Quantification de la caspase-9 immunocolorée dans le tissu rétinien

Résumé

Un protocole d’immunohistochimie détaillé est présenté ici pour identifier, valider et cibler les caspases fonctionnellement pertinentes dans les tissus complexes.

Résumé

La famille des caspases est connue pour arbitrer de nombreuses voies cellulaires au-delà de la mort cellulaire, y compris la différenciation cellulaire, la recherche axonale et la prolifération. Depuis l’identification de la famille des protéases de mort cellulaire, il y a eu une recherche d’outils pour identifier et élargir la fonction de membres spécifiques de la famille dans les états de développement, de santé et de maladie. Cependant, bon nombre des outils de caspase actuellement disponibles dans le commerce qui sont largement utilisés ne sont pas spécifiques pour les caspases ciblées. Dans ce rapport, nous décrivons l’approche que nous avons utilisée pour identifier, valider et cibler la caspase-9 dans le système nerveux à l’aide d’un nouvel inhibiteur et d’approches génétiques avec des lectures immunohistochimiques. Plus précisément, nous avons utilisé le tissu neuronal rétinien comme modèle pour identifier et valider la présence et la fonction des caspases. Cette approche permet l’interrogation des fonctions apoptotiques et non apoptotiques de caspase-9 spécifiques au type cellulaire et peut être appliquée à d’autres tissus complexes et caspases d’intérêt. Comprendre les fonctions des caspases peut aider à élargir les connaissances actuelles en biologie cellulaire et peut également être avantageux pour identifier des cibles thérapeutiques potentielles en raison de leur implication dans la maladie.

Introduction

Les caspases sont une famille de protéases qui régulent la mort cellulaire développementale, les réponses immunitaires et la mort cellulaire aberrante dans la maladie ^1,2. Bien qu’il soit bien connu que les membres de la famille des caspases sont induits dans une variété de maladies neurodégénératives, comprendre quelle caspase est à l’origine de la pathologie de la maladie est plus difficile³. De telles études nécessitent des outils pour identifier, caractériser et valider la fonction des membres individuels de la famille des caspases. L’analyse des caspases individuelles pertinentes est importante tant d’un point de vue mécaniste que thérapeutique, car la littérature contient de nombreuses études fournissant des preuves des divers rôles des caspases ^4,5. Ainsi, si l’objectif est de cibler une caspase dans une maladie pour un bénéfice thérapeutique, il est essentiel d’avoir un ciblage spécifique du ou des membres de la famille concernés. Les techniques traditionnelles de détection des niveaux de caspases dans les tissus comprennent le transfert Western et les approches enzymatiques et fluorométriques ^3,6. Cependant, aucune de ces mesures ne permet la détection spécifique des niveaux de caspases par les cellules et, dans certains scénarios, les caspases clivées ne peuvent souvent pas être détectées par les mesures traditionnelles d’analyse des protéines. On sait que les caspases peuvent jouer différents rôles apoptotiques et non apoptotiques dans le même tissu⁷, c’est pourquoi une caractérisation minutieuse des niveaux de caspases spécifiques aux cellules est nécessaire pour une compréhension précise des voies de développement et de la maladie.

Cette étude montre l’activation et la fonction des caspases dans un modèle d’hypoxie-ischémie neurovasculaire - occlusion veineuse rétinienne (OVR)^7,8. Dans un tissu complexe tel que la rétine, il existe plusieurs types de cellules qui peuvent être affectées par l’hypoxie-ischémie induite dans l’OVR, y compris les cellules gliales, les neurones et le système vasculaire⁷. Dans la rétine de souris adulte, il y a très peu d’expression des caspases évidente dans les tissus sains, telle que mesurée par immunohistochimie (IHC)⁷, mais ce n’est pas le cas au cours du développement⁹ ou dans les modèles de maladie rétinienne^10,11. L’IHC est une technique bien établie dans la recherche biomédicale qui a permis de valider des cibles pathologiques et pathologiques pathologiques et d’identifier de nouveaux rôles grâce à la localisation spatiale et de quantifier les protéines. Dans les cas où les produits de caspases clivés ne peuvent pas être détectés par transfert Western ou analyse fluorométrique, ni par l’emplacement cellulaire spécifique de caspases distinctes ou l’interrogation des voies de signalisation des caspases par localisation, alors IHC devrait être utilisé.

