Geração de um Modelo de Decidualização Artificial em Camundongos com Ovariectomia para Pesquisa em Decidualização Endometrial

Resumo

Aqui, descrevemos o método de geração de um modelo de decidualização artificial usando a rata ovariectomizada, um experimento clássico de decidualização endometrial no campo de pesquisa da decidualização endometrial.

Resumo

A decidualização endometrial é um processo único de diferenciação do endométrio, intimamente relacionado à menstruação e à gravidez. O comprometimento da decidualização leva a vários distúrbios endometriais, como infertilidade, aborto espontâneo recorrente e parto prematuro. O desenvolvimento e o uso do modelo de decidualização endometrial em estudos reprodutivos têm sido um destaque para os pesquisadores reprodutivos há muito tempo. O camundongo tem sido amplamente utilizado no estudo da reprodução e decidualização. Existem três modelos bem estabelecidos em camundongos em relação à decidualização: decidualização natural da gravidez (NPD), decidualização artificial (AD) e decidualização in vitro (IVD). Dentre eles, o AD é considerado um modelo confiável para decidualização de camundongos, de fácil implementação e próximo ao NPD. Este trabalho enfoca um método modificado do processo de geração e aplicação do modelo de decidualização artificial de camundongos com ooforectomia para evitar efeitos ovarianos, que podem obter resultados altamente reprodutíveis com pequenas variâncias dentro do grupo. Este método fornece um bom e confiável modelo animal para o estudo da decidualização endometrial.

Introdução

Com o desenvolvimento da tecnologia de reprodução assistida por humanos, a atual taxa clínica de gestação de fertilização in vitro-transferência embrionária (FIV-TE) atingiu ou até mesmo excedeu a da gravidez natural. Apesar disso, muitas pacientes na prática clínica de reprodução assistida ainda são submetidas a múltiplas transferências de embriões, mas não conseguem engravidar como desejado. No entanto, seu mecanismo molecular específico ainda não está claro, de modo que a intervenção clínica é ineficaz, o que é um dos desafios significativos enfrentados pela medicina^{reprodutiva1,2}.

Os fatores endometriais são responsáveis por cerca de dois terços das causas de falha da FIV³. A implantação do embrião humano é dividida em três etapas: posicionamento, adesão e invasão ^4,5,6. O endométrio materno passa por uma série de mudanças para atender a chegada do embrião. A formação de um "período de janela" de implantação proporciona condições favoráveis para a implantação embrionária ^7,8.

Na maioria dos mamíferos, após a adesão do blastocisto ao epitélio luminal do útero, as células estromais ao redor do blastocisto rapidamente começam a proliferar e se diferenciar, e a rápida remodelação do mesênquima muda sua forma e função, levando à implantação embrionária ^5,9,10. O rápido aumento do volume e do peso do sítio permite que o blastocisto fique embutido no estroma uterino, processo conhecido como decidualização¹¹. O estroma endometrial diferencia e remodela na preparação para a gestação, enquanto a transição das células estromais fornece espaço e novas conexões de sinalização para que as células deciduais desempenhem suas funções^12,13. As células estromais se transformam em células deciduais e secretam muitos fatores icônicos, como prolactina (PRL), proteína ligadora do fator de crescimento semelhante à insulina 1 (Igfbp1), e assim por diante. Estudos têm mostrado que a decidualização anormal é uma das principais razões para o fracasso da implantação embrionária, mas a causa da decidualização anormal ainda não está clara e precisa ser mais bem elucidada ^1,14.

O modelo de decidualização artificial em camundongos é essencial para estudar o processo fisiológico e os mecanismos moleculares subjacentes à decidualização. A decidualização artificial (DA) refere-se principalmente ao processo de decidualização endometrial estabelecido por métodos artificiais para simular a gravidez ou o ciclo menstrual. Em termos morfológicos, há pouca diferença global entre a decidualização da gestação e a decidualização artificial^15,16. As glândulas uterinas existem no endométrio antes da forma de decídua e desaparecem após a decidualização. Em relação à expressão gênica, apenas uma pequena diferença é identificada entre a decidualização natural da gravidez (DNP) e a^DA15. Consequentemente, o modelo de decidualização artificial em camundongos pode simular a decidualização da gravidez para explorar a patogênese desconhecida e o novo tratamento de doenças reprodutivas humanas.

