מדידת תרמוגנזה של שרירי השלד בעכברים ובחולדות

Summary

עכברים וחולדות מושתלים בניתוח במשדרי טמפרטורה מרוחקים ולאחר מכן מורגלים לסביבת הבדיקה ולהליך. שינויים בטמפרטורת השרירים נמדדים בתגובה לגירויים פרמקולוגיים או קונטקסטואליים בכלוב הביתי או במהלך פעילות גופנית שנקבעה (כלומר, הליכה על הליכון במהירות קבועה).

Abstract

תרמוגנזה של שרירי השלד מספקת אפיק פוטנציאלי להבנה טובה יותר של הומאוסטזיס מטבולי והמנגנונים העומדים בבסיס הוצאת האנרגיה. באופן מפתיע, מעטות הראיות הקיימות כדי לקשר את המנגנונים העצביים, המיוצלולריים והמולקולריים של תרמוגנזה ישירות לשינויים הניתנים למדידה בטמפרטורת השרירים. מאמר זה מתאר שיטה שבה משדרי טמפרטורה משמשים לאחזור מדידות ישירות של טמפרטורת שרירי השלד של עכברים וחולדות.

משדרים מרוחקים מושתלים בניתוח בתוך שריר של עכברים וחולדות, ולבעלי החיים ניתן זמן להתאושש. לאחר מכן יש להרגיל שוב ושוב עכברים וחולדות לסביבת הבדיקה ולנוהל. שינויים בטמפרטורת השרירים נמדדים בתגובה לגירויים פרמקולוגיים או קונטקסטואליים בכלוב הביתי. ניתן למדוד את טמפרטורת השרירים גם במהלך פעילות גופנית שנקבעה (כלומר, הליכה על הליכון במהירות קבועה) כדי לקחת בחשבון את השינויים בפעילות כתורמים לשינויים בטמפרטורת השרירים המושרים על ידי גירויים אלה.

שיטה זו שימשה בהצלחה להבהרת מנגנונים העומדים בבסיס השליטה התרמוגנית בשרירים ברמת המוח, מערכת העצבים הסימפתטית ושרירי השלד. מסופקות הדגמות של הצלחה זו באמצעות ריח טורף (PO; ריח חמוס) כגירוי הקשרי וזריקות של אוקסיטוצין (Oxt) כגירוי פרמקולוגי, שבו ריח טורף משרה תרמוגנזה של שרירים, ו- Oxt מדכא את טמפרטורת השריר. לפיכך, מערכי נתונים אלה מציגים את היעילות של שיטה זו באיתור שינויים מהירים בטמפרטורת השרירים.

Introduction

במסגרת המחקר המטבולי, בחינת התרמוגנזה של שרירי השלד היא אפיק חדש ומבטיח לחקר הומאוסטזיס של משקל הגוף. הספרות שפורסמה תומכת ברעיון שהתגובות התרמוגניות של אחת ממערכות האיברים הגדולות בגוף – שרירי השלד – מספקות דרך להגדלת ההוצאה האנרגטית והשפעות מטבוליות אחרות, ובכך למעשה מאזנות מחדש מערכות בתוך מחלות כמו השמנת יתר ^1,2,3. אם השריר יכול להיחשב איבר תרמוגני, המחקרים חייבים להשתמש במתודולוגיה מעשית כדי לחקור שינויים תרמוגניים בתוך איבר זה. הרצון להבין את ההשפעה האנדותרמית של שרירי השלד והתועלת של מתודולוגיה זו לחקר תרמוגנזה של שרירים שאינם רועדים אינם ספציפיים למחקרים מטבוליים. דיסציפלינות הכוללות אבולוציה⁴, פיזיולוגיה השוואתית⁵ ואקופיזיולוגיה ^6,7 הראו עניין רב בהבנת הדרכים שבהן תרמוגנזה של שרירים עשויה לתרום לאנדותרמיה וכיצד מנגנון זה מסתגל לסביבה. הפרוטוקול המוצג מספק את השיטות הקריטיות הדרושות כדי להתמודד עם שאלות אלה.

השיטה המסופקת יכולה לשמש בהערכת אפנון גירויים הקשריים ופרמקולוגיים של טמפרטורת השרירים, כולל הטכניקה הייחודית של מתן ריח טורף (PO) כדי לשנות את ההקשר כדי לשכפל איום טורף. דיווחים קודמים הדגימו את היכולת של PO לגרום במהירות לעלייה ניכרת בתרמוגנזה של השרירים⁸. יתר על כן, גירויים פרמקולוגיים יכולים גם לשנות את טמפרטורת השרירים. זה הוכח בהקשר של תרמוגנזה שרירית המושרה על ידי PO, שבה חסימה פרמקולוגית של קולטני β-אדרנרגיים היקפיים, באמצעות nadolol, עיכבה את היכולת של PO לגרום לתרמוגנזה של שרירים מבלי להשפיע באופן משמעותי על תרמוגנזה מתכווצת במהלך הליכון^{הליכה 8}. מתן מרכזי של אגוניסטים לקולטני מלנוקורטין בחולדות שימש גם להבחנה במנגנונים מוחיים המשנים תרמוגנזה ^9,10.