Afin de déterminer la ou les caspases fonctionnellement pertinentes dans l’OVR, l’IHC a été utilisée avec des anticorps validés pour les caspases et les marqueurs cellulaires. Les études précédentes réalisées en laboratoire ont montré que la caspase-9 était rapidement activée dans un modèle d’AVC ischémique et d’inhibition de la caspase-9 avec un inhibiteur hautement spécifique protégé du dysfonctionnement neuronal et de la mort¹². Parce que la rétine fait partie du système nerveux central (SNC), elle sert de système modèle pour interroger et étudier plus en détail le rôle de la caspase-9 dans les lésions neurovasculaires¹³. À cette fin, le modèle murin de RVO a été utilisé pour étudier l’emplacement et la distribution spécifiques des cellules de la caspase-9 et son implication dans les lésions neurovasculaires. La RVO est une cause fréquente de cécité chez les adultes en âge de travailler qui résulte d’une lésion vasculaire¹⁴. Il a été constaté que la caspase-9 était exprimée de manière non apoptotique dans les cellules endothéliales, mais pas dans les neurones.

En tant que tissu, la rétine a l’avantage d’être visualisée soit comme un montage plat, ce qui permet d’apprécier les réseaux vasculaires, soit comme des coupes transversales, ce qui met en évidence les couches neuronales de la rétine. La quantification de l’expression de la protéine caspase dans les coupes transversales fournit un contexte, en ce qui concerne la caspase potentiellement critique dans la connectivité neuronale rétinienne et la fonction de vision en identifiant la localisation de la ou des caspases dans la rétine. Après identification et validation, le ciblage de la caspase d’intérêt est réalisé en utilisant la délétion spécifique de la cellule inductible de la caspase identifiée. Pour les recherches thérapeutiques potentielles, la pertinence des caspases d’intérêt a été testée à l’aide d’outils spécifiques pour inhiber les caspases activées. Pour la caspase-9, un inhibiteur hautement sélectif de la permération cellulaire ^7,15, Pen1-XBIR3 a été utilisé. Aux fins du présent rapport, on a utilisé la souche mâle C57BL/6J âgée de 2 mois et la souche knockout endothéliale inductible par le tamoxifène (iEC Casp9KO) avec un fond C57BL/6J. Ces animaux ont été exposés au modèle murin de RVO et C57BL/6J ont été traités avec l’inhibiteur sélectif de la caspase-9, Pen1-XBir3. La méthodologie décrite peut être appliquée à d’autres modèles de maladie dans les systèmes central et périphérique ^7,15.

Protocole

Ce protocole suit la déclaration de l’Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) pour l’utilisation des animaux dans la recherche en ophtalmologie et en vision. Les expériences sur les rongeurs ont été approuvées et surveillées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université Columbia.

