הקמת מודל חזק וניתן לשחזור של פיברוזיס בעור ובשרירים הנגרמת על ידי קרינה

Summary

כאן אנו מציגים פרוטוקול להשראת פיברוזיס עורי הנגרמת על ידי קרינה בגפה האחורית של עכברים ומבצעים מדידות לאחר הקרנה של ליקוי כרוני באמצעות ניתוחי סטייה של הגפיים ומדד ההליכה כדי להעריך את התוצאה התפקודית. המודל מבהיר מנגנוני פיברוזיס של העור הקשורים לקרינה ושימושי במחקרים טיפוליים תת-קליניים.

Abstract

פיברוזיס עור הנגרמת על ידי קרינה (RISF) יכולה לנבוע משפע של תרחישים כולל טיפול בסרטן, חשיפה מקרית או פעולות טרור. קרניים רדיואקטיביות יכולות לחדור דרך העור ולהשפיע על המבנים בדרכן, כולל עור, שרירים ואיברים פנימיים. העור הוא המבנה הראשון שנחשף לקרינה והוא רגיש לפתח פיברוזיס כרוני, דבר מאתגר לטיפול. נכון לעכשיו, אפשרויות טיפול מוגבלות מראות יעילות בינונית בהפחתת פיברוזיס עורי הקשור לקרינה. גורם מרכזי המעכב את הפיתוח של אמצעי נגד יעילים הוא היעדר מודל נוח וחזק שיכול לאפשר תרגום של ממצאי הניסוי לבני אדם. כאן, הוקם מודל פיברוזיס של עור הגפיים האחוריות של עכברים חזק וניתן לשחזור להערכה מונעת וטיפולית של גורמים אפשריים להתאוששות תפקודית ומולקולרית.

הגפה האחורית הימנית הוקרנה באמצעות מנה אחת של 40 (אפור) Gy כדי לגרום לפיברוזיס בעור. הנבדקים פיתחו בצקת ודרמטיטיס בשלבים המוקדמים שנמשכו על ידי התכווצות עור נראית לעין. גפיים מוקרנות הראו טווח תנועה מופחת משמעותית של הגפיים בשבועות הבאים. בשלבים מאוחרים, תופעות הלוואי החריפות שככו, אך פיברוזיס כרוני נמשך. מדד הליכה בוצע כבדיקה תפקודית נוספת, שהדגימה התפתחות של ליקוי תפקודי. שיטות לא פולשניות אלה הדגימו מדידות אמינות למעקב אחר התקדמות פיברוזיס, הנתמכת על ידי ניתוחים היסטולוגיים. מינון הקרינה, היישום והניתוחים שלאחר ההקרנה המשמשים במודל זה מציעים שיטה נמרצת וניתנת לשחזור לחקר פיברוזיס בעור הנגרמת על ידי קרינה ובדיקת יעילותם של חומרים טיפוליים.

Introduction

העור הוא האיבר הגדול ביותר בגוף, המכסה ומגן על הגוף מפני סכנות. יש לו שלוש שכבות נפרדות: אפידרמיס, דרמיס והיפודרמיס. לכל שכבה יש את התפקידים הייחודיים שלה: האפידרמיס מונע התייבשות ופלישת חיידקים; לדרמיס רשת תאים עשירה, ומטריצה חוץ-תאית המספקת חוזק מתיחה וגמישות¹; שכבת העור מכילה את הקולטנים התחושתיים, זקיקי השיער, הבלוטות וכלי הדם לרשתות הלימפה והנימים. ההיפודרמיס או הרקמה התת עורית, עם שפע רקמת השומן שלה, מתארת את הגוף ומפיצה מתח מכני ^2,3,4.

