Generazione di un modello di decidualizzazione artificiale del topo con ovariectomia per la ricerca sulla decidualizzazione endometriale

Riepilogo

Qui, descriviamo il metodo per generare un modello di decidualizzazione artificiale usando il topo ovariectomizzato, un classico esperimento di decidualizzazione endometriale nel campo di ricerca della decidualizzazione endometriale.

Abstract

La decidualizzazione endometriale è un processo di differenziazione unico dell'endometrio, strettamente correlato alle mestruazioni e alla gravidanza. La compromissione della decidualizzazione porta a vari disturbi dell'endometrio, come l'infertilità, l'aborto spontaneo ricorrente e la nascita pretermine. Lo sviluppo e l'uso del modello di decidualizzazione endometriale negli studi riproduttivi sono stati un punto culminante per i ricercatori riproduttivi per molto tempo. Il topo è stato ampiamente utilizzato nello studio della riproduzione e della decidualizzazione. Esistono tre modelli murini ben consolidati per quanto riguarda la decidualizzazione, vale a dire la decidualizzazione naturale della gravidanza (NPD), la decidualizzazione artificiale (AD) e la decidualizzazione in vitro (IVD). Tra questi, AD è considerato un modello affidabile per la decidualizzazione del mouse, che è facile da implementare e vicino a NPD. Questo articolo si concentra su un metodo modificato del processo di generazione e applicazione del modello di decidualizzazione artificiale del topo con ovariectomia per evitare effetti ovarici, che possono ottenere risultati altamente riproducibili con piccole variazioni all'interno del gruppo. Questo metodo fornisce un modello animale buono e affidabile per lo studio della decidualizzazione endometriale.

Introduzione

Con lo sviluppo della tecnologia di riproduzione assistita dall'uomo, l'attuale tasso di gravidanza clinica di fecondazione in vitro-trasferimento di embrioni (IVF-ET) ha raggiunto o addirittura superato quello della gravidanza naturale. Nonostante ciò, molte pazienti nella pratica clinica della riproduzione assistita si sottopongono ancora a trasferimenti multipli di embrioni ma non riescono a ottenere la gravidanza come desiderato. Tuttavia, il suo specifico meccanismo molecolare non è ancora chiaro, quindi l'intervento clinico è inefficace, che è una delle sfide significative che la medicina riproduttiva deve affrontare ^1,2.

I fattori endometriali rappresentano circa i due terzi delle cause del fallimento della fecondazione in vitro³. L'impianto dell'embrione umano è diviso in tre fasi: posizionamento, adesione e invasione ^4,5,6. L'endometrio materno subisce una serie di cambiamenti per andare incontro all'arrivo dell'embrione. La formazione di un "periodo finestra" di impianto fornisce condizioni favorevoli per l'impianto dell'embrione ^7,8.

Nella maggior parte dei mammiferi, dopo che la blastocisti aderisce all'epitelio luminale dell'utero, le cellule stromali che circondano la blastocisti iniziano rapidamente a proliferare e differenziarsi, e il rapido rimodellamento del mesenchima cambia la sua forma e funzione, portando all'impianto dell'embrione ^5,9,10. Il rapido aumento del volume e del peso del sito consente alla blastocisti di essere incorporata nello stroma uterino, un processo noto come decidualizzazione¹¹. Lo stroma endometriale si differenzia e si rimodella in preparazione alla gravidanza, mentre la transizione delle cellule stromali fornisce spazio e nuove connessioni di segnalazione per le cellule deciduali per svolgere le loro funzioni^12,13. Le cellule stromali si trasformano in cellule deciduali e secernono molti fattori iconici come la prolattina (PRL), la proteina legante il fattore di crescita insulino-simile 1 (Igfbp1) e così via. Gli studi hanno dimostrato che la decidualizzazione anormale è una delle ragioni principali del fallimento dell'impianto dell'embrione, ma la causa della decidualizzazione anormale non è ancora chiara e deve essere ulteriormente chiarita ^1,14.