1. Préparation du tissu rétinien et cryosectionnement

1. Euthanasier les animaux par administration d’anesthésie intrapéritonéale (kétamine (80-100 mg/kg) et xylazine (5-10 mg/kg)), et perfuser les souris soumises à la RVO (voir⁸ pour plus de détails) avec 4% de paraformaldéhyde (PFA) à l’aide d’une pompe péristaltique.
   REMARQUE : Pincez l’animal pour confirmer la profondeur de l’anesthésie avant de procéder à l’euthanasie et à la perfusion. Des détails sur la perfusion peuvent être trouvés dans¹⁶.
2. Récoltez les yeux par énucléation soigneuse à l’aide d’une pince et mettez le globe dans 1 mL de PFA à 4%. Laisser les yeux toute la nuit à 4 °C. Lavez les yeux trois fois pendant 10 minutes, en ajoutant 1 ml de 1x PBS et en les plaçant dans le shaker.
3. Plonger les yeux dans 1 mL de saccharose à 30% pendant 3 jours, jusqu’à ce qu’ils se déposent au fond du tube, indiquant l’absorption du saccharose.
4. Remplissez les yeux avec un composé à température de coupe optimale à l’aide d’une seringue de 30 G, jusqu’à ce que l’œil ait un aspect arrondi (environ 50 μL).
5. Incorporer les yeux dans un cryomoule avec un composé à température de coupe optimale jusqu’à ce que les yeux soient couverts et congeler à -80 °C jusqu’à ce qu’ils soient prêts à être cryosectionnés.
6. Section a encastré les yeux à 20 μm sur des lames de verre à l’aide d’un cryostat.
   1. Retirez le bloc composé à température de coupe optimale du cryomoule.
   2. Placez-le sur le mandrin du cryostat en ajoutant un composé à température de coupe optimale et en plaçant le bloc sur le mandrin. Laissez-le à l’intérieur du cryostat jusqu’à ce qu’il gèle.
   3. Procéder à la coupe du bloc à 20 μm jusqu’à ce que le tissu rétinien soit visible.
      REMARQUE: Cela peut être confirmé avec un microscope optique à grossissement 30x (objectif 3x, oculaires 10x). Les tissus peuvent être distingués des médias OCT par leur couleur et leur forme.
   4. Recueillir le tissu rétinien dans des lames de microscope en une série de quatre sections par lame.
      REMARQUE : Voir la figure 1A pour la mise en place suggérée de coupes rétiniennes.
7. Étiquetez les lames avec un ID qui anonymise le traitement et le génotype.
8. Conserver les lames à -20 °C jusqu’à coloration.

2. Immunohistochimie

REMARQUE: Utilisez des tissus cryoconservés fixes pour l’immunohistochimie afin de maintenir la morphologie cellulaire. Choisir des sections qui se trouvent au niveau des images de tomographie par cohérence optique (TCO) acquises in vivo⁷. Utilisez les deux premières séries de lames prélevées sur le cryostat ou des coupes de 150 μm dans le tissu rétinien.

1. Placez les lames dans une chambre à glissière sombre et humide.
2. Perméabilisation et blocage: Laver les sections transversales rétiniennes avec 300 μL de 1x PBS pendant 5 min pour enlever l’OCT et jeter après.
3. Perméabiliser le tissu en ajoutant 300 μL de 1x PBS avec 0,1% de Triton X-100 pendant 2 h à température ambiante (RT) et jeter après.
4. Bloquer le tissu en ajoutant 300 μL de tampon bloquant (10% de sérum de chèvre normal (NGS), 1% de sérum albumine bovine (BSA) dans 1x PBS, filtré) et laisser reposer toute la nuit à 4 °C.
5. Anticorps primaires: Diluer les anticorps primaires dans le tampon de blocage. Les anticorps primaires utilisés comprennent l’anti-cl-caspase-9 à 1:800, l’anti-CD31 à 1:50 et l’anti-caspase-7-488 (anticorps marqué directement) à 1:150.
   REMARQUE : Suivez les recommandations du fabricant pour la dilution appropriée des anticorps primaires.
   1. Versez le tampon de blocage sur les sections et appliquez 100 μL du cocktail d’anticorps primaires sur les lames rétiniennes.
   2. Incuber les sections transversales pendant une nuit à 4 °C.
6. Lavez les sections quatre fois pendant 5 min avec 300 μL de 1x PBS.
   REMARQUE: Si les sections de tissu sont très fragiles, les lavages doivent être enlevés en capillarité en appliquant un mouchoir au coin de la lame pour éviter de déplacer les sections rétiniennes.
7. Pour éviter le marquage croisé des anticorps primaires élevés chez la même espèce hôte, complétez la coloration avec des anticorps secondaires avant d’appliquer les anticorps directement marqués.
8. Anticorps secondaires: Diluer les anticorps secondaires dans un tampon de blocage à une concentration de 0,1%. Par exemple, pour détecter l’anti-cl-caspase-9, un anticorps élevé chez le lapin, utilisez chèvre-anti-lapin-568 secondaire.
   1. Appliquer 200 μL du cocktail d’anticorps secondaires sur les rétines.
   2. Incuber le tissu pendant 2 h à TA.
   3. Lavez les sections quatre fois pendant 5 min avec 300 μL de 1x PBS.
   4. Colorer les noyaux pendant 5 min avec 300 μL de DAPI à une dilution de 0,02%.
9. Laver une fois pendant 5 min avec 300 μL de 1x PBS.
10. Placez un bordereau sur les sections rétiniennes à l’aide de 500 μL de média fluoromount-G, qui préserve le signal fluorescent, et placez soigneusement le bordereau sur le dessus de la lame, en évitant les bulles.

