Etablierung eines robusten und reproduzierbaren Modells der strahleninduzierten Haut- und Muskelfibrose

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll zur Induktion von strahleninduzierter Hautfibrose in der Hintergliedmaße von Mäusen vor und führen Messungen chronischer Beeinträchtigungen nach der Bestrahlung über Exkursions- und Gangindexanalysen der Gliedmaßen durch, um das funktionelle Ergebnis zu bewerten. Das Modell klärt strahlenbedingte Mechanismen der Hautfibrose auf und ist nützlich für subklinische therapeutische Studien.

Zusammenfassung

Strahleninduzierte Hautfibrose (RISF) kann aus einer Vielzahl von Szenarien resultieren, darunter Krebstherapie, versehentliche Exposition oder Terrorakte. Radioaktive Strahlen können die Haut durchdringen und die Strukturen auf ihrem Weg beeinflussen, einschließlich Haut, Muskeln und innere Organe. Die Haut ist die erste Struktur, die Strahlung ausgesetzt ist, und ist anfällig für die Entwicklung einer chronischen Fibrose, die schwer zu behandeln ist. Derzeit zeigen begrenzte Behandlungsoptionen eine moderate Wirksamkeit bei der Milderung strahlenbedingter Hautfibrose. Ein Schlüsselfaktor, der die Entwicklung wirksamer Gegenmaßnahmen behindert, ist das Fehlen eines geeigneten und robusten Modells, das eine Übertragung der experimentellen Ergebnisse auf den Menschen ermöglichen könnte. In dieser Arbeit wurde ein robustes und reproduzierbares Maus-Hautfibrosemodell für die Hintergliedmaßen zur prophylaktischen und therapeutischen Evaluierung möglicher Wirkstoffe für die funktionelle und molekulare Wiederherstellung etabliert.

Die rechte Hintergliedmaße wurde mit einer Einzeldosis von 40 (Gray) Gy bestrahlt, um eine Hautfibrose zu induzieren. Die Probanden entwickelten im Frühstadium Ödeme und Dermatitis, die von einer sichtbaren Hautverengung begleitet wurden. Bestrahlte Gliedmaßen zeigten in den folgenden Wochen einen signifikant reduzierten Bewegungsumfang der Gliedmaßen. Im Spätstadium ließen die akuten Nebenwirkungen nach, die chronische Fibrose blieb jedoch bestehen. Als zusätzlicher Funktionstest wurde ein Gangindex durchgeführt, der die Entwicklung einer Funktionsbeeinträchtigung zeigte. Diese nicht-invasiven Methoden zeigten zuverlässige Messungen zur Verfolgung des Fibroseverlaufs, die durch histologische Analysen unterstützt werden. Die in diesem Modell verwendeten Strahlendosis-, Anwendungs- und Nachbestrahlungsanalysen bieten eine leistungsfähige und reproduzierbare Methode, um strahleninduzierte Hautfibrose zu untersuchen und die Wirksamkeit von Therapeutika zu testen.

Einleitung

Die Haut ist das größte Organ des Körpers, das den Körper bedeckt und vor Gefahren schützt. Es besteht aus drei verschiedenen Schichten: Epidermis, Dermis und Hypodermis. Jede Schicht hat ihre einzigartigen Funktionen: Die Epidermis verhindert Austrocknung und mikrobielle Invasion; Die Dermis verfügt über ein reichhaltiges Zellnetzwerk und eine extrazelluläre Matrix, die für Zugfestigkeit und Elastizität sorgt¹; Die Hautschicht enthält die sensorischen Rezeptoren, Haarfollikel, Drüsen und Gefäße für Lymph- und Kapillarnetzwerke. Die Hypodermis oder das Unterhautgewebe mit ihrem Reichtum an Fettgewebe konturiert den Körper und verteilt die mechanischen Spannungen ^2,3,4.