להלן חקירה ראשונית של יכולתו של הנוירוהורמון אוקסיטוצין (Oxt) לשנות את התרמוגנזה של השרירים בעכברים. בדומה לאיום על טורפים, מפגשים חברתיים עם אוכלוסייה חד-מינית מעלים את טמפרטורת הגוף, תופעה המכונה היפרתרמיה חברתית¹¹. בהתחשב ברלוונטיות של Oxt להתנהגות חברתית¹², הועלתה השערה כי Oxt הוא מתווך של היפרתרמיה חברתית בעכברים. ואכן, אנטגוניסט של קולטן אוקסיטוצין מפחית היפרתרמיה חברתית בעכברים¹¹, וגורי עכברים ללא Oxt מראים ליקויים בהיבטים התנהגותיים ופיזיולוגיים של ויסות תרמי, כולל תרמוגנזה¹³. בהתחשב בכך ש- Harshaw et al. (2021) לא מצאו ראיות התומכות בתרמוגנזה של רקמת שומן חום תלוית קולטן אדרנרגי β3 (BAT) עם היפרתרמיה חברתית¹¹, הועלתה ההנחה כי היפרתרמיה חברתית עשויה להיות מונעת על ידי אינדוקציה של Oxt של תרמוגנזה של שרירים.

כדי למדוד תרמוגנזה של שרירי השלד, הפרוטוקול הבא משתמש בהשתלת משדרי IPTT-300 מתוכנתים מראש הסמוכים לשריר העניין בתוך עכבר או חולדה 8,10,14,15. משדרים אלה הם שבבים עטופים בזכוכית הנקראים באמצעות קוראי משדרים מתאימים. מעט מאוד מחקרים השתמשו בטכנולוגיה זו בתפקיד זה, אם כי מחקרים הצביעו על צורך בספציפיות שמספקת שיטה זו^16,17. מחקרים קודמים הראו את האמינות של שיטה זו ומגוון דרכים שבהן ניתן להשתמש במשדרי טמפרטורה בהשוואה לשיטות בדיקת טמפרטורה^{אחרות 18} או בשילוב עם שיטות כירורגיות (למשל, cannulation¹⁹). עם זאת, מחקרים מסוג זה מסתמכים על מיקומים אסטרטגיים שונים כדי למדוד את טמפרטורת הגוף הכוללת 20,21,22 או רקמות מוגדרות כגון BAT^23,24,25.

במקום למדוד טמפרטורה ממקומות אלה או תוך שימוש במדחומים אוזניים או רקטליים²⁶, השיטה המתוארת כאן מספקת ספציפיות לשריר העניין. היכולת למקד אתר על ידי השתלה ישירה של משדרים הסמוכים לשרירים המעניינים יעילה יותר לבדיקת תרמוגנזה של שרירים באופן ספציפי. הוא מספק שדרה חדשה בנוסף לאלה המסופקים על ידי תרמומטריה אינפרא אדום פני השטח ^27,28 או מדידות טמפרטורה עורית באמצעות thermocouple ²⁹. יתר על כן, הנתונים המסופקים בשיטה זו מציעים מגוון אפיקי מחקר, תוך הימנעות מהצורך בציוד ותוכנות היי-טק גדולות ויקרות כגון תרמוגרפיה אינפרא אדומה^30,31,32.

שיטה זו שימשה בהצלחה למדידת הטמפרטורה בקוואדריפס ובגסטרוקנמיוס, באופן חד צדדי או דו-צדדי. שיטה זו הייתה יעילה גם בשילוב עם ניתוחים סטריאוטקסיים^14,15. בטווח של ~7-10 ס"מ מאיבר המשדר, קוראי משדרים ניידים (DAS-8027/DAS-7007R) משמשים לסריקה, מדידה והצגה של הטמפרטורה. מרחק זה היה קריטי ובעל ערך למחקרים קודמים ^8,9,10 מכיוון שהוא ממזער גורמי עקה פוטנציאליים ומשתנים משני טמפרטורה כגון טיפול בבעלי חיים במהלך הליכי הניסוי. באמצעות טיימרים, ניתן להקליט ולאסוף את המדידות לאורך פרק זמן ללא אינטראקציה ישירה עם בעלי החיים.

כדי למזער עוד יותר את ההפרעה של עכברים במהלך הבדיקה, שיטה זו מתארת את ההרכבה והשימוש של הגבהות העשויות מצנרת PVC כדי לתת לנסיין גישה לתחתית הכלובים הביתיים במהלך הבדיקה. באמצעות ההגבהות יחד עם הקורא הדיגיטלי, ניתן לבצע מדידות טמפרטורה של איבר המשדר ללא כל אינטראקציה עם בעלי חיים לאחר מיקום הגירוי. בעלות מינימלית, ניתן להשתמש בשיטה זו בשילוב עם גירויים פרמקולוגיים והקשריים, מה שהופך אותה לנגישה למדי לחוקרים. בנוסף, ניתן להשתמש בשיטה זו עם מספר ניכר של נבדקים (~ 16 עכברים או ~ 12 חולדות) בכל פעם, ולחסוך זמן בהגדלת התפוקה הכוללת עבור כל פרויקט מחקר.

