יצירת מודל דצידואליזציה מלאכותית של עכבר עם כריתת שחלות למחקר דצידואליזציה של רירית הרחם

Summary

במאמר זה נתאר את השיטה ליצירת מודל דצידואליזציה מלאכותית באמצעות עכבר השחלות, ניסוי נשירת רירית הרחם הקלאסי בתחום המחקר של נשירת רירית הרחם.

Abstract

דצידואליזציה של רירית הרחם היא תהליך התמיינות ייחודי של רירית הרחם, הקשור קשר הדוק לווסת ולהריון. פגיעה בדצידואליזציה מובילה להפרעות רירית הרחם שונות, כגון אי פוריות, הפלות חוזרות ולידה מוקדמת. הפיתוח והשימוש במודל דצידואליזציה של רירית הרחם במחקרי פוריות היו גולת הכותרת עבור חוקרי פוריות במשך זמן רב. העכבר נמצא בשימוש נרחב בחקר רבייה ודצידואליזציה. ישנם שלושה מודלים מבוססים של עכברים בנוגע לדצידוואליזציה, כלומר דצידואליזציה טבעית של הריון (NPD), דצידואליזציה מלאכותית (AD) ועשריריזציה חוץ גופית (IVD). ביניהם, AD נחשב מודל אמין עבור decidualization עכבר, אשר קל ליישם קרוב NPD. מאמר זה מתמקד בשיטה שונה של תהליך הייצור והיישום של מודל הדצידואליזציה המלאכותית של העכבר עם כריתת שחלות כדי למנוע השפעות שחלתיות, אשר יכול להשיג תוצאות ניתנות לשחזור עם שונות קטנה בתוך הקבוצה. שיטה זו מספקת מודל טוב ואמין של בעלי חיים לחקר עשרוניות רירית הרחם.

Introduction

עם התפתחות טכנולוגיית הרבייה בסיוע אדם, שיעור ההריונות הקליניים הנוכחי של הפריה חוץ גופית-החזרת עוברים (IVF-ET) הגיע או אפילו עלה על זה של הריון טבעי. למרות זאת, מטופלות רבות בקליניקה של רבייה בסיוע עדיין עוברות החזרות עוברים מרובות אך אינן מצליחות להשיג הריון כרצונן. עם זאת, המנגנון המולקולרי הספציפי שלה עדיין אינו ברור, ולכן התערבות קלינית אינה יעילה, וזה אחד האתגרים המשמעותיים העומדים בפני רפואת הרבייה ^1,2.

גורמי רירית הרחם מהווים כשני שלישים מהגורמים לכישלון הפריה חוץ גופית³. השתלת עובר אנושי מחולקת לשלושה שלבים: מיקום, הדבקה ופלישה ^4,5,6. רירית הרחם האימהית עוברת סדרה של שינויים כדי לפגוש את הגעתו של העובר. יצירת "תקופת חלון" להשתלה מספקת תנאים נוחים להשתלת עובר ^7,8.

ברוב היונקים, לאחר שהבלסטוציסט נצמד לאפיתל הלומינלי של הרחם, תאי הסטרומה המקיפים את הבלסטוציסט מתחילים להתרבות ולהתמיין במהירות, והשיפוץ המהיר של המזנכימה משנה את צורתו ותפקודו, מה שמוביל להשתלת עובר ^5,9,10. הגידול המהיר בנפח האתר ובמשקלו מאפשר לבלסטוציסט להשתלב בסטרומה של הרחם, תהליך המכונה דצידואליזציה¹¹. סטרומה רירית הרחם מתמיינת ומתעצבת מחדש לקראת הריון, בעוד המעבר של תאי סטרומה מספק מרחב וחיבורי איתות חדשים לתאים נשירים לבצע את תפקידם^12,13. תאי סטרומה הופכים לתאים נשירים ומפרישים גורמים איקוניים רבים כגון פרולקטין (PRL), חלבון קושר גורם גדילה דמוי אינסולין 1 (Igfbp1) וכן הלאה. מחקרים הראו כי דצידואליזציה חריגה היא אחת הסיבות העיקריות לכישלון השתלת עוברים, אך הסיבה לדצידואליזציה חריגה עדיין אינה ברורה ויש צורך להבהיר אותה^{עוד יותר 1,14}.