קרינה, הנוצרת כתוצאה מתאונות, מלחמה, טרור או יישומים טיפוליים, חודרת דרך הגוף בטבע פרוגרסיבי ליניארי, ומובילה את העור להיות האיבר הראשון שבא במגע. האיום של תקריות כאלה התגבר עקב השימוש המוגבר בחומרים רדיואקטיביים בתעשיות, מתקנים רפואיים ומתקנים צבאיים⁵. מבחינה קלינית, נזקי קרינה לעור מאופיינת בתסמונת קרינה עורית (CRS), אחת מארבע תת-תסמונות של תסמונת קרינה חריפה (ARS). לתגובת העור לקרינה מייננת יש השלכות חשובות על הטיפול וההגנה מפני נזקים נוספים⁶. פציעות נלוות כגון כוויות וטראומה מסבכות עוד יותר את התוצאה הקלינית בשילוב עם פציעות קרינה⁷. מידת החשיפה של העור לקרינה קשורה לסף נקודת אל-חזור, שממנו פגיעה באיברים אחרים גורמת לכשל של איבר בודד או מרובה, ובסופו של דבר מובילה למוות של המטופל ^8,9. פגיעה בקרינה עורית מורכבת משלב אקוטי ושלב כרוני. פגיעת קרינה חריפה מתבטאת קלינית באריתמה, בצקת בעור, דרמטיטיס, שלפוחיות, כריתת אפידרמיס, קיבוע יבש או רטוב, כיב ושינויים בשיער ובציפורניים. השלב הכרוני מתבטא בניוון עור, פיברוזיס, כיב כרוני וטלנגיקטזיות^10,11. באופן כללי, השפעות חריפות באות לידי ביטוי בעיקר באפידרמיס, בעוד שהשפעות כרוניות בולטות ביותר בדרמיס. תגובה חריפה לחשיפה לקרינה מובילה לירידה ניכרת בפעילות המיטוטית תוך 12 שעות מהחשיפה, ואחריה היפרמיה, הגדלת תאים, ואקואוליזציה, פיקנוזיס גרעיני ופיצול ^4,12.

מינוני קרינה העולים על 40 Gy גורמים להתייבשות לחות ולאובדן האפידרמיס, מה שמוביל לרגישות מוגברת לזיהומים¹³. בנוסף, חשיפת העור לקרינה גורמת לייצור ציטוקינים, ומעוררת תגובה חיסונית דלקתית בשכבת העור. מתווכים דלקתיים בולטים כוללים אינטרלוקינים (IL-1, IL-3, IL-5, IL-6 ו-IL-8) וגורם נמק גידול-α (TNFα)¹⁴. כשל ברזולוציה של דלקת יכול בסופו של דבר לגרום להתפתחות פיברוזיס באתר פגיעת הקרינה¹⁵. פצעים פיזיים נוספים או פציעות תרמיות מחמירים עוד יותר את התגובה הפיברוטית הזו, המשתרעת דרך שכבת השריר¹⁶. גורם גדילה טרנספורמטיבי-β (TGFβ) הוא הציטוקין העיקרי בהתפתחות פיברוזיס¹⁷. נכון לעכשיו, מעט מאוד אפשרויות טיפול מראות תוצאות מבטיחות, ולרובן עשויים להיות אתגרים בהיענות המטופלים. מחקר נוסף הבוחן את התגובות התאיות והמולקולריות של העור למינוני קרינה שונים ישפר את ההבנה של פתופיזיולוגיה של העור הנגרמת על ידי קרינה וישפר את הפיתוח של טיפולים חדשים.

כדי להקל על התרגום הקליני של תוצאות מחקר במודלים פרה-קליניים בהקלה על פגיעה הנגרמת על ידי קרינה בעור וברקמות רכות, תכנון מודלים ניסיוניים רלוונטיים ביותר של התערבויות טיפוליות לאחר הקרנה הוא קריטי. תוארו גם מודלים במבחנה וגם ב-vivo של פגיעה הנגרמת על ידי קרינה, כולל מודלים של תרביות תאים של תאי אנדותל מוקרנים^18,19, פיברובלסטים²⁰ או קרטינוציטים¹⁹ ומודלים של מכרסמים, חזירים ופרימטים לא אנושיים. מודלים של מכרסמים נמצאים בשימוש נרחב במחקר קרינה בשל הדמיון שלהם בתגובה לפגיעת קרינה עם בני אדם וגמישותם במניפולציה גנטית²¹. דרישות מינון הקרינה גבוהות יותר במכרסמים מאשר בבני אדם כאשר מחפשים תוצאות דומות: קיבוע, פיברוזיס ונמק^16,22. תיאור קריטריוני הניקוד למדידת התגובה לקרינה שיפר עוד יותר את האימוץ של מודלים של מכרסמים של פגיעות עור קרינה^21,23.

