novos papéis por meio da localização espacial e a quantificação de proteínas. Nos casos em que os produtos de caspase clivada não podem ser detectados por western blot ou análise fluorométrica, nem a localização celular específica de caspases distintas ou interrogação de vias de sinalização de caspase através da localização, então o IHC deve ser usado.

Para determinar a(s) caspase(s) funcionalmente relevante na RVO, a IHC foi utilizada com anticorpos validados para caspases e marcadores celulares. Os estudos prévios realizados em laboratório mostraram que a caspase-9 foi rapidamente ativada em um modelo de acidente vascular cerebral isquêmico e inibição da caspase-9 com um inibidor altamente específico protegido da disfunção neuronal e da morte¹². Como a retina faz parte do sistema nervoso central (SNC), ela serve como um sistema modelo para consultar e investigar melhor o papel da caspase-9 em lesões neurovasculares¹³. Para este fim, o modelo de RVO em camundongo foi usado para estudar a localização e distribuição específicas da célula da caspase-9 e sua implicação na lesão neurovascular. A RVO é uma causa comum de cegueira em adultos em idade ativa que resulta de lesão vascular¹⁴. Verificou-se que a caspase-9 foi expressa de forma não apoptótica em células endoteliais, mas não em neurônios.

Como tecido, a retina tem a vantagem de ser visualizada como uma montagem plana, que permite a apreciação das redes vasculares, ou como seções transversais, que destacam as camadas neuronais da retina. A quantificação da expressão da proteína caspase em cortes transversais fornece contexto, em relação ao qual a caspase é potencialmente crítica na conectividade neuronal da retina e na função da visão, identificando a localização da(s) caspase(s) na retina. Após a identificação e validação, o direcionamento da caspase de interesse é alcançado usando a deleção específica de células induzíveis da caspase identificada. Para possíveis investigações terapêuticas, a relevância das caspases de interesse foi testada usando ferramentas específicas para inibir a caspase ativada. Para a caspase-9 uma célula persignificava inibidor altamente seletivo ^7,15, Pen1-XBIR3 foi utilizada. Para este relato, foram utilizadas cepas C57BL/6J masculinas de 2 meses de idade e knockout endotelial induzível por tamoxifeno caspase-9 (iEC Casp9KO) com fundo C57BL/6J. Esses animais foram expostos ao modelo de camundongo de RVO e C57BL/6J foram tratados com o inibidor seletivo da caspase-9, Pen1-XBir3. A metodologia descrita pode ser aplicada a outros modelos de doença nos sistemas central e periférico ^7,15.

Protocolo

Este protocolo segue a declaração da Associação de Pesquisa em Visão e Oftalmologia (ARVO) para o uso de animais em pesquisas oftálmicas e de visão. Experimentos com roedores foram aprovados e monitorados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais (IACUC) da Universidade de Columbia.

1. Preparação do tecido retiniano e criossecção

1. Eutanasiar os animais por meio de anestesia intraperitoneal (cetamina (80-100 mg/kg) e xilazina (5-10 mg/kg)), e perfundir os camundongos submetidos a RVO (ver⁸ para detalhes) com paraformaldeído a 4% (PFA) usando uma bomba peristáltica.
   NOTA: Dedo do pé beliscar o animal para confirmar a profundidade da anestesia antes de prosseguir com a eutanásia e perfusão. Detalhes sobre a perfusão podem ser encontrados em¹⁶.
2. Colha os olhos por enucleação cuidadosa usando fórceps e coloque o globo em 1 mL de PFA a 4%. Deixe os olhos durante a noite a 4 °C. Lave os olhos três vezes por 10 min, adicionando 1 mL de 1x PBS e colocando-os no agitador.
3. Mergulhe os olhos em 1 mL de sacarose a 30% por 3 dias, até que eles se depositem no fundo do tubo, indicando absorção da sacarose.
4. Encha os olhos com um composto de temperatura de corte ideal usando uma seringa de 30 G, até que o olho tenha uma aparência arredondada (aproximadamente 50 μL).
5. Incorpore os olhos em um criomuldo com composto de temperatura de corte ideal até que os olhos estejam cobertos e congelem a -80 °C até que estejam prontos para a criosecção.
6. A seção incorporou os olhos a 20 μm em lâminas de vidro usando um criostato.
   1. Remova o bloco composto de temperatura de corte ideal do criomolde.
   2. Coloque-o no mandril do criostato adicionando o composto de temperatura de corte ideal e colocando o bloco no manuseio. Deixe-o dentro do criostato até congelar.
   3. Prossiga para cortar o bloco a 20 μm até que o tecido da retina seja visto.
      NOTA: Isso pode ser confirmado com um microscópio de luz com ampliação de 30x (objetiva de 3x, oculares de 10x). Os tecidos podem ser distinguidos dos meios OCT por cor e forma.
   4. Colete o tecido da retina em lâminas de microscópio em uma série de quatro seções por lâmina.
      NOTA: Consulte a Figura 1A para sugerir a colocação de seções da retina.
7. Rotule os slides com um ID que desidentifique o tratamento e o genótipo.
8. Conservar as lâminas a -20 °C até à coloração.