NPD, AD e decidualização in vitro (IVD) são três métodos para alcançar a decidualização em camundongos. O modelo da DNP depende da gestação natural e está mais próximo do estado fisiológico materno, incluindo os efeitos dos embriões. Comparar as diferenças entre os sítios de implantação e não-implantação é uma abordagem mais fisiológica e conveniente para estudar a decidualização. O modelo AD foi desenvolvido usando uma injeção intrauterina de óleo de gergelim como estimulante para induzir a decidualização em uma rata pseudogestante acasaladas com machos vasectomizados para evitar o impacto dos embriões. Ambos os modelos de DNP e DA desempenham papéis essenciais em diferentes propósitos de pesquisa, mas não podem evitar a falha no acasalamento e as diferenças intragrupo causadas pelas diferentes atividades do metabolismo hormonal materno. IVD é um método que depende do tratamento de estrogênio e progesterona combinados em nível celular, que requer condições experimentais mais rigorosas e capacidade operacional. No entanto, o modelo in vitro não consegue simular completamente a resposta decidual em condições fisiológicas¹⁵. Portanto, propomos um método de indução simples e aprimorado modificado da DA tradicional para reduzir o efeito dos hormônios endógenos na decidualização. Baseado em garantir o sucesso da indução da decidualização, ele está mais próximo do estado fisiológico e mais adequado para experimentos que precisam excluir fatores embrionários.

Protocolo

Todos os experimentos com animais descritos foram aprovados pelo Comitê de Uso e Cuidado de Animais do Hospital da Torre de Tambor Afiliado da Faculdade de Medicina da Universidade de Nanjing (nº 20171202). Todas as operações seguem os cuidados e uso adequado dos animais e as diretrizes nacionais.

NOTA: Os camundongos foram criados em ambiente específico livre de patógenos (FPS), com temperatura de 22 °C ± 1 °C, umidade relativa do ar de 50% ± 1%, ciclo claro/escuro de 12 h/12 h e livre acesso a água e ração.

1. Ooforectomia de camundongos

1. Esterilizar os instrumentos cirúrgicos com um esterilizador de alta temperatura e alta pressão 1 dia antes da operação.
2. Pesar camundongos C57BL/6 de 8 semanas de idade e injetar pentobarbital sódico a 1% por via intraperitoneal (i.p.) para anestesiar os camundongos. A dose utilizada é de 40 mg/kg¹⁷. Esta dose fornece 40-60 minutos de sedação, que atende aos requisitos de uma ooforectomia. Para analgesia pré-operatória, injetar 5 mg/kg de meloxicam (s.c.) em camundongos.
   NOTA: O sucesso da anestesia em camundongos pode ser indicado pelo desaparecimento dos reflexos musculares profundos e respiração estável. Os sinais de anestesia bem-sucedida incluem não piscar ao tocar o canto interno, não engolir ao puxar a língua, não dobrar a perna ao beliscar a pele entre os dedos dos pés e não quicar ao agulhar a cauda.
3. Aplique a pomada protetora dos olhos nos globos oculares para evitar o ressecamento durante a anestesia.
4. Inicie a operação quando os ratos estiverem completamente anestesiados. Coloque e fixe os ratos na posição prona na superfície de operação e raspe os pelos nas costas depois de molhá-los com água e sabão. Desinfetar a pele com etanol 70% após o barbear.
5. Localizar o local da incisão da operação a 0,5 cm (ou 1,0 cm abaixo da costela) na borda superior da raiz da coxa de ambos os membros posteriores paralelos à coluna vertebral (Figura 1A).
   NOTA: A localização correta da incisão é essencial para localizar rapidamente o ovário.
6. Tome o local da incisão como centro e desinfete a área da incisão com iodóforo 3x, em seguida, coloque um pano cirúrgico ao redor da área da incisão.
7. Faça uma incisão longitudinal de cerca de 0,5-1,0 cm usando tesoura. Corte a fáscia e separe passivamente os músculos com uma pinça.
8. Encontrar um pedaço do coxim gorduroso branco no campo de incisão próximo ao polo inferior do rim através da fina camada muscular (Figura 1B).
   NOTA: O coxim de gordura branca é o indicador mais óbvio da localização do ovário.
9. Aperte a massa gorda com clipes hemostáticos e puxe o ovário envolvido pelo coxim gorduroso para fora da incisão.
10. Aperte a junção do ovário e da tuba uterina com uma pinça curva e remova o ovário ao longo do pedículo ovariano com uma tesoura. Pare o sangramento usando uma caneta de eletrocoagulação ou uma agulha de uma seringa de 1 mL aquecida na lâmpada de álcool.
    NOTA: Certifique-se de preservar a trompa de Falópio, que é o marco anatômico para a subsequente injeção de óleo de gergelim nos chifres uterinos.
11. Enxaguar a incisão cirúrgica com soro fisiológico para evitar a adesão tecidual, usar uma sutura 4-0 para costurar o músculo e a pele, respectivamente, e desinfetar a incisão cirúrgica com iodóforo novamente.
12. Coloque os camundongos em decúbito ventral na gaiola e ressuscite-os em uma incubadora de 25 °C equipada com uma fonte de luz e um sistema de ventilação por cerca de 2 h.
13. Preste atenção aos ratos após a operação, coloque-os de volta no local de alimentação original sozinhos até que eles se recuperem completamente e dê-lhes água e comida suficientes.