Il modello di decidualizzazione artificiale del topo è essenziale per studiare il processo fisiologico e i meccanismi molecolari alla base della decidualizzazione. La decidualizzazione artificiale (AD) si riferisce principalmente al processo di decidualizzazione endometriale stabilito da metodi artificiali per simulare la gravidanza o il ciclo mestruale. In termini di morfologia, c'è poca differenza complessiva tra decidualizzazione della gravidanza e decidualizzazione artificiale^15,16. Le ghiandole uterine esistono nell'endometrio prima della formazione decidua e scompaiono dopo la decidualizzazione. Per quanto riguarda l'espressione genica, è stata identificata solo una leggera differenza tra la decidualizzazione naturale della gravidanza (NPD) e l'AD¹⁵. Di conseguenza, il modello di decidualizzazione artificiale nei topi può simulare la decidualizzazione della gravidanza per esplorare la patogenesi sconosciuta e il nuovo trattamento delle malattie riproduttive umane.

NPD, AD e decidualizzazione in vitro (IVD) sono tre metodi per ottenere la decidualizzazione del topo. Il modello NPD dipende dalla gravidanza naturale ed è più vicino allo stato fisiologico materno, compresi gli effetti degli embrioni. Confrontare le differenze tra siti di impianto e non impianto è un approccio più fisiologico e conveniente per studiare la decidualizzazione. Il modello AD è stato sviluppato utilizzando un'iniezione intrauterina di olio di sesamo come stimolante per indurre la decidualizzazione in un topo femmina pseudogravido accoppiato con maschi vasectomizzati per evitare l'impatto degli embrioni. Entrambi i modelli NPD e AD svolgono ruoli essenziali in diversi scopi di ricerca, ma non possono evitare il fallimento dell'accoppiamento e le differenze all'interno del gruppo causate dalle diverse attività del metabolismo ormonale materno. IVD è un metodo che dipende dal trattamento combinato di estrogeni e progesterone a livello cellulare, che richiede condizioni sperimentali più rigorose e capacità operativa. Tuttavia, il modello in vitro non può simulare completamente la risposta deciduale in condizioni fisiologiche¹⁵. Pertanto, proponiamo un metodo di induzione semplice e migliorato modificato dall'AD tradizionale per ridurre l'effetto degli ormoni endogeni sulla decidualizzazione. Basato sul garantire il successo dell'induzione della decidualizzazione, è più vicino allo stato fisiologico e più adatto per esperimenti che devono escludere fattori embrionali.

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Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali descritti sono stati approvati dal Comitato per l'uso e la cura degli animali della Scuola medica dell'Università di Nanchino (n. 20171202). Tutte le operazioni seguono le linee guida nazionali e dell'agenzia per la cura e l'uso degli animali.

NOTA: I topi sono stati allevati in un ambiente specifico privo di agenti patogeni (SPF), con una temperatura di 22 °C ± 1 °C, umidità relativa del 50% ± 1%, un ciclo luce/buio di 12 h/12 h e libero accesso al cibo e all'acqua.