בשיטה זו מוצג מנגנון מעוצב להצגת ריחות לעכברים באמצעות כדורי תה מפלדת אל-חלד, המכונים מעתה "כדורי תה". למרות שכדורי התה האלה אידיאליים להכלת כל חומר ריח, במחקרים אלה, מגבות ששימשו כמצעים בכלוב במשך 2-3 שבועות לחמוסים, טורף טבעי של עכברים וחולדות, ממוקמות בתוך כל כדור תה טיפולי. כל מגבת חתוכה לריבועים בגודל 5X5 ס"מ. ציטוט זה חוזר על עצמו גם עם מגבות בקרה זהות ללא ריח. הצגת ריחות אלה ללא מחסום (כלומר, כדור תה) הובילה לכך שעכברים גורסים את הסיבים בתוך הכלובים שלהם, מה שמגביר את הפעילות הגופנית. התנהגות זו לא הייתה בולטת כל כך בחולדות. כדורי תה מספקים מעטפת מאווררת למגבת, ומעניקים גישה מלאה לריח תוך שמירה על הגנה במשך כל הניסוי הניסיוני. כדורי תה אלה ניתנים לחיטוי בהתאם לפרוטוקולי השימוש בבעלי חיים, מוכנים ומוצגים ישירות לאחר הניתוח כדי להתחיל להרגיל את בעלי החיים למבנה יחד עם גירוי הבקרה. עכברים יכולים לחיות עם ההעשרה הנוספת, מה שמקטין את הבולטות של הצגת הגירוי החריף.

הרגלה לנוכחות כדור התה היא רק היבט אחד של הרגלה שהוא קריטי לשיטה זו. פרוטוקול ההרגלה המתואר מורכב גם מחשיפה חוזרת ונשנית להליך הבדיקה כדי לנרמל את סביבת הבדיקה (כלומר, כוח אדם, תחבורה ותנועה למקום הבדיקה, חשיפה לגירוי). הרגלה ממושכת זו ממזערת תגובות ניואנסיות של בעלי החיים וממקדת את המדידות במשתנים התלויים הרצויים (למשל, גירויים פרמקולוגיים או הקשריים). הערכה קודמת של פרוטוקול זה זיהתה ארבעה ניסויים כמספר ההרגלים המינימלי הדרוש לפני בדיקת טמפרטורה בכלובים ביתיים בחולדות⁸. אם הניסויים מופרדים על ידי תקופות ארוכות (יותר מ 2-3 שבועות), בעלי החיים חייבים להיות רגילים שוב. עבור הרגלים חוזרים ונשנים, מספיק מינימום של ניסוי אחד עד שניים. עם זאת, אם בדיקות הטמפרטורה מופרדות על ידי התקפי זמן ממושכים יותר, ייתכן שיהיה צורך לחזור על ניסויים נוספים.

במאמץ המתמשך להרגיל עכברים וחולדות להליך הבדיקה, יש לכלול תקופת התאקלמות לפני הצגת הגירוי בכל ניסוי ניסיוני. זמן התאקלמות זה הוא קריטי לאיזון מחדש של הטמפרטורה והפעילות לאחר המעבר למקום הבדיקה. מכרסמים נוטים להיות עליות טמפרטורה חדות עקב טרנסלוקציה. התאקלמות צריכה להיות מורכבת ממינימום של 1 שעות ללא אינטראקציה מהנסיין ביום הבדיקה לפני כל תוספת של סוכן פרמקולוגי או גירויים הקשריים. זה הכרחי בכל יום של בדיקה.

בבדיקות הטמפרטורה של הכלוב הביתי, לעכברים יש את הטווח החופשי של הכלוב הביתי שלהם לשוטט בתגובה לגירוי שנבדק. זה יכול לגרום לשינויים משתנים בפעילות, להשפיע על הדיוק של קריאות הטמפרטורה, ולכן, ניתוח ההשפעות התרמוגניות של המשתנה הבלתי תלוי (למשל, גירוי פרמקולוגי או הקשרי). מתוך הכרה בשינויים הפוטנציאליים בטמפרטורה עקב רמת הפעילות, נכלל להלן פרוטוקול המתאר את השימוש בטמפרטורה במהלך הליכה על הליכון. הספרות שפורסמה מתארת את השימוש המוצלח בהליך זה בחולדות, והוא משמש כיום עם עכברים 8,10,14,15. הליכה על הליכון שומרת על מהירות קבועה של פעילות עבור הנבדק. במחקר זה, הליכונים משמשים אך ורק לשליטה ברמת הפעילות, ולכן הם מוגדרים למהירות הנמוכה ביותר הזמינה על ההליכון כדי לקדם הליכה לעכברים והגדרה נמוכה דומה לחולדות.