Strahlung, die durch Unfälle, Krieg, Terrorismus oder therapeutische Anwendungen erzeugt wird, dringt linear progressiv durch den Körper und führt dazu, dass die Haut das erste Organ ist, das mit ihr in Kontakt kommt. Die Bedrohung durch solche Zwischenfälle hat sich aufgrund des zunehmenden Einsatzes radioaktiver Materialien in Industrien, medizinischen Einrichtungen und militärischen Einrichtungen verschärft⁵. Klinisch ist die Strahlenschädigung der Haut durch das kutane Strahlensyndrom (CRS) gekennzeichnet, eines von vier Subsyndromen des akuten Strahlensyndroms (ARS). Die Reaktion der Haut auf ionisierende Strahlung hat wichtige Auswirkungen auf die Behandlung und den Schutz vor weiteren Schäden⁶. Begleitende Verletzungen wie Verbrennungen und Traumata erschweren das klinische Ergebnis zusätzlich, wenn sie mit Strahlenverletzungen kombiniert werden⁷. Das Ausmaß der Strahlenexposition der Haut korreliert mit einer Point-of-no-Return-Schwelle, ab der die Beeinträchtigung anderer Organe zu einem Versagen einzelner oder mehrerer Organe und schließlich zum Tod des Patienten führt ^8,9. Die kutane Strahlenschädigung besteht aus einer akuten und einer chronischen Phase. Eine akute Strahlenschädigung manifestiert sich klinisch als Erythem, Hautödem, Dermatitis, Blasenbildung, epidermale Denudation, trockene oder feuchte Abschuppung, Ulzerationen und Veränderungen der Haare und Nägel. Die chronische Phase manifestiert sich als dermale Atrophie, Fibrose, chronische Ulzerationen und Teleangiektasien^10,11. Im Allgemeinen manifestieren sich akute Wirkungen überwiegend in der Epidermis, während chronische Wirkungen in der Dermis am stärksten ausgeprägt sind. Die akute Reaktion auf die Strahlenexposition führt innerhalb von 12 Stunden nach der Exposition zu einer deutlichen Abnahme der mitotischen Aktivität, gefolgt von Hyperämie, Zellvergrößerung, Vakuolisierung, nukleärer Pyknose und Fragmentierung ^4,12.

Strahlendosen von mehr als 40 Gy führen zu einer feuchten Abschuppung und einem Verlust der Epidermis, was zu einer erhöhten Anfälligkeit für Infektionen führt¹³. Darüber hinaus induziert die Strahlenbelastung der Haut die Produktion von Zytokinen, die eine entzündliche Immunreaktion in der Hautschicht auslösen. Zu den prominenten Entzündungsmediatoren gehören Interleukine (IL-1, IL-3, IL-5, IL-6 und IL-8) und Tumornekrosefaktor-α (TNFα)¹⁴. Ein Versagen bei der Auflösung der Entzündung kann schließlich zur Entwicklung einer Fibrose an der Stelle der Strahlenverletzung führen¹⁵. Zusätzliche körperliche Wunden oder thermische Verletzungen verschlimmern diese fibrotische Reaktion weiter und erstrecken sich durch die Muskelschicht¹⁶. Der transformierende Wachstumsfaktor-β (TGFβ) ist das Schlüsselzytokin bei der Entwicklung von Fibrose¹⁷. Derzeit zeigen nur sehr wenige Behandlungsoptionen vielversprechende Ergebnisse, und die Mehrheit könnte Probleme mit der Compliance der Patienten haben. Weitere Forschungen, die die zellulären und molekularen Reaktionen der Haut auf unterschiedliche Strahlendosen untersuchen, werden das Verständnis der strahleninduzierten Hautpathophysiologie verbessern und die Entwicklung neuer Therapien fördern.

Um die klinische Translation von Forschungsergebnissen in präklinischen Modellen zur Linderung strahleninduzierter Verletzungen der Haut und der Weichteile zu erleichtern, ist die Entwicklung hochrelevanter experimenteller Modelle für therapeutische Interventionen nach Bestrahlung von entscheidender Bedeutung. Sowohl in vitro als auch in vivo Modelle für strahleninduzierte Schädigungen wurden beschrieben, einschließlich Zellkulturmodellen von bestrahlten Endothelzellen^{18, 19}, Fibroblasten²⁰ oder Keratinozyten¹⁹ und in vivo Tiermodellen von Nagetieren, Schweinen und nichtmenschlichen Primaten. Nagetiermodelle werden in der Strahlenforschung aufgrund ihrer Ähnlichkeiten als Reaktion auf Strahlenschäden mit dem Menschen und ihrer Flexibilität bei der genetischen Manipulation häufig verwendet²¹. Die Anforderungen an die Strahlendosis sind bei Nagetieren höher als bei Menschen, wenn ähnliche Ergebnisse angestrebt werden: Abschuppung, Fibrose und Nekrose^16,22. Die Beschreibung von Bewertungskriterien zur Messung der Reaktion auf Strahlung hat die Akzeptanz von Nagetiermodellen für strahlende Hautverletzungen weiter verbessert^21,23.