2. Imuno-histoquímica

NOTA: Use tecido criopreservado fixo para imuno-histoquímica para manter a morfologia celular. Escolha seções que estejam no nível das imagens de tomografia de coerência óptica (OCT) adquiridas in vivo⁷. Use as duas primeiras séries de lâminas coletadas do criostato ou seções de 150 μm no tecido da retina.

1. Coloque os slides em uma câmara de deslizamento escura e úmida.
2. Permeabilização e bloqueio: Lave as seções transversais da retina com 300 μL de 1x PBS por 5 min para remover a OCT e descartar depois.
3. Permeabilizar o tecido adicionando 300 μL de 1x PBS com Triton X-100 a 0,1% por 2 h à temperatura ambiente (RT) e descartar após.
4. Bloquear o tecido adicionando 300 μL de tampão bloqueador (10% de soro de cabra normal (NGS), 1% de albumina sérica bovina (BSA) em 1x PBS, filtrado) e deixar durante a noite a 4 °C.
5. Anticorpos primários: Diluem os anticorpos primários em tampão de bloqueio. Os anticorpos primários utilizados incluem anti-cl-caspase-9 à 1:800, anti-CD31 à 1:50 e anti-caspase-7-488 (anticorpo marcado directamente) à 1:150.
   NOTA: Siga as recomendações do fabricante para a diluição adequada dos anticorpos primários.
   1. Despeje o tampão de bloqueio das seções e aplique 100 μL do coquetel de anticorpos primários nas lâminas da retina.
   2. Incubar as secções transversais durante a noite a 4 °C.
6. Lave as seções quatro vezes por 5 min com 300 μL de 1x PBS.
   NOTA: Se as seções de tecido forem muito frágeis, as lavagens devem ser removidas usando ação capilar, aplicando um tecido no canto da lâmina para evitar o deslocamento das seções da retina.
7. Para evitar a marcação cruzada de anticorpos primários criados na mesma espécie hospedeira, complete a coloração com anticorpos secundários antes de aplicar os anticorpos diretamente marcados.
8. Anticorpos secundários: Diluir os anticorpos secundários em tampão de bloqueio a uma concentração de 0,1%. Por exemplo, para detectar anti-cl-caspase-9, um anticorpo criado em coelho, use cabra-anti-coelho-568 secundário.
   1. Aplique 200 μL do coquetel de anticorpos secundários nas retinas.
   2. Incubar o tecido por 2 h no RT.
   3. Lave as seções quatro vezes por 5 min com 300 μL de 1x PBS.
   4. Coloração dos núcleos por 5 min com 300 μL de DAPI a uma diluição de 0,02%.
9. Lave uma vez por 5 min com 300 μL de 1x PBS.
10. Coloque uma tampa nas seções da retina usando 500 μL de meio fluoromount-G, que preserva o sinal fluorescente, e coloque cuidadosamente a tampa na parte superior da lâmina, evitando bolhas.

3. Imagem confocal

1. Adquira imagens das seções coradas com microscopia confocal.
   1. Ligue o microscópio confocal.
   2. Coloque o slide no palco.
   3. Ajuste o foco para ver a seção da retina claramente.
      NOTA: Tire pelo menos quatro imagens por seção e imagem quatro seções por retina. Consulte o esquema de imagem da retina para áreas de imagem sugeridas (Figura 1B, C).
2. Imagem de caspase, coloração vascular e nuclear usando um microscópio confocal que possui aquisição de pilha Z, usando uma objetiva de 20x ou 40x.
   NOTA: Os parâmetros de imagem e a configuração do software devem ser constantes para todas as imagens em um experimento. O objetivo de 20x fornece uma visão geral das camadas da retina, que são bem definidas pela coloração nuclear. A objetiva de 40x fornece mais detalhes celulares.
   1. Defina os tempos apropriados de exposição e intensidade do laser por canal clicando em adquirir configurações.
   2. Defina a pilha Z para visualizar toda a seção clicando em Série Z e configure parâmetros para cima e para baixo para cobrir a profundidade do tecido.
3. Salve as imagens seguindo o ID mascarado atribuído durante a criossecção.