מודל הדצידואליזציה המלאכותית של העכבר חיוני לחקר התהליך הפיזיולוגי והמנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס הדצידואליזציה. דצידואליזציה מלאכותית (AD) מתייחסת בעיקר לתהליך של נשירת רירית הרחם שהוקמה בשיטות מלאכותיות כדי לדמות הריון או את המחזור החודשי. מבחינת מורפולוגיה, אין הבדל כולל בין עשרון הריון לבין דצידואליזציה מלאכותית^15,16. בלוטות הרחם קיימות ברירית הרחם לפני שהן נוצרות ונעלמות לאחר העשרה. לגבי ביטוי הגנים, רק הבדל קל מזוהה בין דצידואליזציה טבעית של הריון (NPD) לבין AD¹⁵. כתוצאה מכך, מודל הדצידואליזציה המלאכותית בעכברים יכול לדמות דצידואליזציה של הריון כדי לחקור את הפתוגנזה הלא ידועה וטיפול חדש במחלות רבייה אנושיות.

NPD, AD ודצידואליזציה חוץ גופית (IVD) הן שלוש שיטות להשגת דצידואליזציה של עכברים. מודל NPD תלוי בהריון טבעי והוא הקרוב ביותר למצב הפיזיולוגי של האם, כולל ההשפעות של עוברים. השוואת ההבדלים בין אתרי השתלה ללא השתלה היא גישה פיזיולוגית ונוחה יותר לחקר דצידואליזציה. מודל האלצהיימר פותח על ידי שימוש בהזרקה תוך רחמית של שמן שומשום כממריץ כדי לגרום לדצידואליזציה אצל עכברה מדומה המזווגת עם זכרים שעברו כריתת כלי דם כדי למנוע את ההשפעה של עוברים. הן מודלים של NPD והן של אלצהיימר ממלאים תפקידים חיוניים במטרות מחקר שונות, אך הם אינם יכולים להימנע מכשל הזדווגות ומהבדלים בתוך הקבוצה הנגרמים על ידי פעילויות שונות של מטבוליזם הורמונלי אימהי. IVD היא שיטה התלויה בטיפול בשילוב אסטרוגן ופרוגסטרון ברמה התאית, הדורשת תנאי ניסוי מחמירים יותר ויכולת הפעלה. עם זאת, מודל המבחנה אינו יכול לדמות באופן מלא את התגובה הנשירים בתנאים פיזיולוגיים¹⁵. לכן, אנו מציעים שיטת אינדוקציה פשוטה ומשופרת שונה מן AD מסורתי כדי להפחית את ההשפעה של הורמונים אנדוגניים על decidualization. בהתבסס על הבטחת הצלחת השראת הדצידואליזציה, היא קרובה יותר למצב הפיזיולוגי ומתאימה יותר לניסויים שצריכים להוציא גורמים עובריים.

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים שתוארו אושרו על ידי הוועדה לשימוש וטיפול בבעלי חיים של בית החולים מגדל התוף המסונף לבית הספר לרפואה של אוניברסיטת נאנג'ינג (מס '20171202). כל הפעולות עוקבות אחר הסוכנות המתאימה לטיפול ושימוש בבעלי חיים ולהנחיות לאומיות.

הערה: עכברים גודלו בסביבה ספציפית נטולת פתוגן (SPF), עם טמפרטורה של 22 ° C ± 1 ° C, לחות יחסית של 50% ± 1%, מחזור בהיר / כהה של 12 שעות/12 שעות, וגישה חופשית למזון ומים.