Die aktuelle Forschung im präklinischen Umfeld konzentriert sich auf das Verständnis der Mechanismen strahleninduzierter Hautschäden und die Entwicklung therapeutischer Optionen. Daher ist die Etablierung eines robusten und reproduzierbaren präklinischen Modells zur Erzeugung des Strahlensulls mit hoher klinischer Übertragbarkeit unerlässlich. Diese Arbeit beschreibt ein murines Modell der Hautfibrose mit optimierter Strahlendosis und Verabreichungstechnik. Unser Modell, das funktionelle, histologische und molekulare Messungen kombiniert, kann verwendet werden, um den Mechanismus der Fibroseentwicklung effektiv zu untersuchen und neue therapeutische Optionen zu untersuchen.

Protokoll

Die ethische Verwendung von Tieren wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt, das in Übereinstimmung mit dem Tierschutzgesetz handelt. Die Tiere wurden in einer von der Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC) zugelassenen Einrichtung untergebracht und gemäß dem National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals behandelt.

1. Anästhesie

1. Setzen Sie Mäuse in die Box eines Anästhesiesystems für Kleintiere (Abbildung 1). Geben Sie 4% Isofluran in die Box und warten Sie 5-10 Minuten, dann senken Sie das Isofluran auf 2-3%.
2. Bestätigen Sie die Narkosetiefe durch Zehenkneifen. Tragen Sie Augenschmiermittel auf, um ein Austrocknen zu verhindern. Bewegen Sie das Subjekt mit 2 % Isofluranfluss zum Nasenkonus.
3. Verwenden Sie die obige Technik, um jede Maus für die Rasur und den Measure der Gliedmaßen zu betäuben. Verwenden Sie eine intraperitoneale Pentobarbital-Injektionsdosis von 1,25 mg/kg, um Mäuse für die Bestrahlung zu betäuben.

2. Vorbereitung der Hautpartie

1. Planen Sie, die Mäuse 2-3 Tage vor der Bestrahlung zu rasieren. Schneiden Sie das Haar mit einer Haarschneidemaschine (Abbildung 2A).
2. Tragen Sie die Enthaarungscreme auf und warten Sie 1-2 Minuten (Abbildung 2B). Wischen Sie die Creme mit trockener Gaze ab und spülen Sie die Haut mit einer mit Phosphatpuffer Kochsalzlösung (PBS) getränkten Gaze ab (Abbildung 2C).

3. Ablauf der Bestrahlung

1. Betäuben Sie jede Maus mit einer intraperitonealen Injektion, die 5 Minuten vor der Bestrahlung verabreicht wird. Positionieren Sie die Extremität im Strahlenfeld (25 cm x 25 cm) und sichern Sie sie mit chirurgischem Klebeband (Abbildung 3A-C).
2. Begrenzen Sie den Körper mit chirurgischem Klebeband (Abbildung 3D). Platzieren Sie einen 1 cm dicken Bolus, um ein tiefes Eindringen von Strahlung zu verhindern/zu minimieren (Abbildung 3E).
3. Berechnen Sie den Applikator und die Ausschnittsfaktoren, um 40 Gy auf die Maushaut zu bringen. Verwenden Sie für das Experiment hier einen Linearbeschleuniger, um einen 6-MeV-Elektronenstrahl für 3740 Monitoreinheiten zu erzeugen, um Strahlungsverbrennungen zu induzieren. In dieser Einstellung wird ein 25 cm x 25 cm großes Strahlungsfeld bei einer Dosis von 1.000 MU/min mit einem Abstand von 100 cm von der Quelle zur Oberfläche (SSD) angezeigt, d. h. der Abstand von der Bestrahlungsquelle zur Spitze des Bolus, um die 40 Gy abzugeben. Die Bestrahlungszeit variiert je nach verwendetem Linearbeschleuniger, Strahlenergie und Feldgröße. Ein Strahlen- oder Medizinphysiker sollte konsultiert werden, um die Monitoreinheiten zu berechnen, die erforderlich sind, um 40 Gy auf dem Linearbeschleuniger zu liefern.