ההליך הבא מתואר למדידת הטמפרטורה של גסטרוקנמיוס חד-צדדי בעכברים והצגת ריח טורף. העיצוב יכול לשמש בשילוב עם חומרים פרמקולוגיים והוא ניתן להעברה לחולדות ולקבוצות שרירי שלד אחרות (כלומר, quadriceps) בעכברים. עבור חולדות, משדרים יכולים להיות ממוקמים gastrocnemius דו צדדית ברקמת שומן חום. בשל מגבלות גודל ומרחק, ניתן להשתמש במשדר אחד בלבד לכל עכבר. ניתן לבצע שינויים קלים (למשל, הסרת גירויים הקשריים) כדי להעריך תגובות תרמוגניות לסוכנים פרמקולוגיים.

Protocol

ניתן ליישם שיטות אלה הן על מודלים של חולדות והן על עכברים והן בוצעו באישור מוסדי (אוניברסיטת קנט סטייט, אישור IACUC #359 ו- #340 CN 12-04). לפני יישום הפרוטוקול, יש לשכן בעלי חיים בהתאם למדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה.

1. הכנת קורא המשדרים

הערה: לפני השימוש, יש להגדיר את קורא המשדר; השלבים הבאים כוללים רק את שינויי ההגדרות הדרושים למחקר זה. חלק זה של הפרוטוקול משויך ישירות לקוראים הניידים DAS-8027-IUS; מודלים אחרים של הקוראים צריכים לעקוב אחר ההוראות המסופקות על-ידי המדריך כדי להשיג תוצאות תכנות.

1. הגדר את צפצוף השמע למצב כבוי.
   1. הפעל את ההתקן על-ידי לחיצה על לחצן SCAN והמתן עד שהתאורה תופיע בתצוגת ה-OLED. לחץ והחזק את הלחצן BACK/MENU כדי להגיע למסך התפריט .
   2. באמצעות הלחצן NEXT/ENTER , גלול בין האפשרויות עד להגדרה תפעולית. כאן, החלף את החצים למעלה או למטה כדי להפוך את כן ולפתוח את תפריט המשנה התפעולי.
   3. באמצעות הבא /ENTER לחצן, גלול אל AUDIO BEEP. כאשר הגדרת ברירת המחדל היא מופעל, החלף את החצים למעלה או למטה ושנה את ההגדרה למצב כבוי.
   4. לחץ על הלחצן NEXT/ENTER כדי לשמור שינוי הגדרה זה.
2. הגדר רטט בעת קריאה למצב מופעל.
   1. בצע את שלב 1.1 עד שלב 1.2 או השלם את השלב הבא מיד לאחר שלב 1.4.
   2. באמצעות הלחצן הבא/ENTER, גלול אל רטט עם הקריאה. מכיוון שהגדרת ברירת המחדל היא OFF, החלף את החצים למעלה ולמטה ושנה את ההגדרה ל- ON כדי להרגיש, באמצעות רטט, כאשר הקריאה הושלמה ללא קשר ליכולת להציג את המסך.

2. משדרי תוכנית

הערה: כל משדר מושתל צריך להיות מתוכנת תחילה עם זיהוי בעל חיים (מזהה בעל חיים או מזהה משדר). מינוח זה יכול לשמש כזיהוי משני עבור הנבדק (למשל, ארבע ספרות לקיצור זן עכבר, מיקום המשדר, ושלוש עד ארבע ספרות נוספות לציון מספר בעלי חיים). ניתן להשלים את התכנות ימים לפני הניתוח תוך שמירה על סטריליות המשדרים לפני הניתוח.

1. הזן את קוד הזיהוי במשדר.
   1. החל סליל מאיץ על ראש הקורא - אביזר ספציפי עבור דגם DAS 8027-IUS, המסייע בהליך התכנות.
   2. בעזרת יד עם כפפות, הניחו את המשדר (בתוך המוליך) לתוך סליל המאיץ.
   3. הפעל את ההתקן על ידי לחיצה על כפתור הסריקה והמתן עד שצג ה-OLED יידלק. לחץ והחזק את הלחצן BACK/MENU כדי להגיע למסך התפריט .
   4. באמצעות הלחצן NEXT/ENTER, גלול בין האפשרויות עד ל- WRITE TRANSPONDER ID. כאן, החלף את החצים למעלה או למטה כדי להפוך את כן.
   5. באמצעות הלחצן הבא/ENTER , עבור למצב הזן קוד מזהה.
   6. השתמש במקשי החצים למעלה ולמטה כדי לגלול בין מספרים ואותיות. הקש NEXT/ENTER לאחר כל בחירת תו כדי לעבור לתו הבא.
   7. לאחר השלמת קוד הזיהוי, לחץ על SCAN כדי לכתוב את המשדר.
   8. הסר את המשדר מסליל המאיץ וחזור על הפעולה לפי הצורך. בדקו שהמשדר קורא את שינויי הטמפרטורה על ידי חימום המשדרים הסגורים בין ידיים עם כפפות ומדידה באמצעות סורק הטמפרטורה.
      הערה: ניתן להגדיר את ההגדרות ' כתיבה אוטומטית מרובה ' ו'ספירה רציפה ' למצב 'פועל ' כדי לאפשר תיכנות של משדרים מרובים או רציפים במהלך הפעלה. כל משדר צריך להיבדק במהלך התכנות.