המחקר הנוכחי בסביבה הפרה-קלינית מתמקד בהבנת המנגנונים של פגיעות עור הנגרמות על ידי קרינה ופיתוח אפשרויות טיפוליות. לפיכך, הקמת מודל פרה-קליני חזק וניתן לשחזור ליצירת עלבון קרינה עם יכולת תרגום קלינית גבוהה היא חיונית. עבודה זו מתארת מודל עכברי של פיברוזיס בעור עם מינון קרינה וטכניקת אספקה אופטימליים. המודל שלנו, המשלב מדידות פונקציונליות, היסטולוגיות ומולקולריות, יכול לשמש כדי לחקור ביעילות את מנגנון התפתחות הפיברוזיס ולחקור אפשרויות טיפוליות חדשות.

Protocol

שימוש אתי בבעלי חיים אושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC), הפועלת בהתאם לחוק רווחת בעלי חיים. בעלי חיים שוכנו במתקן שאושר על ידי האגודה להערכה והסמכה של Laboratory Animal Care International (AAALAC) וטופלו על פי המדריך הלאומי של המכונים הלאומיים לבריאות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה.

1. הרדמה

1. הניחו עכברים בקופסה של מערכת הרדמה של חיות קטנות (איור 1). העבירו 4% איזופלורן לקופסה והמתינו 5-10 דקות ואז הורידו את האיזופלורן ל-2-3%.
2. אשר את עומק ההרדמה באמצעות צביטת הבוהן. יש למרוח חומר סיכה לעיניים כדי למנוע יובש. העבר את הנבדק לחרוט האף עם זרימת איזופלורן של 2%.
3. השתמש בטכניקה לעיל כדי להרדים כל עכבר לצורך בדיקת גילוח ומדידת גפיים. השתמש במינון הזרקה תוך-צפקי של פנטוברביטל של 1.25 מ"ג/ק"ג כדי להרדים עכברים להקרנה.

2. הכנת אזור העור

1. תכנן לגלח את העכברים 2-3 ימים לפני ההקרנה. קצצו את השיער באמצעות קוצץ (איור 2A).
2. מרחו קרם להסרת שיער והמתינו 1-2 דקות (איור 2B). נגבו את הקרם עם גזה יבשה ושטפו את העור עם גזה ספוגה במי מלח פוספט (PBS) (איור 2C).

3. הליך הקרנה

1. להרדים כל עכבר בזריקה תוך צפקית הניתנת 5 דקות לפני ההקרנה. מקם את הגפה בשדה הקרינה (25 ס"מ על 25 ס"מ) ואבטח אותה עם סרט כירורגי (איור 3A-C).
2. הגבל את הגוף באמצעות סרט כירורגי (איור 3D). הניחו בולוס בעובי 1 ס"מ כדי למנוע/למזער חדירה עמוקה של קרינה (איור 3E).
3. חשב את גורמי המוליך והחתך כדי לספק 40 Gy לעור העכבר. לצורך הניסוי כאן, השתמש במאיץ ליניארי כדי ליצור אלומת אלקטרונים של 6 MeV עבור 3740 יחידות מוניטור כדי לגרום לכוויות קרינה. במצב זה, שדה קרינה של 25 ס"מ על 25 ס"מ במינון של 1,000 MU לדקה עם מרחק מקור לפני השטח (SSD) של 100 ס"מ, שהוא המרחק ממקור הקרינה לחלק העליון של הבולוס כדי לספק את ה-40 Gy. זמן ההקרנה ישתנה בהתאם למאיץ הליניארי בו נעשה שימוש, אנרגיית האלומה וגודל השדה. יש להתייעץ עם פיזיקאי קרינה או רפואי כדי לחשב את יחידות המוניטור הדרושות כדי לספק 40Gy על המאיץ הליניארי.