2. Repouso pós-operatório e formulação de estrógeno e progesterona

1. Certifique-se de que os ratos descansem por 2 semanas após a ooforectomia.
2. Em um gabinete ultralimpo, adicione estrogênio (2 ng/μL) e progesterona (0,2 ng/μL) ao óleo de gergelim em tubos de centrífuga sem enzimas de RNA.
3. Coloque os tubos de centrifugação num banho-maria termostático a 37 °C e agite os tubos continuamente para acelerar a dissolução.
4. Após a dissolução completa, divida a solução de óleo de gergelim em aliqouts de 100 μL para uso conveniente. Conservar as soluções preparadas de estrogénio e progesterona num frigorífico a 4 °C.

3. Modelo de decidualização artificial induzida

1. Por via subcutânea (s.c) injetar 100 ng de estrogênio em 50 μL de óleo de gergelim em cada camundongo por 3 dias, seguidos por 2 dias de repouso¹⁵.
   NOTA: Certifique-se de que o estrogênio e a progesterona foram formulados e colocados em lugares diferentes. Qualquer contaminação de estrogênio por progesterona pode levar à falha.
2. Injetar (s.c.) 1 mg de progesterona e 10 ng de estrogênio em 50 μL de óleo de gergelim em cada camundongo por mais 3 dias¹⁵.
3. Operar os camundongos para induzir o modelo de decidualização artificial¹⁵ a 6 h após a terceira injeção combinada de estrogênio e progesterona.
4. Encontre o corno do útero na extremidade inferior das trompas de Falópio e injete 20 μL de óleo de gergelim lentamente junto com o corno uterino, empurre o tecido para trás, suture a incisão e permita que o camundongo se recupere. A abordagem da operação é a mesma da ooforectomia de camundongos¹⁵.
   NOTA: Só prossiga com a segunda cirurgia no caso de uma ovariectomia bem-sucedida (a incisão da pele está bem cicatrizada, o ovário é completamente excisado e a extremidade residual da tuba uterina não está aderida aos tecidos circundantes).
   NOTA: Para induzir o modelo AD, 20 μL de óleo de gergelim são apropriados; mais de 20 μL de óleo de gergelim penetrarão facilmente no outro lado.
5. Injetar (s.c.) 50 μL de óleo de gergelim contendo 1 mg de progesterona e 10 ng de estrogênio (H.) por mais 4 dias. Ver detalhes na Figura 2^15,18.