3. הכינו "כדורי כלוב ביתיים"

1. הכניסו לכדור תה מגבת בגודל 5X5 ס"מ נטולת ריח/קונטרול.
2. הניחו את כדורי הכלוב הביתי בכלובים ביתיים חדשים לאחר הניתוח כדי להתחיל להרגיל את בעל החיים לשיטה שבה יוצגו הגירויים ההקשריים במהלך הבדיקה. החלף את כדורי הכלוב הביתיים האלה כל שבועיים.

4. ניתוח וטיפול לאחר הניתוח

1. לשקול ולתעד את משקל הגוף של הנבדקים לפני הניתוח. באמצעות תא אינדוקציה, לספק הרדמה (למשל, 2-5% isoflurane) לבעל החיים.
2. באמצעות קוצץ חשמלי, לגלח לחלוטין את הגפה האחורית. מתן משככי כאבים (למשל, 5 מ"ג/ק"ג של קטופרופן, s.c.) בהתאם להנחיות המוסדיות.
   הערה: ייתכן שיהיה צורך במשכך כאבים נוסף אם הליך זה משולב עם שיטות כירורגיות אחרות.
3. נקו את האזור עם 70% אלכוהול (או מגבון אלכוהול סטרילי זמין מסחרית) ושטיפת פובידון-יוד (או ספוגיות בטאדין סטריליות, עטופות בנפרד) הזמינות מסחרית לסירוגין לפחות שלוש פעמים, ומסתיימות בפובידון-יוד.
4. החזירו את החיה לחדר האינדוקציה, והרדימו את החיה לרמות כירורגיות. לאחר מכן, הגדר את העכבר במסכת פנים להמשך חשיפה להרדמה. החל משחה אופתלמית neomycin על העיניים של החיה כדי למנוע יובש בזמן הרדמה.
   הערה: ההליך לא אמור להתחיל עד שהעכבר לא מראה שום עדות לקליטת כאב (כלומר, רפלקס הקרנית, תגובת צביטה בזנב, רפלקס צביטה בבוהן).
5. באמצעות מספריים כירורגיים בלבד, לבצע חתך רדוד דרך העור על הגפה האחורית הימנית.
6. בתנועה מקבילה לגסטרוקנמיוס, מניחים את הקצה החד של משדר סטרילי מתוכנת מראש ולא מתוכנת לתוך החתך. ודא שהבוכנה הירוקה פונה כלפי מעלה ונראית לעין. המשך לדחוף את המוליך המשדר לתוך החתך עד שפתח המוליך המשדר אינו נראה עוד.
   הערה: אין ללחוץ בטעות על הבוכנה הירוקה במוליך המשדר במהלך שלב 4.6. פריקה מוקדמת של המשדר תוביל למיקום לא תקין.
7. סובב את המוליך ב-180°, וכתוצאה מכך הבוכנה הירוקה פונה כלפי מטה לכיוון איבר העכבר, ואינה נראית עוד לנסיין. דחפו את המוליך המשדר למיקום הסופי. ברגע שהוא נמצא במיקום אידיאלי, סמוך לגסטרוקנמיוס או סגור חלקית בו, יש לדחוף את הבוכנה הירוקה, מה שמאפשר ללחץ של המוליך להנחות את ידו של החוקר הרחק מהעכבר.
8. בעזרת מלקחיים, החזיקו יחד את העור הפתוח והניחו קליפס פצע עם אוטוקליפס סטרילי או תפר סטרילי. במידת הצורך, יש להשתמש בתפרים נספגים לפני האוטוקליפס הסטרילי כדי לסגור את שכבת החיתולית. באמצעות קורא המשדר, בדוק את הטמפרטורה של שריר העכבר.
9. הוציאו את העכבר מההרדמה והניחו אותו בכלוב ביתי נקי הממוקם על גבי כרית חימום במחזור מים, המיועדת להתאוששות נמוכה . ודאו כי הכלוב הביתי כולל כדור תה עם מגבת חסרת ריח כדי להתחיל בהרגלה.
   הערה: העכבר אמור להתעורר מניתוח תוך 15 דקות. ניתן להניח מזון בתחתית הכלוב לגישה נוחה במהלך ימי ההחלמה.
10. טיפול לאחר הניתוח
    1. תעד את משקלי העכבר ואת הטמפרטורות מדי יום באמצעות קורא משדרים למשך יומיים לפחות לאחר הניתוח או עד שהעכברים יחזרו או ייצבו את משקל הגוף.
    2. מתן משככי כאבים שאינם נרקוטיים (למשל, 5 מ"ג/ק"ג של קטופרופן, s.c.) פעם ביום לעכברים למשך יומיים לפחות לאחר הניתוח, עם מינונים נוספים הניתנים לפי הצורך.
       הערה: עכברים וחולדות צריכים להתאושש באופן מלא תוך 5-8 ימים מהניתוח ויכולים לעבור הליכי הרגלה ובדיקה.