3. Imagerie confocale

1. Acquérir des images des coupes colorées avec la microscopie confocale.
   1. Allumez le microscope confocal.
   2. Placez la diapositive sur la scène.
   3. Ajustez la mise au point pour voir clairement la section rétinienne.
      REMARQUE: Prenez au moins quatre images par section et imagez quatre sections par rétine. Voir le schéma d’imagerie rétinienne pour les zones d’imagerie suggérées (Figure 1B, C).
2. Image de la caspase, de la coloration vasculaire et nucléaire à l’aide d’un microscope confocal doté d’une acquisition Z-stack, à l’aide d’un objectif 20x ou 40x.
   REMARQUE : Les paramètres d’imagerie et la configuration du logiciel doivent être constants pour toutes les images d’une expérience. L’objectif 20x donne un aperçu des couches rétiniennes, qui sont bien définies par la coloration nucléaire. L’objectif 40x fournit plus de détails cellulaires.
   1. Réglez les durées d’exposition et d’intensité laser appropriées par canal en cliquant sur Acquérir les paramètres.
   2. Réglez la pile Z pour visualiser toute la section en cliquant sur la série Z et configurez les paramètres pour couvrir la profondeur du tissu.
3. Enregistrez les images en suivant l’ID masqué attribué lors de la cryosection.

4. Quantification des teneurs en caspases

1. Faites glisser des fichiers image de 405, 470, 555 et 640 canaux vers la console FIJI.
2. Cliquez sur Image > Couleur > Fusionner les couches.
3. Attribuez des couleurs aux fichiers comme suit : rouge à 555, vert à 470, gris à 405, cyan à 640.
4. Compressez la pile Z en cliquant sur Image > Pile > Projet Z.
5. Cliquez sur Type de projection : intensité maximale.
6. Ouvrez l’interface des canaux en cliquant sur l’outil Image > Canaux de couleur.
7. Ouvrez l’interface Luminosité et contraste .
8. Sélectionnez les paramètres par canal.
   1. Accédez à Canaux et sélectionnez un canal.
   2. Placez le curseur au-dessus de la cellule exprimée en caspase et annotez la valeur en pixels.
   3. Placez le curseur au-dessus de l’arrière-plan et annotez la valeur en pixels.
9. Paramètres d’essai
   1. Accédez à l’interface Luminosité et contraste.
   2. Cliquez sur Sélectionner.
   3. Branchez la valeur minimale affichée (valeur en pixels annotée de la cellule exprimée en caspase).
   4. Branchez la valeur maximale affichée (valeur en pixels annotée de l’arrière-plan).
   5. Cliquez sur OK.
10. Répétez les étapes 4.8 à 4.9 pour tous les canaux.
11. Testez les paramètres en choisissant des images aléatoires à partir de tissus en aveugle.
    REMARQUE: Modifiez les paramètres de luminosité et de contraste uniquement si la valeur d’arrière-plan n’est pas adéquate pour d’autres images.
12. Une fois les paramètres définis, ouvrez les fichiers image et compressez la pile Z.
13. Ajoutez les paramètres de luminosité et de contraste pour le canal caspase et l’isolectine, canal marqueur vasculaire.
14. Utilisez l’outil de points pour quantifier le nombre de zones vasculaires positives en utilisant la colocalisation du marqueur vasculaire avec l’expression de la caspase comme lecture des zones positives.
15. Répétez l’étape 4.14 mais en utilisant Hoechst comme marqueur des zones neuronales positives.
16. Annotez les valeurs sur une feuille de calcul par image.
17. Faites la moyenne des valeurs par section.
18. Faites la moyenne des valeurs de section - ce sera la lecture par œil.