4. Quantificação dos níveis de caspase

1. Arraste arquivos de imagem de 405, 470, 555 e 640 canais para o console da FIJI.
2. Clique em Imagem > Cores > Mesclar Canais.
3. Atribua cores aos arquivos da seguinte maneira: vermelho a 555, verde a 470, cinza a 405, ciano a 640.
4. Comprima a pilha Z clicando em Imagem > Pilha > Projeto Z.
5. Clique em Tipo de projeção: intensidade máxima.
6. Abra a Interface de Canais clicando em Imagem > Ferramenta de Canais de Cor.
7. Abra a interface Brilho e Contraste .
8. Selecione parâmetros por canal.
   1. Vá para Canais e selecione um canal.
   2. Coloque o cursor sobre a célula expressa caspase e anote o valor do pixel.
   3. Coloque o cursor sobre o plano de fundo e anote o valor do pixel.
9. Parâmetros de teste
   1. Vá para a interface Brilho e Contraste.
   2. Clique em Selecionar.
   3. Conecte o valor mínimo exibido (valor de pixel anotado da célula expressa caspase).
   4. Conecte o valor máximo exibido (valor de pixel anotado do plano de fundo).
   5. Clique em Ok.
10. Repita as etapas 4.8-4.9 para todos os canais.
11. Teste os parâmetros escolhendo imagens aleatórias de tecido cego.
    Observação : edite os parâmetros de brilho e contraste somente se o valor de plano de fundo não for adequado para outras imagens.
12. Uma vez que os parâmetros são definidos, abra os arquivos de imagem e comprima a pilha Z.
13. Adicione os parâmetros de brilho e contraste para o canal de caspase e a isolectina, canal marcador vascular.
14. Use a ferramenta de ponto para quantificar o número de áreas vasculares positivas usando a colocalização do marcador vascular com expressão de caspase como leitura de áreas positivas.
15. Repita o passo 4.14, mas utilizando Hoechst como marcador de áreas neuronais positivas.
16. Anote os valores em uma planilha por imagem.
17. Média dos valores por seção.
18. Média dos valores de seção - esta será a leitura por olho.

5. Confirmação genética da relevância da caspase de células endoteliais-9

1. Utilizar retinas obtidas dos camundongos Casp9FL/FL-VECad-CreERT2 submetidos ao RVO⁷.
2. Imunocorar as retinas para caspase-9 (a caspase eliminada), caspase-7 (uma caspase efetora a jusante), marcadores vasculares e DAPI, conforme descrito acima na secção 2.
3. Fotografar e quantificar conforme descrito acima nas seções 3 e 4.

6. Visando a caspase-9 no RVO

1. Obter olhos dos camundongos submetidos a RVO seguido da aplicação do inibidor de caspase-9 Pen1-XBir3 topicamente aos olhos como em⁷.
2. Imunocorar as retinas para caspase-7 (uma caspase efetora a jusante), marcadores vasculares e DAPI, conforme descrito acima na secção 2.
3. Fotografar e quantificar conforme descrito acima nas seções 3 e 4.

Resultados

O protocolo descrito permite ao usuário analisar e quantificar os níveis de caspase-9 no tecido da retina. Além disso, apresenta ferramentas para identificar, validar e direcionar especificamente a caspase-9 e os substratos a jusante. As etapas resumidas permitem a análise quantificável dos níveis de caspase e da especificidade celular em fotomicrografias fluorescentes. Todas as figuras mostram fotomicrografias representativas e quantificação dos níveis de caspase indicados na retina total, células endoteliais ...

Discussão

As caspases são uma família de proteases com vários membros melhor estudada por seus papéis na morte celular e inflamação; no entanto, mais recentemente, uma variedade de funções de não-morte tem sido descoberta para alguns membros da família ^4,5. Grande parte da nossa compreensão da função da caspase é derivada do trabalho em cultura de células e de dados inferenciais de doenças humanas. Embora seja apreciado que haja indução, ativação ou ina...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
anti-Caspase-7 488	Novus Biologicals	NB-56529AF488	use at 1:150
anti-cl-Caspase-9	Cell Signaling	9505-S	use at 1:800
anti-CD31	BD Pharmingen	553370	use at 1:50
Confocal Spinning Disc Microscope	Biovision
FIJI 2.3.0	open source
Fluormount G	Fisher	50-187-88
Forcep	Roboz	RS-5015
iCasp9FL/FL X VECad-CreERT2 mice	lab generated		see Avrutsky 2020
Isolectin (594, 649)	Vector	DL-1207	use at 1:200
Ketamine Hydrochloride	Henry Schein	NDC: 11695-0702-1
Perfusion pump	Masterflex
Pen1-XBir3	lab generated		see Avrutsky 2020
Prism 9.1	GraphPad
Tissue-Tek O.C.T.	Fisher	14-373-65
Vis-a-View 4.0	Visitron Systems
Xylazine	Akorn	NDCL 59399-110-20