5. הכנה לבדיקה - כלוב ביתי

1. בניית מגדלים
   הערה: השלב הבא מבוסס על כלובים בגודל 194 מ"מ x 181 מ"מ x 398 מ"מ עם מסנן עכבר. כדי להתאים לכלובים גדולים יותר (למשל, כלוב ביתי של חולדות), יהיה צורך להתאים את הרוחב.
   1. חתכו את צינור ה-PVC בעזרת חותך PVC מחגר לשמונה חלקים והרכיבו אותו בהתאם לאיור 1C. זה ייתן מבנה שולחן פתוח שיכול להכיל כארבעה כלובים. בצע את המספר הרצוי של risers.
2. סידור החדר
   1. הקצה מיקום לכל riser בתוך חדר הבדיקה. הפרד את ההגבהים המוגדרים לקבלת גירויים הקשריים שונים (כלומר, ריחות) במינימום של 2 מ 'כדי להימנע ממשתנים מבלבלים.
      הערה: לכל עכבר צריך להיות מיקום בדיקה מוקצה בתוך חדר הבדיקה ועל הגבהים הפיזיים ככל שניתן כדי למנוע פיתוח קשרים בין מיקומים שונים וגירויים תרמוגניים.
   2. באמצעות פסים מגנטיים, הצמידו יריעות כירורגיות או חלוקים לרוחב ההגבהות, ויצרו מחסום חזותי בין החוקר לבין הנבדקים. הגדר מחסום זה כדי למזער את שינויי הטמפרטורה הנובעים מפעילות העכבר בעת צפייה בנסיינים הנעים לכיוון הכלוב או סביב חדר הבדיקה.
   3. (אופציונלי) הניחו מראות על המשטח מתחת להגבהות כדי להקל על הצפייה בתחתית הכלוב במהלך הבדיקה.
      הערה: ניתן לחטא את הגבהים באמצעות מערכת שטיפת כלובים. יש לכבס בד או יריעות כירורגיות לפני ההרגלה והבדיקה.
3. הכנת כדור תה
   1. הכינו כדורי תה עם שליטה ומגבות PO (כ-5X5 ס"מ). כדי למנוע זיהום צולב, הכינו תחילה כדורי תה עם ריח בקרה.
      הערה: מגבות בעלות ריח של טורף צריכות לעבור בדיקת פתוגנים לפני השימוש. יש להכיל גם מגבות אלה, וחומרים המקיימים איתן אינטראקציה יש לחטא מיד (כלומר, שטיפת כלוב), ובכך למנוע חשיפה של הריח לבעלי חיים אחרים.

6. בדיקת טמפרטורה - כלוב ביתי

הערה: בעלי חיים צריכים להיות רגילים לכל הליך הניסוי, למעט גירויים קונטקסטואליים ניסיוניים או פרמקולוגיים. יש להשלים זאת לפחות פי 4 לפני הבדיקה.

1. העבירו את בעלי החיים לחדר הניסויים המוכן. מקם את החיות במיקום שהוקצה מראש על ההגבהה. מיקום זה צריך להיות זהה לאורך כל נהלי ההרגלה והבדיקה.
2. הסר את "כדור הכלוב הביתי" מכלוב הבית של העכבר וכסה מחדש את הכלובים במטלית או בסדין כירורגי. אפשרו לעכברים להתאקלם לחלל הבדיקה למשך 1-2 שעות.
3. לאחר השלמת ההתאקלמות, השתמש בסורק כדי למדוד ולתעד את טמפרטורת הבסיס של כל נבדק. הימנעו ממניפולציה של כיסויי הבד במהלך המדידות.
   הערה: ניתן ליישם סוכנים פרמקולוגיים כאן. ניתן להוסיף זמן המתנה לאחר ההזרקה או היישום לפי הצורך לפני הבדיקה. מומלץ להקליט בסיס משני ישירות לפני הבדיקה לאחר הוספת סוכן פרמקולוגי כדי לפקח על התגובה לגירויים פרמקולוגיים. אם תגובת הריח אינה נבדקת, מדידות הטמפרטורה של העכברים יכולות להתחיל מיד לאחר ההזרקה. יש להשתמש באקראיות בעת מתן גירויים כלשהם.
4. חשפו את הכלוב והניחו את כדור התה (קונטרול או PO) על רצפת הכלוב הביתי. החלף את מכסה הכלוב ואת כיסוי הבד.
5. התחילו את שעון העצר. מדוד את הטמפרטורות של הנבדקים באותו סדר של מיקום כדורי תה. תעד טמפרטורות וזמן שעון של מדידות בעקבות נקודות הזמן הרצויות.
6. בסיום הניסוי, הסר את כדור הטיפול. הניחו את העכברים שקיבלו PO בכלוב ביתי חדש עם "כדור הכלוב הביתי" המקורי. החזירו את "כדור הכלוב הביתי" לכלוב של העכברים שקיבלו ריח שליטה. העבירו את העכברים למיקום הדיור.
   הערה: ניתן לתרגם את ההליך הנ"ל למודלים של חולדות בתוך כלובים בגודל מתאים. ייתכן שיידרשו התאמות למדידות המוצעות באיור 1C כדי לאפשר גישה טובה יותר לתחתית הכלוב הביתי.