5. Confirmation génétique de la pertinence de la cellule endothéliale caspase-9

1. Utilisez des rétines obtenues à partir des souris Casp9FL/FL-VECad-CreERT2 qui ont été soumises à RVO⁷.
2. Immunocolorer les rétines pour la caspase-9 (la caspase supprimée), la caspase-7 (une caspase effectrice en aval), les marqueurs vasculaires et le DAPI comme décrit ci-dessus dans la rubrique 2.
3. Image et quantification comme décrit ci-dessus dans les sections 3 et 4.

6. Cibler la caspase-9 dans la RVO

1. Obtenir des yeux de souris soumises à la RVO suivie de l’application topique de l’inhibiteur de la caspase-9 Pen1-XBir3 sur les yeux comme dans⁷.
2. Immunocolorer les rétines pour la caspase-7 (une caspase effectrice en aval), les marqueurs vasculaires et le DAPI comme décrit ci-dessus à la rubrique 2.
3. Image et quantification comme décrit ci-dessus dans les sections 3 et 4.

Résultats

Le protocole décrit permet à l’utilisateur d’analyser et de quantifier les niveaux de caspase-9 dans le tissu rétinien. En outre, il présente des outils pour identifier, valider et cibler spécifiquement la caspase-9 et les substrats en aval. Les étapes résumées permettent une analyse quantifiable des niveaux de caspases et de la spécificité cellulaire dans les photomicrographies fluorescentes. Toutes les figures montrent des photomicrographies représentatives et une quantification des niveaux de caspases i...

Discussion

Les caspases sont une famille de protéases à plusieurs membres mieux étudiées pour leurs rôles dans la mort cellulaire et l’inflammation; Cependant, plus récemment, diverses fonctions non liées au décès ont été découvertes pour certains membres de la famille ^4,5. Une grande partie de notre compréhension de la fonction des caspases provient de travaux en culture cellulaire et de données inférentielles sur les maladies humaines. Bien qu’il soit r...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
anti-Caspase-7 488	Novus Biologicals	NB-56529AF488	use at 1:150
anti-cl-Caspase-9	Cell Signaling	9505-S	use at 1:800
anti-CD31	BD Pharmingen	553370	use at 1:50
Confocal Spinning Disc Microscope	Biovision
FIJI 2.3.0	open source
Fluormount G	Fisher	50-187-88
Forcep	Roboz	RS-5015
iCasp9FL/FL X VECad-CreERT2 mice	lab generated		see Avrutsky 2020
Isolectin (594, 649)	Vector	DL-1207	use at 1:200
Ketamine Hydrochloride	Henry Schein	NDC: 11695-0702-1
Perfusion pump	Masterflex
Pen1-XBir3	lab generated		see Avrutsky 2020
Prism 9.1	GraphPad
Tissue-Tek O.C.T.	Fisher	14-373-65
Vis-a-View 4.0	Visitron Systems
Xylazine	Akorn	NDCL 59399-110-20