網膜組織における免疫染色カスパーゼ-9の定量

要約

ここでは、複雑な組織における機能的に関連するカスパーゼを同定、検証、標的化するための詳細な免疫組織化学プロトコルを示します。

要約

カスパーゼのファミリーは、細胞分化、軸索経路探索、増殖など、細胞死以外の多くの細胞経路を媒介することが知られています。細胞死プロテアーゼのファミリーの同定以来、発生、健康、および疾患状態における特定のファミリーメンバーの機能を特定および拡張するためのツールが検索されてきました。しかしながら、広く使用されている現在市販されているカスパーゼツールの多くは、標的カスパーゼに特異的ではない。このレポートでは、新しい阻害剤と免疫組織化学的読み出しによる遺伝的アプローチを使用して、神経系のカスパーゼ-9を同定、検証、および標的にするために使用したアプローチについて説明します。具体的には、網膜神経組織をモデルとして、カスパーゼの存在と機能を特定および検証しました。このアプローチは、細胞型特異的なアポトーシスおよび非アポトーシスカスパーゼ-9機能の調査を可能にし、関心のある他の複雑な組織およびカスパーゼに適用することができます。カスパーゼの機能を理解することは、細胞生物学における現在の知識を広げるのに役立ち、また、カスパーゼが疾患に関与しているため、潜在的な治療標的を特定するのにも有利です。

概要

カスパーゼは、疾患における発生細胞死、免疫応答、および異常な細胞死を調節するプロテアーゼのファミリーです^1,2。カスパーゼファミリーのメンバーがさまざまな神経変性疾患に誘導されることはよく知られていますが、どのカスパーゼが疾患の病理を引き起こすかを理解することはより困難です³。このような研究には、個々のカスパーゼファミリーメンバーの機能を特定、特徴付け、および検証するためのツールが必要です。文献にはカスパーゼの多様な役割の証拠を提供する複数の研究があるため、関連する個々のカスパーゼを解析することは、機構と治療の両方の観点から重要です^4,5。したがって、治療上の利益のために疾患のカスパーゼを標的にすることが目標である場合、関連する家族を特異的に標的とすることが重要です。組織内のカスパーゼレベルを検出する従来の技術には、ウェスタンブロッティング、酵素および蛍光測定アプローチが含まれます^3,6。ただし、これらの測定値ではカスパーゼレベルの細胞特異的検出はできず、一部のシナリオでは、切断されたカスパーゼは従来のタンパク質分析測定では検出できないことがよくあります。カスパーゼは同じ組織内で異なるアポトーシスと非アポトーシスの役割を果たすことが知られている⁷ため、発生経路と疾患経路を正確に理解するには、細胞特異的なカスパーゼレベルの慎重な特性評価が必要です。

この研究は、神経血管低酸素虚血-網膜静脈閉塞(RVO)のモデルにおけるカスパーゼの活性化と機能を示しています^7,8。網膜などの複雑な組織では、グリア細胞、ニューロン、血管系など、RVOで誘導される低酸素虚血の影響を受ける可能性のある複数の細胞型があります⁷。成体マウス網膜では、免疫組織化学(IHC)⁷によって測定されるように、健康な組織に明らかなカスパーゼの発現はほとんどありませんが、発生^中9または網膜疾患のモデルではそうではありません^10,11。IHCは、生物医学研究で確立された技術であり、疾患および病理学的標的の検証、空間的局在化による新しい役割の特定、およびタンパク質の定量を可能にしました。切断されたカスパーゼ産物がウェスタンブロットまたは蛍光分析によって検出できない場合、または明確なカスパーゼの特定の細胞位置または局在化によるカスパーゼシグナル伝達経路の調査では、IHCを使用する必要があります。

RVOに機能的に関連するカスパーゼを決定するために、IHCをカスパーゼおよび細胞マーカーの検証済み抗体とともに使用しました。研究室で実施された以前の研究では、カスパーゼ-9が虚血性脳卒中のモデルで急速に活性化され、神経機能障害と死から保護された高度に特異的な阻害剤によるカスパーゼ-9の阻害が示されました¹²。網膜は中枢神経系(CNS)の一部であるため、神経血管損傷におけるカスパーゼ-9の役割を照会し、さらに調査するためのモデルシステムとして機能します¹³。この目的のために、RVOのマウスモデルを使用して、カスパーゼ-9の細胞特異的な位置と分布、および神経血管損傷におけるその意味を研究しました。RVOは、血管損傷に起因する働く高齢者の失明の一般的な原因です¹⁴。カスパーゼ-9は内皮細胞では非アポトーシス的に発現するが、ニューロンでは発現しないことがわかった。