1. עכבר ovariectomy

1. לעקר את כלי הניתוח עם מעקר בטמפרטורה גבוהה ולחץ גבוה 1 יום לפני הניתוח.
2. שוקלים עכברי C57BL/6 בני 8 שבועות ומזריקים 1% נתרן פנטוברביטל בהתאם כדי להרדים את העכברים. המינון המשמש הוא 40 מ"ג / ק"ג¹⁷. מינון זה מספק 40-60 דקות של הרגעה, אשר עונה על הדרישות של כריתת שחלות. לשיכוך כאבים לפני הניתוח, הזריקו לעכברים 5 מ"ג/ק"ג meloxicam (s.c).
   הערה: הרדמה מוצלחת בעכברים יכולה להיות מסומנת על ידי היעלמות של רפלקסים שרירים עמוקים ונשימה יציבה. סימנים להרדמה מוצלחת כוללים ללא מצמוץ בעת נגיעה בקנטוס הפנימי, ללא בליעה בעת משיכת הלשון, ללא כיפוף רגליים בעת צביטת העור בין אצבעות הרגליים, וללא קפיצה בעת מחט הזנב.
3. יש למרוח את משחת המגן על גלגלי העיניים כדי למנוע יובש במהלך ההרדמה.
4. התחל את הפעולה כאשר עכברים מורדמים לחלוטין. מניחים ומקבעים את העכברים במצב נוטה על משטח הניתוח, ומגלחים את השיער על הגב לאחר הרטבתם במי סבון. יש לחטא את העור באתנול 70% לאחר הגילוח.
5. מצא את אתר החתך הניתוחי ב-0.5 ס"מ (או 1.0 ס"מ מתחת לצלע) בקצה העליון של שורש הירך של שתי הגפיים האחוריות במקביל לעמוד השדרה (איור 1A).
   הערה: מיקום חתך נכון חיוני למיקום מהיר של השחלה.
6. קח את אתר החתך כמרכז וחטא את אזור החתך עם יודופור 3x, ולאחר מכן מניחים וילון כירורגי סביב אזור החתך.
7. בצע חתך אורכי של כ 0.5-1.0 ס"מ באמצעות מספריים. חותכים את הפאשיה ומפרידים באופן פסיבי את השרירים עם פינצטה.
8. מצאו חתיכה מכרית השומן הלבן בשדה החתך קרוב לקוטב התחתון של הכליה דרך שכבת השריר הדקה (איור 1B).
   הערה: כרית השומן הלבן היא האינדיקטור הברור ביותר למיקום השחלה.
9. מהדקים את מסת השומן בעזרת קליפסים המוסטטיים, ומוציאים את השחלה העטופה בכרית השומן מהחתך.
10. מהדקים את צומת השחלה והחצוצרה בפינצטה מעוקלת, ומסירים את השחלה לאורך הפדיקור השחלתי בעזרת מספריים. עצור את הדימום באמצעות עט electrocoagulation או מחט של מזרק 1 מ"ל מחומם על מנורת אלכוהול.
    הערה: הקפד לשמר את החצוצרה, שהיא ציון דרך אנטומי להזרקה הבאה של שמן שומשום לתוך קרני הרחם.
11. שטפו את החתך הניתוחי במי מלח רגילים כדי למנוע הידבקות רקמות, השתמשו בתפר 4-0 כדי לתפור את השריר והעור בהתאמה, וחיטאו שוב את החתך הניתוחי ביודופור.
12. הניחו את העכברים במצב נוטה בכלוב והחיאו אותם באינקובטור של 25 מעלות צלזיוס המצויד במקור אור ומערכת אוורור למשך כשעתיים.
13. שימו לב לעכברים לאחר הניתוח, החזירו אותם למקום ההאכלה המקורי לבדם עד שיחלימו לחלוטין, ותנו להם מספיק מים ומזון.

2. מנוחה לאחר הניתוח וניסוח אסטרוגן ופרוגסטרון

1. ודא שהעכברות נחות במשך שבועיים לאחר כריתת השחלות.
2. בארון נקי במיוחד, הוסיפו אסטרוגן (2 ננוגרם/מיקרוליטר) ופרוגסטרון (0.2 ננוגרם/מיקרוליטר) לשמן שומשום בצינורות צנטריפוגות נטולות אנזימי RNA.
3. הניחו את צינורות הצנטריפוגות באמבט מים תרמוסטטי בטמפרטורה של 37°C ונערו את הצינורות ברציפות כדי להאיץ את ההמסה.
4. לאחר המסה מלאה, מחלקים את תמיסת שמן השומשום לאליקוטים של 100 מיקרוליטר לשימוש נוח. אחסנו את תמיסות האסטרוגן והפרוגסטרון המוכנות במקרר בטמפרטורה של 4°C.

3. מודל דצידואליזציה מלאכותית מושרית

1. תת עורית (s.c) להזריק 100 ng של אסטרוגן ב 50 μL של שמן שומשום לתוך כל עכבר במשך 3 ימים, ולאחר מכן 2 ימים של מנוחה¹⁵.
   הערה: ודא שהאסטרוגן והפרוגסטרון נוצרו והונחו במקומות שונים. כל זיהום של אסטרוגן על ידי פרוגסטרון עלול להוביל לכישלון.
2. הזריקו 1 מ"ג פרוגסטרון ו-10 ננוגרם אסטרוגן ב-50 מיקרוליטר שמן שומשום לכל עכבר למשך 3 ימים נוספים¹⁵.
3. הפעל את העכברים כדי לגרום למודל הדצידואליזציה המלאכותית¹⁵ 6 שעות לאחר הזריקה השלישית המשולבת אסטרוגן-פרוגסטרון.
4. מצאו את קרן הרחם בקצה התחתון של החצוצרות והזריקו 20 מיקרוליטר שמן שומשום באיטיות יחד עם קרן הרחם, דחפו את הרקמה לאחור, תפרו את החתך ואפשרו לעכבר להתאושש. הגישה לפעולה זהה לכריתת שחלות עכבר¹⁵.
   הערה: המשך עם הניתוח השני רק במקרה של כריתת שחלות מוצלחת (חתך העור נרפא היטב, השחלה נכרתה לחלוטין, ואת הקצה השיורי של החצוצרה אינו דבוק לרקמות שמסביב).
   הערה: עבור השראת מודל AD, 20 μL של שמן שומשום מתאים; יותר מ -20 מיקרוליטר של שמן שומשום יחדרו בקלות לצד השני.
5. הזריקו 50 מיקרוליטר שמן שומשום המכיל 1 מ"ג פרוגסטרון ו-10 ננוגרם אסטרוגן (H.) למשך 4 ימים נוספים. ראה פירוט באיור 2^15,18.