1. Ovariectomia del topo

1. Sterilizzare gli strumenti chirurgici con uno sterilizzatore ad alta temperatura e alta pressione 1 giorno prima dell'operazione.
2. Pesare topi C57BL/6 di 8 settimane e iniettare per via intraperitoneale (i.p) l'1% di pentobarbital di sodio di conseguenza per anestetizzare i topi. La dose utilizzata è di 40 mg/kg¹⁷. Questa dose fornisce 40-60 minuti di sedazione, che soddisfa i requisiti di un'ovariectomia. Per l'analgesia preoperatoria, iniettare nei topi 5 mg/kg di meloxicam (s.c.).
   NOTA: L'anestesia di successo nei topi può essere indicata dalla scomparsa dei riflessi muscolari profondi e dalla respirazione costante. I segni di anestesia di successo includono nessun battito di ciglia quando si tocca il canto interno, nessuna deglutizione quando si tira la lingua, nessuna piegatura della gamba quando si pizzica la pelle tra le dita dei piedi e nessun rimbalzo quando si aguglia la coda.
3. Applicare l'unguento protettivo per gli occhi ai bulbi oculari per prevenire la secchezza durante l'anestesia.
4. Inizia l'operazione quando i topi sono completamente anestetizzati. Posizionare e fissare i topi in posizione prona sulla superficie operatoria e radersi i peli sulla schiena dopo averli bagnati con acqua saponata. Disinfettare la pelle con etanolo al 70% dopo la rasatura.
5. Trova il sito di incisione dell'operazione a 0,5 cm (o 1,0 cm sotto la costola) sul bordo superiore della radice della coscia di entrambi gli arti posteriori paralleli alla colonna vertebrale (Figura 1A).
   NOTA: Una corretta posizione dell'incisione è essenziale per localizzare rapidamente l'ovaio.
6. Prendere il sito di incisione come centro e disinfettare l'area di incisione con iodophor 3x, quindi posizionare un drappo chirurgico intorno all'area di incisione.
7. Fare un'incisione longitudinale di circa 0,5-1,0 cm usando le forbici. Tagliare la fascia e separare passivamente i muscoli con una pinzetta.
8. Trova un pezzo del cuscinetto di grasso bianco nel campo di incisione vicino al polo inferiore del rene attraverso il sottile strato muscolare (Figura 1B).
   NOTA: Il cuscinetto di grasso bianco è l'indicatore più ovvio della posizione dell'ovaio.
9. Bloccare la massa grassa con clip emostatiche e tirare l'ovaia avvolta dal cuscinetto di grasso dall'incisione.
10. Bloccare la giunzione dell'ovaio e della tuba di Falloppio con una pinzetta curva e rimuovere l'ovaia lungo il peduncolo ovarico con le forbici. Interrompere l'emorragia utilizzando una penna elettrocoagulante o un ago di una siringa da 1 mL riscaldata sulla lampada ad alcool.
    NOTA: Assicurati di preservare la tuba di Falloppio, che è il punto di riferimento anatomico per la successiva iniezione di olio di sesamo nelle corna uterine.
11. Risciacquare l'incisione chirurgica con soluzione salina normale per prevenire l'adesione dei tessuti, utilizzare una sutura 4-0 per cucire rispettivamente il muscolo e la pelle e disinfettare nuovamente l'incisione chirurgica con iodophor.
12. Posizionare i topi in posizione prona nella gabbia e rianimarli in un'incubatrice a 25 °C dotata di una sorgente luminosa e di un sistema di ventilazione per circa 2 ore.
13. Presta attenzione ai topi dopo l'operazione, rimettili nel luogo di alimentazione originale da soli fino a quando non si riprendono completamente e dai loro abbastanza acqua e cibo.

2. Riposo postoperatorio e formulazione di estrogeni e progesterone

1. Assicurati che i topi riposi per 2 settimane dopo l'ovariectomia.
2. In un armadietto ultra-pulito, aggiungere estrogeni (2 ng / μL) e progesterone (0,2 ng / μL) nell'olio di sesamo in provette da centrifuga prive di enzimi RNA.
3. Posizionare i tubi della centrifuga in un bagno d'acqua termostatico a 37 °C e agitare continuamente i tubi per accelerare la dissoluzione.
4. Dopo completa dissoluzione, dividere la soluzione di olio di sesamo in aliqout da 100 μL per un uso conveniente. Conservare le soluzioni preparate di estrogeni e progesterone in frigorifero a 4 °C.

3. Modello di decidualizzazione artificiale indotta

1. Per via sottocutanea (s.c) iniettare 100 ng di estrogeni in 50 μL di olio di sesamo in ciascun topo per 3 giorni, seguiti da 2 giorni di riposo¹⁵.
   NOTA: Assicurarsi che l'estrogeno e il progesterone siano stati formulati e collocati in luoghi diversi. Qualsiasi contaminazione di estrogeni da progesterone può portare al fallimento.
2. Iniettare (s.c.) 1 mg di progesterone e 10 ng di estrogeni in 50 μL di olio di sesamo in ciascun topo per altri 3 giorni¹⁵.
3. Operare i topi per indurre il modello di decidualizzazione artificiale¹⁵ 6 h dopo la terza iniezione combinata estrogeno-progesterone.
4. Trova il corno dell'utero all'estremità inferiore delle tube di Falloppio e inietta lentamente 20 μL di olio di sesamo insieme al corno uterino, spingi indietro il tessuto, sutura l'incisione e consenti al topo di recuperare. L'approccio all'operazione è lo stesso dell'ovariectomia del topo¹⁵.
   NOTA: Procedere con il secondo intervento chirurgico solo in caso di successo dell'ovariectomia (l'incisione cutanea è ben guarita, l'ovaio è completamente asportato e l'estremità residua della tuba di Falloppio non aderisce ai tessuti circostanti).
   NOTA: Per indurre il modello AD, 20 μL di olio di sesamo sono appropriati; più di 20 μL di olio di sesamo penetrano facilmente nell'altro lato.
5. Iniettare (s.c.) 50 μL di olio di sesamo contenente 1 mg di progesterone e 10 ng di estrogeni (H.) per altri 4 giorni. Cfr. dettagli nella figura 2^15,18.