組織として、網膜は、血管網の鑑賞を可能にするフラットマウント、またはニューロン網膜層を強調する断面として視覚化されるという利点があります。断面におけるカスパーゼタンパク質発現の定量化は、網膜におけるカスパーゼの局在を特定することにより、網膜ニューロンの接続性と視覚機能においてどのカスパーゼが潜在的に重要であるかに関するコンテキストを提供します。同定および検証の後、目的のカスパーゼのターゲティングは、同定されたカスパーゼの誘導性細胞特異的欠失を用いて達成される。潜在的な治療上の問い合わせのために、関心のあるカスパーゼの関連性を、活性化されたカスパーゼを阻害するための特定のツールを使用してテストしました。カスパーゼ-9細胞パーサルインした高選択的阻害剤^7,15については、Pen1-XBIR3を用いた。本報告では、生後2ヶ月の雄C57BL/6J株およびタモキシフェン誘導性内皮カスパーゼ-9ノックアウト(iEC Casp9KO)株を使用し、C57BL/6Jをバックグラウンドとした。これらの動物をRVOのマウスモデルに曝露し、C57BL/6Jをカスパーゼ-9選択的阻害剤Pen1-XBir3で治療した。記載された方法論は、中枢系および末梢系における疾患の他のモデルに適用することができる^7、15。

プロトコル

このプロトコルは、眼科および視覚研究における動物の使用に関する視覚眼科研究協会(ARVO)の声明に従います。げっ歯類の実験は、コロンビア大学の施設動物管理使用委員会(IACUC)によって承認および監視されました。

1.網膜組織の調製と凍結切片

1. 腹腔内麻酔(ケタミン(80-100 mg/kg)およびキシラジン(5-10 mg/kg))を投与して動物を安楽死させ、RVO(詳細は⁸ を参照)を施したマウスに蠕動ポンプを用いて4%パラホルムアルデヒド(PFA)を灌流する。
   注:安楽死と灌流を進める前に、動物をつまんで麻酔の深さを確認してください。灌流に関する詳細は¹⁶にあります。
2. 鉗子を使用して慎重に除核して目を収穫し、地球を1mLの4%PFAに入れます。4°Cで一晩放置します。 目を10分間3回洗い、1 mLの1x PBSを加えてシェーカーに入れます。
3. 1mLの30%スクロースに3日間、チューブの底に落ち着くまで目を浸し、スクロースの吸収を示します。
4. 目が丸みを帯びた外観(約50μL)になるまで、30 Gシリンジを使用して最適な切断温度コンパウンドで目を満たします。
5. 目が覆われるまで、最適な切断温度コンパウンドを含むクライオモールドに目を埋め込み、凍結切開の準備ができるまで-80°Cで凍結します。
6. 切片は、クライオスタットを使用してスライドガラス上に20μmで目を埋め込みました。
   1. クライオモールドから最適な切削温度のコンパウンドブロックを取り外します。
   2. 最適な切断温度コンパウンドを添加し、ブロックをチャックの上に置いて、クライオスタットチャックに置きます。凍結するまでクライオスタットの中に置いておきます。
   3. 網膜組織が見えるまで、ブロックを20μmで切断します。
      注:これは、30倍の倍率(対物レンズ3倍、接眼レンズ10倍)の光学顕微鏡で確認できます。組織は、色と形状によってOCTメディアと区別できます。
   4. 網膜組織を顕微鏡スライドに、スライドごとに一連の4つのセクションに集めます。
      注:網膜切片の推奨される配置については 、図1A を参照してください。
7. スライドに、治療法と遺伝子型を識別できないIDを付けます。
8. スライドは染色されるまで-20°Cで保存します。

2. 免疫組織化学

注:細胞形態を維持するために、免疫組織化学に固定凍結保存された組織を使用してください。 in vivo⁷で取得した光干渉断層撮影(OCT)画像のレベルにある切片を選択します。クライオスタットから採取した最初の2つの一連のスライド、または150μmの切片を網膜組織に使用します。