4. איסוף דוגמאות

1. הרדימו את העכברים (n = 6) על ידי חנק פחמן דו חמצני ואספו את הרחם. התבוננו בצורת הרחם הדו-צדדי, צלמו ושקלו את קרני הרחם (איור 3A, B).
2. לתקן 3-5 מ"מ של רקמת הרחם עם 10% פורמלין, להטביע פרפין, לחתוך אותם. צבעו את המקטעים עם המטוקסילין ואאוזין כדי לצפות בשינויים המורפולוגיים¹⁹ (איור 4A).
3. הטמיעו עוד 3-5 מ"מ מרקמת הרחם בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT), הקפיאו בחנקן נוזלי ואחסנו במקרר בטמפרטורה של 80°C-. קפואים חותכים את הרקמה ל-10 מיקרומטר ומזהים פעילות פוספטאז אלקליין ברקמת הרחם באמצעות שיטת צימוד אזו²⁰ (איור 4B).
   הערה: ניתן לקבל תוצאות משביעות רצון באמצעות מקטעים מוקפאים כדי לזהות תוכן ALP, ולא קטעי פרפין.
4. לחלץ את סך כל הרנ"א של הרחם עם מגיב טריזול ולבצע PCR כמותי בזמן אמת (qPCR) במערכת PCR בזמן אמת (רשימת חומרים) עם תערובת מאסטר qPCR (רשימת חומרים) כדי לזהות את ביטוי ה-mRNA היחסי של תת-משפחה פרולקטין 8 2 (Prl8a2), כבד/עצם/כליה אלקליין פוספטאז (Alpl), וחלבון קושר גורם גדילה דמוי אינסולין 1 (Igfbp1)15 על-ידי נורמליזציה לרמות mRNA של ^18S (איור 4C-E ). בצע את תנאי ה- PCR: שלב 1, 95 ° C למשך 30 שניות; שלב 2, 95 ° C עבור 10 s ו 60 ° C עבור 30 שניות; חזור על המחזור 40x. רשימה מלאה של רצפי פריימר מופיעה בטבלה 1.
5. ניתוח נתוני qPCR בשיטת ^{2-ΔΔCT ושיטת t-test} לניתוח סטטיסטי בתוכנה המתאימה. במחקר זה, p < 0.05 נחשב מובהק סטטיסטית.

תוצאות

מדדי מודל הדצידואליזציה של העכבר כוללים את המורפולוגיה הכללית של הרחם, יחס המסה של הרחם העשרוני והלא נשיר, המורפולוגיה ההיסטולוגית של רירית הרחם ורמת הביטוי של מולקולות סמן דצידואליזציה. המורפולוגיה הכללית של הרחם המלאכותי הנשיר של עכברים המושרה על ידי שמן קרובה יותר לזו של הרחם בהריון. ?...

Discussion

דצידואליזציה בעכברים היא תהליך ספונטני בהתאם לנוכחות עוברים, השונה מבני אדם. עם זאת, נמצא כי גירוי מלאכותי כגון הזרקת רחם של חרוזי זכוכית וחתך ברחם יכול לגרום לדצידואליזציה של רירית הרחם במקום עוברים. בנוסף, החוקרים מצאו כי גורמים רבים יכולים לגרום לנשירים או להשתתף בדצידואליזציה, כגון הז...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Estrogen	Sigma	E2758	Hormone supplement
Progesterone	Sigma	P0130	Hormone supplement
Sesame oil	Sigma	S3547	Hormone supplement
Sodium pentobarbital	Dainippon Sumitomo Pharma Co.,Ltd.		Anaesthesia
Meloxicam injection	Qilu Animal Health Products Co., Ltd		Analgesia
Alkaline phophatase stain kit(kaplow's/azo coupling method)	Solarbio	G1480	Alkaline phophatase stain
Eosin	Servicebio	G1005-2	HE stain
Hematoxylin	Servicebio	G1005-1	HE stain
ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix	Vazyme	Q711-02	qPCR
70% ethanol	Lircon	ZH1120090	Disinfect
Iodophor	Runzekang	RZK-DF	Disinfect
Erythromycin Eye Ointment	Guangzhou Baiyunshan		Mice eyeball protect
4-0 suture	Ethicon	W329	Incision suture
10% formalin	Yulu	L25010118	Tissue fix
Optimal cutting temperature compound	Sakura	4583	Ssection
Trizol reagent	Ambion	15596018	qPCR