איור 1: משדרים ובדיקת טמפרטורה בכלוב ביתי . (A) דיאגרמה של מיקום משדר חד-צדדי לבדיקת טמפרטורה בגסטרוקנמיוס עכבר. לאחר התכנות והמיקום, ניתן להשתמש בקורא המשדר (DAS-8027-IUS, מוצג) למדידת טמפרטורה. (B) משמאל, תמונה של כדור תה מנירוסטה עם רשת פתוחה ומגבת בגודל 5X5 ס"מ. מימין, כדור תה סגור, המשמש להחזקת מגבות הרגלה וריח בבדיקת כלובים ביתיים. (C) סכמת הגבהות הבנויה עם צנרת PVC לבדיקת כלובים ביתיים. (D) זרימת עבודה של פרוטוקול בדיקת כלובים ביתיים. (E) תמונות מתקן של אזור בדיקת כלובים ביתיים. משמאל, ארבעה כלובי עכברים על גבי מתרומם. פסים מגנטיים ממוקמים על הקיר הסמוך, ומגנטים ומטלית כירורגית נמצאים על השולחן. ימין, כלובי עכברים מכוסים על מגבהים. (A), (C) ו-(D) נוצרו עם Biorender.com. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

7. בדיקת טמפרטורה - הליכון הליכה

1. הקצו לכל בעל חיים הליכון כמיקום שהוקצה לו לצורך הרגלה והליכי בדיקה.
2. הכינו את ההליכונים לבדיקה, וודאו כי הזעזועים מתפקדים.
   הערה: עבור הליכה על הליכון, יש להגדיר את ההליכונים בקצב הנמוך ביותר הזמין המקדם תנועה רציפה אך לא לרוץ הן לצורך התרגלות והן לצורך בדיקה. עבור הליכון מטבולי מודולרי מוקף 1012M-2, מדובר ב-5.2 מ'/דקה לעכברים ו-7 מ'/דקה לחולדות. ייתכן שיהיה צורך להתאים את הקצב הזה על סמך השמנת היתר של הנושא. יש להגדיר את הזעזועים לעוצמה ושיעור חזרות של 5.0.
3. הרגלה
   1. העבירו את העכברים לחדר הבדיקה. אפשרו לעכברים 1-2 שעות להתאקלם להעברה בחדר בכלובים הביתיים שלהם.
   2. לאחר ההתאקלמות, הדריכו את העכברים לפתיחת ההליכון שהוקצה להם וסגרו את ההליכון. הפעל את החגורה, הזעזוע ושעון העצר.
   3. אפשרו לעכברים ללכת על ההליכונים במשך 15 דקות, תוך שימוש בגירוי הלם כמוטיבציה לתנועה. להפסיק את הבדיקה מיד אם בעל חיים נשאר על שוקר פעיל במשך תקופה ממושכת.
   4. לאחר הבדיקה מוציאים את העכברים ומחזירים אותם לכלובים הביתיים.
   5. נקו את ההליכונים באמצעות חומר ניקוי נוזלי ומים.
4. בדיקות
   1. העבירו את העכברים לחדר הבדיקה. אפשרו לעכברים 1-2 שעות להתאקלם בחדר ההעברה בכלובים הביתיים שלהם.
   2. מדדו ותעדו את טמפרטורת הבסיס לפני הזזת העכבר להליכון.
      הערה: עבור בדיקות כולל חומרים פרמקולוגיים, החל או הזרק אותם כאן, בהתאם לסכמת המוצגת באיור 2A. ניתן להוסיף זמן המתנה לאחר ההזרקה לפי הצורך לפני שהעכברים מונחים על ההליכון. יש להשתמש באקראיות בעת מתן גירויים כלשהם.
   3. הניחו ריבועי בקרה בגודל 5X5 ס"מ או מגבות PO בתוך ההליכון הקרוב ביותר לקדמת ההליכון. הדביקו את המגבות לתקרת ההליכון או מתחתיה למיקום והסרה קלים.
   4. הדרך את העכברים אל ההליכון שהוקצה להם. הפעל את חגורת ההליכון ואת השוקר.
   5. הפעל את שעון העצר. יש למדוד את הנבדקים באותו סדר שבו הוצבו העכברים בהליכונים. רשום את הטמפרטורות וזמן השעון של המדידות לאחר נקודות הזמן הרצויות.
      הערה: ניתן למדוד באופן מהימן את הטמפרטורה מחוץ להליכון בזמן שעכבר נמצא בתוך הליכון סגור במהלך פעילות הליכה. עבור חולדות, מגבלות גודל ההליכון ומרחק קורא המשדר עשויות לדרוש מהנסיין לשמור על גב ההליכון פתוח כדי להכניס את הקורא לתוך ההליכון, קרוב יותר לנבדק.
   6. בסיום הבדיקה, כבו את הזעזועים וההליכונים; להחזיר את העכברים לכלובים הביתיים שלהם. העבירו את העכברים למיקום הדיור.
   7. נקו את ההליכונים באמצעות חומר ניקוי נוזלי ומים, תוך שימת לב ספציפית להסרת שאריות PO.
   8. לאחר השלמת הניסויים, הרדימו את בעלי החיים (למשל, באמצעות שאיפת CO₂ ), ואשרו באופן חזותי את מיקום המשדר.