4. ניטור חזותי של התפתחות פיברוזיס

1. השתמש במצלמה דיגיטלית כף יד כדי לתעד את התקדמות הפיברוזיס. השתמש בהגדרת המאקרו כדי לצלם תמונות מפורטות.
2. הרדמת עכברים על ידי שאיפת איזופלורן.
3. צלם תמונות על ידי מיקום העדשה קרוב יותר לעור ולחץ על לכידה. נסה לשמור על עקביות התמונות ככל האפשר. יש להשאיר את הנבדק תחת השגחה ישירה עד להכרה מספקת כדי לשמור על שכיבה על עצם החזה.

5. מדידת סטיית רגליים כתוצר תפקודי של פיברוזיס

1. החל מהשבוע השלישי לאחר ההקרנה, תכננו לבצע מדידות בכל שבוע למשך עד 6 שבועות.
2. התחל ותחזק את ההרדמה כמתואר לעיל. הכינו שדה לפני חרוט האף וקבעו מד זווית עם סרט במרכז (איור 4A).
3. העבירו את העכבר לשדה והניחו בעדינות את אפו על החרוט. מקם את ברך ימין למרכז מד זווית (איור 4B).
4. שמרו על הברך מקובעת באמצעות יד שמאל והשתמשו ביד ימין כדי לכופף את כף הרגל עם האצבעות המורה והאצבעות הפולקס (איור 4C,D).
5. שימו לב למידת ההארכה על ידי קריאת הערך המצוין על ידי אצבעות הרגליים. בצע את אותו הליך על הרגל הנגדית שאינה מוקרנת.

6. מדידת אינדקס תפקודי הליכה

1. הדפס בתלת מימד את מסלול ההליכה של המכרסמים כדי ליצור שביל הליכה של 40 ס"מ התלוי בגובה 15 ס"מ עם רצפה שקופה (איור 5). הנח מקליט וידאו מתחת למסלול והתחל לצלם. המצלמה מותאמת להקלטת סרטון ברזולוציה הגבוהה ביותר האפשרית ובקצב פריימים מינימלי של 60 פריימים לשנייה.
2. פתח קצה אחד של הרצועה והעבר את העכבר פנימה. תנו לבעל החיים ללכת בחופשיות על המסלול. צלמו את החיה הולכת בצורה חלקה ככל האפשר לפחות שלוש פעמים.
3. בדוק את איכות הסרטון לפני הקלטת העכבר הבא.
4. העבר את הסרטונים למחשב עם נגן וידאו, יישום צילום מסך, תוכנית לעיבוד תמונה ותוכנת גיליון אלקטרוני. צפו בהקלטות כדי ללכוד שלוש חתימות-שטח שונות וברורות באמצעות פונקציית צילום המסך (איור 6).
5. פתח את תוכנית עיבוד התמונה למדידות התפשטות הבוהן. בחר File בחלונית העליונה ולחץ על Open כדי למצוא ולהציג את התמונה לניתוח.
6. בחר כלי קו ישר מהשורה השנייה של הפאנל העליון (איור 7_1). בעזרת כלי זה, סמן את רוחב הקיר ולחץ על נתח > הגדר קנה מידה, ולאחר מכן הזן את הערך המדויק עבור מרחק ידוע כדי לכייל את קנה המידה (איור 7_2-5).
7. השתמש בכלי הקו הישר כדי לסמן את טביעת הרגל עבור מדידות שונות (איור 6C, D; 1: אורך רגל, 2: התפשטות הבוהן החיצונית, 3: התפשטות הבוהן הפנימית), בחר ניתוח > מדידה ורשום את ערך האורך (איור 8).
8. בצע את הניתוחים הן עבור הגפיים המוקרנות והן עבור הגפיים הלא מוקרנות. השתמש במשוואה הבאה שפורסמה בעבר כדי להעריך את הפונקציונליות²⁴
   
   כאשר SFI = מדד פונקציונליות סיאטית, E = כפה ניסיונית או פצועה, N = כפה רגילה או לא פגועה, TS = התפשטות הבוהן ו-PL = אורך הדפסה.