4. Raccolta dei campioni

1. Eutanasia i topi (n = 6) mediante asfissia di anidride carbonica e raccogliere gli uteri. Osservare la forma degli uteri bilaterali, scattare foto e pesare le corna uterine (Figura 3A, B).
2. Fissare 3-5 mm di tessuto uterino con formalina al 10%, incorporare in paraffina e sezionarli. Colorare le sezioni con ematossilina ed eosina per osservare i cambiamenti morfologici¹⁹ (Figura 4A).
3. Incorporare altri 3-5 mm di tessuto uterino nel composto della temperatura di taglio ottimale (OCT), congelare in azoto liquido e conservare in frigorifero a -80 °C. Congelare il tessuto a 10 μm e rilevare l'attività della fosfatasi alcalina nel tessuto uterino mediante il metodo di accoppiamento azoico²⁰ (Figura 4B).
   NOTA: risultati soddisfacenti possono essere ottenuti utilizzando sezioni congelate per rilevare il contenuto di ALP, non sezioni di paraffina.
4. Estrarre gli RNA totali dell'utero con il reagente Trizol ed eseguire la PCR quantitativa in tempo reale (qPCR) su un sistema di PCR in tempo reale (Table of Materials) con qPCR master mix (Table of Materials) per rilevare l'espressione relativa dell'mRNA del membro 2 della sottofamiglia 2 della famiglia 8 della prolattina (Prl8a2), della fosfatasi alcalina fegato/ossa/rene (Alpl) e della proteina legante il fattore di crescita insulino-simile 1 (Igfbp1)¹⁵ mediante normalizzazione ai livelli di mRNA 18S (Figura 4C-E ). Seguire le condizioni PCR: Stadio 1, 95 °C per 30 s; Fase 2, 95 °C per 10 s e 60 °C per 30 s; Ripeti il ciclo 40x. Un elenco completo delle sequenze di primer è fornito nella Tabella 1.
5. Analizzare i dati qPCR utilizzando il metodo ^{2-ΔΔCT e un metodo t-test} per l'analisi statistica nel software appropriato. In questo studio, p < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo.

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Risultati

Gli indici del modello di decidualizzazione del topo includono la morfologia generale dell'utero, il rapporto di massa dell'utero decidualizzato e non decidualizzato, la morfologia istologica dell'endometrio e il livello di espressione delle molecole marcatrici di decidualizzazione. La morfologia generale dell'utero artificiale decidualizzato dei topi indotto dall'olio è più vicina a quella dell'utero in gravidanza. Il corpo uterino diventa spesso e la cavità uterina diventa più piccola del lato non indotto. Il volum...

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Discussione

La decidualizzazione nei topi è un processo spontaneo che dipende dalla presenza di embrioni, che è diverso dagli esseri umani. Tuttavia, è stato scoperto che la stimolazione artificiale come l'iniezione uterina di perle di vetro e la lacerazione uterina può indurre la decidualizzazione dell'endometrio anziché degli embrioni. Inoltre, i ricercatori hanno scoperto che molti fattori potrebbero indurre deciduali o partecipare alla decidualizzazione, come l'iniezione di ormoni steroidei, prostaglandine e fattori inibito...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Estrogen	Sigma	E2758	Hormone supplement
Progesterone	Sigma	P0130	Hormone supplement
Sesame oil	Sigma	S3547	Hormone supplement
Sodium pentobarbital	Dainippon Sumitomo Pharma Co.,Ltd.		Anaesthesia
Meloxicam injection	Qilu Animal Health Products Co., Ltd		Analgesia
Alkaline phophatase stain kit(kaplow's/azo coupling method)	Solarbio	G1480	Alkaline phophatase stain
Eosin	Servicebio	G1005-2	HE stain
Hematoxylin	Servicebio	G1005-1	HE stain
ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix	Vazyme	Q711-02	qPCR
70% ethanol	Lircon	ZH1120090	Disinfect
Iodophor	Runzekang	RZK-DF	Disinfect
Erythromycin Eye Ointment	Guangzhou Baiyunshan		Mice eyeball protect
4-0 suture	Ethicon	W329	Incision suture
10% formalin	Yulu	L25010118	Tissue fix
Optimal cutting temperature compound	Sakura	4583	Ssection
Trizol reagent	Ambion	15596018	qPCR