1. スライドを暗くて湿気の多いスライドチャンバーに置きます。
2. 透過処理とブロッキング:網膜断面を300 μLの1x PBSで5分間洗浄し、OCTを除去し、その後廃棄します。
3. 300 μLの1x PBSを0.1%Triton X-100と共に室温(RT)で2時間添加して組織を透過処理し、その後廃棄します。
4. 300 μLのブロッキングバッファー(10%正常ヤギ血清(NGS)、1%ウシ血清アルブミン(BSA)を1x PBSでろ過)を加えて組織をブロックし、4°Cで一晩放置します。
5. 一次抗体:一次抗体をブロッキングバッファーで希釈します。使用される一次抗体には、1:800の抗cl-カスパーゼ-9、1:50の抗CD31、および1:150の抗カスパーゼ-7-488(直接標識抗体)が含まれます。
   注:一次抗体の適切な希釈については、製造元の推奨に従ってください。
   1. ブロッキングバッファーを切片から流し、100 μLの一次抗体カクテルを網膜スライドに塗布します。
   2. 断面を4°Cで一晩インキュベートします。
6. 切片を300 μLの1x PBSで5分間4回洗浄します。
   注意: 組織切片が非常に壊れやすい場合は、網膜切片がずれないように、スライドの角に組織を適用して毛細管現象を使用して洗浄液を除去する必要があります。
7. 同じ宿主種で産生された一次抗体の交差標識を回避するには、直接標識抗体を適用する前に二次抗体による染色を完了してください。
8. 二次抗体:二次抗体をブロッキングバッファーで0.1%の濃度で希釈します。例えば、ウサギで産生された抗体である抗cl-カスパーゼ-9を検出するには、ヤギ抗ウサギ-568二次を使用します。
   1. 200 μLの二次抗体カクテルを網膜に塗布します。
   2. RTで2時間組織をインキュベートします。
   3. 切片を300 μLの1x PBSで5分間4回洗浄します。
   4. 核を300 μLのDAPIで0.02%の希釈率で5分間染色します。
9. 300 μLの1x PBSで5分間1回洗浄します。
10. 蛍光シグナルを保存する500 μLのフルオロマウントG培地を使用して網膜切片にカバーガラスを置き、気泡を避けてスライドの上部にカバーガラスを慎重に置きます。

3. 共焦点イメージング

1. 共焦点顕微鏡で染色切片の画像を取得します。
   1. 共焦点顕微鏡の電源を入れます。
   2. スライドをステージに置きます。
   3. 網膜セクションがはっきりと見えるようにフォーカスを調整します。
      注:セクションごとに少なくとも4つの画像を撮り、網膜ごとに4つのセクションを画像化します。推奨されるイメージング領域については、網膜イメージングの概略図を参照してください(図1B、C)。
2. カスパーゼ、血管、核の染色を、Zスタック取得が可能な共焦点顕微鏡で、20倍または40倍の対物レンズを使用して画像化します。
   注意: イメージングパラメータとソフトウェア設定は、実験のすべてのイメージングで一定である必要があります。20倍対物レンズは、核染色によって明確に定義される網膜層の概要を提供します。40倍の対物レンズは、よりセルラーの詳細を提供します。
   1. チャンネルごとに適切な露出とレーザー強度の時間を設定するには、[ 設定の取得]をクリックします。
   2. Zシリーズをクリックしてセクション全体を視覚化するように Z スタックを設定し、組織の深さをカバーするように上下のパラメータを設定します。
3. 凍結切片中に割り当てられたマスクされたIDに従って画像を保存します。