4. Visuelle Überwachung der Fibroseentwicklung

1. Verwenden Sie eine tragbare Digitalkamera, um das Fortschreiten der Fibrose zu dokumentieren. Verwenden Sie die Makroeinstellung, um detaillierte Fotos aufzunehmen.
2. Betäuben Sie Mäuse durch Inhalation von Isofluran.
3. Nehmen Sie Bilder auf, indem Sie das Objektiv näher an der Haut positionieren und auf Aufnahme drücken. Versuchen Sie, die Fotos so einheitlich wie möglich zu halten. Halten Sie das Subjekt unter direkter Aufsicht, bis genügend Bewusstsein wiedererlangt ist, um das Brustbein aufrecht zu erhalten.

5. Messung der Beinextraktion als funktionelles Ergebnis der Fibrose

1. Planen Sie ab der dritten Woche nach der Bestrahlung bis zu 6 Wochen lang wöchentliche Messungen ein.
2. Initiieren und halten Sie die Anästhesie wie oben beschrieben aufrecht. Bereiten Sie ein Feld vor dem Nasenkegel vor und befestigen Sie einen Winkelmesser mit Klebeband in der Mitte (Abbildung 4A).
3. Bringen Sie die Maus auf das Spielfeld und legen Sie ihre Nase vorsichtig auf den Kegel. Positionieren Sie das rechte Knie in der Mitte des Winkelmessers (Abbildung 4B).
4. Halten Sie das Knie mit der linken Hand fixiert und beugen Sie den Fuß mit der rechten Hand mit dem Zeige- und dem Pollex-Finger (Abbildung 4C,D).
5. Notieren Sie den Ausdehnungsgrad, indem Sie den durch die Zehen angezeigten Wert ablesen. Führen Sie das gleiche Verfahren am kontralateralen, nicht bestrahlten Bein durch.

6. Messung des Funktionsindex des Gangs

1. Drucken Sie den Nagetierweg in 3D, um einen 40 cm langen Gehweg zu erstellen, der in einer Höhe von 15 cm mit einem transparenten Boden aufgehängt ist (Abbildung 5). Platzieren Sie einen Videorecorder unter der Spur und beginnen Sie mit dem Filmen. Die Kamera ist so eingestellt, dass sie ein Video mit der höchstmöglichen Auflösung und einer minimalen Bildrate von 60 Bildern pro Sekunde aufnimmt.
2. Öffnen Sie ein Ende der Spur und übertragen Sie die Maus hinein. Lassen Sie das Tier frei auf der Fährte laufen. Fangen Sie das Tier mindestens dreimal so reibungslos wie möglich ein.
3. Überprüfen Sie die Qualität des Videos, bevor Sie die nächste Maus aufnehmen.
4. Übertragen Sie die Videos mit einem Videoplayer, einer Screenshot-Anwendung, einem Bildbearbeitungsprogramm und einer Tabellenkalkulationssoftware auf einen Computer. Sehen Sie sich die Aufnahmen an, um mit der Screenshot-Funktion drei verschiedene, eindeutige Fußabdrücke zu erfassen (Abbildung 6).
5. Öffnen Sie das Bildbearbeitungsprogramm für die Spurspreizmessung. Wählen Sie im oberen Bereich Datei aus und klicken Sie auf Öffnen , um das zu analysierende Bild zu suchen und anzuzeigen.
6. Wählen Sie in der zweiten Zeile des oberen Bereichs die Option Geradliniges Werkzeug aus (Abbildung 7_1). Markieren Sie mit diesem Werkzeug die Wandbreite, klicken Sie auf Analysieren > Maßstab festlegen, und geben Sie dann den genauen Wert für einen bekannten Abstand ein, um den Maßstab zu kalibrieren (Abbildung 7_2-5).
7. Verwenden Sie das Werkzeug "Gerade Linie ", um den Fußabdruck für verschiedene Messungen zu markieren (Abbildung 6C, D; 1: Fußlänge, 2: äußere Zehenspreizung, 3: innere Zehenspreizung), wählen Sie "Analysieren" > "Messen" aus, und notieren Sie den Längenwert (Abbildung 8).
8. Führen Sie die Analysen sowohl für die bestrahlten als auch für die nicht bestrahlten Gliedmaßen durch. Verwenden Sie die folgende zuvor veröffentlichte Gleichung, um die Funktionalität²⁴ zu bewerten
   
   wobei SFI = Ischias-Funktionalitätsindex, E = experimentelle oder verletzte Pfote, N = normale oder unverletzte Pfote, TS = Zehenspreizung und PL = Drucklänge.