איור 2: בדיקת טמפרטורה מבוקרת פעילות. (A) זרימת עבודה של בדיקת טמפרטורה מבוקרת פעילות עם חומר פרמקולוגי באמצעות הליכון הליכה. (B) תמונות מתקן של הליכונים. משמאל, תמונה של הגדרת ציוד מלאה. מימין, תמונה קרובה יותר של הליכונים בודדים וזעזועים. (A) נוצר עם Biorender.com. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

תוצאות

משדרים הושתלו באופן חד-צדדי בגסטרוקנמיוס הימני של עשרה עכברים בני 4-6 חודשים, מסוג בר (WT) שגודלו מזן SF1-Cre (Tg(Nr5a1-cre)7Lowl/J, זן #012462, C57BL/6J ורקעי FVB; נקבה N = 5; זכר N = 5). לאחר ההתאוששות, העכברים הורגלו להליך בדיקת טמפרטורה בכלוב ביתי שלא כלל גירוי הקשרי (למשל, PO). מדידות טמפרטורה באמצעות שרביט משדר נרשמו ב?...

Discussion

פרוטוקול בדיקת טמפרטורה זה מספק לשדה דרך למדוד ישירות את התרמוגנזה של שרירי השלד. זה קריטי מכיוון שהמחקר מתעמק בזיהוי המנגנונים העומדים בבסיס תרמוגנזה של שרירים³³. השיטה מספקת שני פרוטוקולים חסכוניים למדידת תרמוגנזה של שרירי השלד בתנאים הקשריים ופרמקולוגיים. פרוטוקול זה מדג...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1012M-2 Modular Enclosed Metabolic Treadmill for Mice, 2 Lanes w/ Shock	Columbus Instruments
1012R-2 Modular Enclosed Metabolic Treadmill for Rats, 2 Lanes w/ Shock	Columbus Instruments
1-1/4 in. Ratcheting PVC Cutter	BrassCraft
1 mL Syringes	Fisher Scientific	BD 309659
Betadine Swabs	Fisher Scientific	19-898-945
Booster Coil	BioMedic Data Systems		Transponder Accessory
Electric Clippers	Andis		40 Ultraedge Clipper Blade
Flexible Mirror Sheets	Amazon		Self Adhesive Non Glass Mirror Tiles
Forceps	Fisher Scientific	89259-940
Heating Pad
Induction Chamber (isoflurane)	Kent Scientific	VetFlo-0730	3.0 L Low Cost Chambers for Traditional Vaporizers
Ketoprophen	Med-Vet Intl.	RXKETO-50
Magnetic Strips	Amazon
Magnets	Amazon		DIYMAG Magnetic Hooks 40lbs
Needles	Med-Vet Intl.	26400
Neomycin/Polymixin/Bacitracin with Hydrocortisone Ophthalmic Ointment, 3.5 g	Med-Vet Intl.	RXNPB-HC
Oasis Absorbable Suture	Med-Vet Intl.	MV-H821-V
Predator (Ferret) Odor Towels	Marshall BioResources
PVC pipe
Reflex Wound Clip Remover	CellPoint Scientific
Reflex Wound Clip, 7 mm (mouse)	CellPoint Scientific
Reflex Wound Clip, 9 mm (rat)	CellPoint Scientific
Srerile Autoclip, 7 mm (mouse)	CellPoint Scientific		Wound Clip Applier (mouse)
Stainless Strainers Interval Seasonings Tea Infuser	Amazon
Sterile Autoclip, 9 mm (rat)	CellPoint Scientific		Wound Clip Applier (rat)
Sterile Saline	Med-Vet Intl.	RX0.9NACL-10
Surgical Scissors	Fisher Scientific	08-951-5
Surgical Sheets
Towels (Control/Habituation)	Amazon		100% Cotton Towels, white
Transponders	BioMedic Data Systems		Model: IPTT-300
Transponders Reader	BioMedic Data Systems		Model: DAS-8027-IUS/ DAS-7007R
Versaclean	Fisher Scientific	18-200-700	liquid detergent
Webcol Alcohol Preps	Covidien	22-246-073
Wedge pieces for PVC pipe