7. המתת חסד

1. העבר את הנבדק לקופסה המחוברת לקו CO₂ . התחל את עירוי ה-CO₂ כדי להגיע לריכוז של 30%-70% בתוך החדר. עבור תא של 5 ליטר, עירוי הגז חייב להיות בין 1.5-3.5 ליטר לדקה.
2. המתן עד שהחיה תפסיק את הנשימה למשך 5-10 דקות. המתת חסד על ידי פריקת צוואר הרחם על ידי החזקת הראש במקומו מבסיס הגולגולת ומשיכה חזקה של הזנב²⁵.

8. היסטולוגיה וניתוחים במורד הזרם ¹⁷

1. משוך את הגפה האחורית המוקרנת כדי להכין אותה לכריתה. בחר אזור של 2 ס"מ על 1 ס"מ למישור האחורי של העור הקיצוני.
2. השתמש במספריים חדים כדי לאסוף בזהירות את דגימת העור. חותכים את הרקמה לשניים מהציר הארוך לקבלת שתי חתיכות נפרדות.
3. יש לתקן חתיכת טישו אחת במי מלח עם 10% פורמלין. עבד את הרקמה הקבועה להכנת חתכים היסטולוגיים על שקופיות.
4. העבירו את החתיכה השנייה לקופסה מלאה בקרח יבש כדי לשמר את החלבונים וה-RNA. לאחר מכן, העבירו במהירות את דגימות הרקמה למקפיא של -80 מעלות צלזיוס ושמרו אותן קפואות עד לעיבוד נוסף.
5. צבעו את השקופיות עבור כתם המטוקסילין ואאוזין (H&E) וכתם הטריכרום של מאסון. דמיין את השקופיות המוכתמות במיקרוסקופ וצלם תמונות בהגדלה פי 10. מדוד את עובי האפיתל באמצעות תוכנת עיבוד תמונה כפי שהוסבר לעיל עבור הבדיקה הפונקציונלית של ההליכה.

9. סטטיסטיקה

1. הצג את הנתונים כממוצע ± סטיית תקן. הערך את התוצאות באמצעות ניתוח שונות (ANOVA) ואחריו מבחן ההשוואה הרב-תכליתי של בונפרוני או מבחן ה-t של הסטודנט.

תוצאות

הקמה ואופטימיזציה של פרוטוקול ההקרנה הנוכחי הביאו לאינדוקציה עקבית וניתנת לשחזור של פיברוזיס בעכברים. הגפיים הימניות של העכברים מוקמו ואובטחו בתוך שדה הקרינה ביום ההקרנה, וניתנה 40 Gy של קרינה.

התפתחות הפגיעה התפקודית בעור נוטרה על ידי צילום תמונות מדי שב?...

Discussion

פגיעה בעור היא תוצאה סבירה של חשיפה מקרית או הקשורה לטיפול רפואי לקרינה. לכורים גרעיניים יש סיכון לפריצה בשוגג עקב טעות אנוש או אסונות טבע כמו צ'רנוביל ופוקושימה^26,27. מינון טיפולי לטיפול בסרטן הוא החשיפה הנפוצה ביותר, המשתמשת במשטרי מינון ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Formalin	Fischer Scientific	23-427098
Bolus	Orfit	8333.SO1/R
Clipper	Kent Scientific Corp.	CL8787-KIT
CO2	Various
CO2 Chamber	E-Z Systems Inc.	E-22000
Depilatory Cream	Church & Dwight Co., Inc.		Nair
Digital Camera	Wolfang	GA100
Eppendrof Tubes	Eppendorf	22364111
Eye Lubricant	Dechra		Puralube Ophthalmic Ointment
Gauze	Covidien	682252
Image Processing Program	NIH		Image J
Isoflurane	Dechra		USP Inhalation Anesthetic
Linear Accelaerator	Varian Medical Systems, Inc.		23EX
PBS	Cytiva	SH30256.LS
Pentobarbital	Akorn Pharmaceuticals		Nembutal
Protractor	Westcott	550-1120
Small Animal Anesthesia System	E-Z Systems Inc.	EZ-SA800	Single animal system
Spreadsheet Software	Microsoft		Excel
Surgical Scissors	Medline	MDS0834111
Surgical Tape	3M	1538-1
Tape	3M	H-1113