4. Coleta de amostras

1. Eutanasiar os camundongos (n = 6) por asfixia por dióxido de carbono e coletar os úteros. Observe a forma dos úteros bilaterais, tire fotos e pese os cornos uterinos (Figura 3A, B).
2. Fixar 3-5 mm do tecido uterino com formalina a 10%, embutir em parafina e seccioná-los. Corar os cortes com hematoxilina e eosina para observar as alterações morfológicas¹⁹ (Figura 4A).
3. Incorpore mais 3-5 mm do tecido do útero em composto de temperatura de corte ideal (OCT), congele em nitrogênio líquido e armazene em uma geladeira de -80 °C. Corte congelado do tecido a 10 μm e detecção de atividade de fosfatase alcalina no tecido uterino pelo método de acoplamento azo²⁰ (Figura 4B).
   NOTA: Resultados satisfatórios podem ser obtidos usando seções congeladas para detectar o conteúdo de ALP, não cortes de parafina.
4. Extrair os RNAs totais do útero com o reagente Trizol e realizar PCR quantitativo em tempo real (qPCR) em um sistema de PCR em tempo real (Tabela de Materiais) com mix mestre de qPCR (Tabela de Materiais) para detectar a expressão relativa de RNAm do membro 2 da subfamília 2 da família prolactina 8 (Prl8a2), fosfatase alcalina fígado/osso/rim (Alpl) e proteína ligadora do fator de crescimento semelhante à insulina 1 (Igfbp1)15 por normalização para os níveis de mRNA ^18S (Figura 4C-E ). Siga as condições de PCR: Estágio 1, 95 °C por 30 s; Estágio 2, 95 °C por 10 s e 60 °C por 30 s; repita o ciclo 40x. Uma lista completa das sequências de primers é fornecida na Tabela 1.
5. Analise os dados da qPCR usando o método ^2-ΔΔCT e um método de teste t para análise estatística no software apropriado. Neste estudo, considerou-se estatisticamente significante p < 0,05.

Resultados

Os índices do modelo de decidualização em camundongos incluem a morfologia geral do útero, a razão de massa do útero decidualizado e não decidualizado, a morfologia histológica do endométrio e o nível de expressão de moléculas marcadoras de decidualização. A morfologia geral do útero artificial decidualizado de camundongos induzido por óleo é mais próxima à do útero na gestação. O corpo uterino torna-se espesso, e a cavidade uterina torna-se menor do que o lado não induzido. O volume e o peso do co...

Discussão

A decidualização em camundongos é um processo espontâneo que depende da presença de embriões, o que é diferente dos humanos. No entanto, verificou-se que a estimulação artificial, como a injeção uterina de contas de vidro e laceração uterina, pode induzir a decidualização do endométrio em vez de embriões. Além disso, pesquisadores descobriram que muitos fatores poderiam induzir a decidualização ou participar da decidualização, como a injeção de hormônios esteroides, prostaglandinas e fatores inib...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Estrogen	Sigma	E2758	Hormone supplement
Progesterone	Sigma	P0130	Hormone supplement
Sesame oil	Sigma	S3547	Hormone supplement
Sodium pentobarbital	Dainippon Sumitomo Pharma Co.,Ltd.		Anaesthesia
Meloxicam injection	Qilu Animal Health Products Co., Ltd		Analgesia
Alkaline phophatase stain kit(kaplow's/azo coupling method)	Solarbio	G1480	Alkaline phophatase stain
Eosin	Servicebio	G1005-2	HE stain
Hematoxylin	Servicebio	G1005-1	HE stain
ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix	Vazyme	Q711-02	qPCR
70% ethanol	Lircon	ZH1120090	Disinfect
Iodophor	Runzekang	RZK-DF	Disinfect
Erythromycin Eye Ointment	Guangzhou Baiyunshan		Mice eyeball protect
4-0 suture	Ethicon	W329	Incision suture
10% formalin	Yulu	L25010118	Tissue fix
Optimal cutting temperature compound	Sakura	4583	Ssection
Trizol reagent	Ambion	15596018	qPCR