4.カスパーゼレベルの定量化

1. 405、470、555、および640チャンネルの画像ファイルをFIJIのコンソールにドラッグします。
2. 「 画像>カラー」をクリックして>チャンネルを結合します。
3. 赤を 555、緑を 470、灰色を 405、シアンを 640 に、ファイルに色を割り当てます。
4. Z スタックを圧縮するには 、[Z プロジェクト>イメージ>スタック] をクリックします。
5. [ 投影タイプ: 最大強度]をクリックします。
6. をクリックしてチャンネルインターフェイスを開きます 画像>カラーチャンネルツール.
7. 明るさとコントラストのインターフェースを開きます。
8. チャンネルごとにパラメータを選択します。
   1. [チャンネル] に移動し、チャンネルを 1 つ選択します。
   2. カスパーゼ発現セルの上にカーソルを置き、ピクセル値に注釈を付けます。
   3. 背景の上にカーソルを置き、ピクセル値に注釈を付けます。
9. テストパラメータ
   1. 明るさとコントラストのインターフェースに移動します。
   2. [ 選択] をクリックします。
   3. 表示される最小値(カスパーゼ発現セルの注釈付きピクセル値)を差し込みます。
   4. 最大表示値(背景の注釈付きピクセル値)を差し込みます。
   5. OK をクリックします。
10. すべてのチャンネルに対して手順4.8〜4.9を繰り返します。
11. 盲検組織からランダムな画像を選択してパラメータをテストします。
    注意: 明るさとコントラストのパラメータは、背景値が他の画像に対して適切でない場合にのみ編集してください。
12. パラメータを設定したら、画像ファイルを開き、Zスタックを圧縮します。
13. カスパーゼチャネルとイソレクチン、血管マーカーチャネルの明るさとコントラストのパラメーターを追加します。
14. ポイントツールを使用して、カスパーゼ発現を伴う血管マーカーの共局在を陽性領域の読み出しとして使用して、血管陽性領域の数を定量化します。
15. 手順4.14を繰り返しますが、ニューロン陽性領域のマーカーとしてHoechstを使用します。
16. 画像ごとにスプレッドシートの値に注釈を付けます。
17. セクションごとに値を平均します。
18. セクション値を平均します-これは目ごとの読み出しになります。

5.内皮細胞カスパーゼ-9の関連性の遺伝的確認

1. RVO⁷に供したCasp9FL/FL-VECad-CreERT2マウスから得られた網膜を使用する。
2. 上記のセクション2で説明したように、カスパーゼ-9(欠失したカスパーゼ)、カスパーゼ-7(下流のエフェクターカスパーゼ)、血管マーカー、およびDAPIの網膜を免疫染色します。
3. 上記のセクション3および4で説明したように、画像化および定量化します。

6. RVOにおけるカスパーゼ-9の標的化

1. RVOを施したマウスから、カスパーゼ-9阻害剤Pen1-XBir3を⁷と同様に眼に局所塗布して眼から眼を得る。
2. 上記のセクション2で説明したように、カスパーゼ-7(下流エフェクターカスパーゼ)、血管マーカー、およびDAPIの網膜を免疫染色します。
3. 上記のセクション3および4で説明したように、画像化および定量化します。

結果

記載されたプロトコルは、ユーザが網膜組織におけるカスパーゼ−9レベルを分析および定量化することを可能にする。さらに、カスパーゼ-9および下流の基質をさらに同定、検証、および特異的に標的とするためのツールを提示します。要約されたステップにより、蛍光顕微鏡写真におけるカスパーゼレベルと細胞特異性の定量化可能な分析が可能になります。すべての図は、代表的な顕微?...

ディスカッション

カスパーゼは、細胞死と炎症における役割について最もよく研究されているプロテアーゼの多員ファミリーです。しかし、最近では、一部の家族についてさまざまな非死亡機能が発見されています^4,5。カスパーゼ機能に関する私たちの理解の多くは、細胞培養の研究とヒトの病気からの推論データに由来しています。疾患においてカスパーゼの異?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
anti-Caspase-7 488	Novus Biologicals	NB-56529AF488	use at 1:150
anti-cl-Caspase-9	Cell Signaling	9505-S	use at 1:800
anti-CD31	BD Pharmingen	553370	use at 1:50
Confocal Spinning Disc Microscope	Biovision
FIJI 2.3.0	open source
Fluormount G	Fisher	50-187-88
Forcep	Roboz	RS-5015
iCasp9FL/FL X VECad-CreERT2 mice	lab generated		see Avrutsky 2020
Isolectin (594, 649)	Vector	DL-1207	use at 1:200
Ketamine Hydrochloride	Henry Schein	NDC: 11695-0702-1
Perfusion pump	Masterflex
Pen1-XBir3	lab generated		see Avrutsky 2020
Prism 9.1	GraphPad
Tissue-Tek O.C.T.	Fisher	14-373-65
Vis-a-View 4.0	Visitron Systems
Xylazine	Akorn	NDCL 59399-110-20