7. Euthanasie

1. Übertragen Sie den Prüfling in eine CO₂ -Anschlussbox. Starten Sie die CO_{2 -} Infusion, um eine Konzentration von 30 % bis 70 % in der Kammer zu erreichen. Bei einer 5-Liter-Kammer muss die Gasinfusion zwischen 1,5 und 3,5 l/min liegen.
2. Warten Sie, bis das Tier für 5-10 Minuten aufgehört hat zu atmen. Euthanasieren Sie durch Zervixluxation, indem Sie den Kopf von der Schädelbasis aus festhalten und den Schwanz fest ziehen²⁵.

8. Histologie und nachgelagerte Analysen ¹⁷

1. Ziehen Sie an der bestrahlten Hintergliedmaße, um sie für die Exzision vorzubereiten. Wählen Sie einen Bereich von 2 cm x 1 cm zur hinteren Ebene der Extremitalhaut.
2. Verwenden Sie eine scharfe Schere, um die Hautprobe vorsichtig zu entnehmen. Schneiden Sie das Gewebe von der Längsachse in zwei Hälften, um zwei separate Stücke zu erhalten.
3. Fixieren Sie ein Taschentuchstück in 10% formalingepufferter Kochsalzlösung. Verarbeiten Sie das fixierte Gewebe für die Erstellung histologischer Schnitte auf Objektträgern.
4. Füllen Sie das zweite Stück in eine mit Trockeneis gefüllte Schachtel, um die Proteine und die RNA zu konservieren. Übergeben Sie die Gewebeproben dann schnell in einen -80 °C heißen Gefrierschrank und bewahren Sie sie bis zur Weiterverarbeitung eingefroren auf.
5. Färben Sie die Objektträger für Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (H&E) und Massons Trichrom-Färbung. Visualisieren Sie die gefärbten Objektträger unter einem Mikroskop und nehmen Sie Bilder mit 10-facher Vergrößerung auf. Messen Sie die Epitheldicke mit einer Bildverarbeitungssoftware, wie oben für den Gangfunktionsassay beschrieben.

9. Statistik

1. Stellen Sie die Daten als Mittelwert ± Standardabweichung dar. Werten Sie die Ergebnisse mit Hilfe der Varianzanalyse (ANOVA) aus, gefolgt von Bonferronis Multivergleichstest oder Student t-Test.

Ergebnisse

Die Etablierung und Optimierung des aktuellen Bestrahlungsprotokolls führte zu einer konsistenten und reproduzierbaren Induktion von Fibrose bei Mäusen. Die rechten Gliedmaßen der Mäuse wurden am Tag der Bestrahlung im Strahlenfeld positioniert und gesichert, und es wurden 40 Gy Bestrahlung verabreicht.

Die Entwicklung der Funktionsbeeinträchtigung der Haut wurde überwacht, indem wöchentlich Bilder nach der Bestrahlung aufgenommen wurden. Fotos zeigten,...

Diskussion

Hautverletzungen sind eine wahrscheinliche Folge einer versehentlichen oder medizinisch behandlungsbedingten Strahlenexposition. Kernreaktoren bergen das Risiko eines versehentlichen Durchbruchs aufgrund von menschlichem Versagen oder Naturkatastrophen wie Tschernobyl und Fukushima^26,27. Die therapeutische Dosierung zur Krebsbehandlung ist die häufigste Exposition, bei der fraktionierte Schemata mit wiederholter Verabreichung ve...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Formalin	Fischer Scientific	23-427098
Bolus	Orfit	8333.SO1/R
Clipper	Kent Scientific Corp.	CL8787-KIT
CO2	Various
CO2 Chamber	E-Z Systems Inc.	E-22000
Depilatory Cream	Church & Dwight Co., Inc.		Nair
Digital Camera	Wolfang	GA100
Eppendrof Tubes	Eppendorf	22364111
Eye Lubricant	Dechra		Puralube Ophthalmic Ointment
Gauze	Covidien	682252
Image Processing Program	NIH		Image J
Isoflurane	Dechra		USP Inhalation Anesthetic
Linear Accelaerator	Varian Medical Systems, Inc.		23EX
PBS	Cytiva	SH30256.LS
Pentobarbital	Akorn Pharmaceuticals		Nembutal
Protractor	Westcott	550-1120
Small Animal Anesthesia System	E-Z Systems Inc.	EZ-SA800	Single animal system
Spreadsheet Software	Microsoft		Excel
Surgical Scissors	Medline	MDS0834111
Surgical Tape	3M	1538-1
Tape	3M	H-1113