Создание модели искусственной децидуализации мыши с овариэктомией для исследования децидуализации эндометрия

Резюме

Здесь мы описываем метод создания модели искусственной децидуализации с использованием овариэктомизированной мыши, классический эксперимент по децидуализации эндометрия в области исследований децидуализации эндометрия.

Аннотация

Децидуализация эндометрия – это уникальный процесс дифференцировки эндометрия, тесно связанный с менструацией и беременностью. Нарушение децидуализации приводит к различным нарушениям эндометрия, таким как бесплодие, привычное невынашивание беременности и преждевременные роды. Разработка и использование модели децидуализации эндометрия в репродуктивных исследованиях долгое время были основным событием для исследователей-репродуктологов. Мышь широко использовалась при изучении размножения и децидуализации. Существует три хорошо зарекомендовавших себя мышиных модели децидуализации, а именно естественная децидуализация беременности (NPD), искусственная децидуализация (AD) и децидуализация in vitro (IVD). Среди них AD считается надежной моделью децидуализации мыши, которая проста в реализации и близка к NPD. В данной статье основное внимание уделяется модифицированному методу создания и применения модели искусственной децидуализации мышей с овариэктомией для предотвращения эффектов яичников, что позволяет получить высоковоспроизводимые результаты с небольшими внутригрупповыми дисперсиями. Этот метод обеспечивает хорошую и надежную животную модель для изучения децидуализации эндометрия.

Введение

С развитием репродуктивных технологий с помощью человека текущая частота клинической беременности экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов (ЭКО-ЭТ) достигла или даже превысила частоту естественной беременности. Несмотря на это, многие пациентки в клинической практике вспомогательной репродукции по-прежнему подвергаются многократному переносу эмбрионов, но не могут достичь желаемой беременности. Однако его специфический молекулярный механизм до сих пор неясен, поэтому клиническое вмешательство неэффективно, что является одной из существенных проблем, стоящих перед репродуктивной медициной ^1,2.

Эндометриоидные факторы составляют около двух третей причин неудачи^ЭКО3. Имплантация эмбриона человека делится на три этапа: позиционирование, адгезия и инвазия ^4,5,6. Материнский эндометрий претерпевает ряд изменений, чтобы соответствовать прибытию эмбриона. Формирование имплантационного «оконного периода» обеспечивает благоприятные условия для имплантации эмбриона ^7,8.

У большинства млекопитающих после прилипания бластоцисты к просветному эпителию матки стромальные клетки, окружающие бластоцисту, быстро начинают размножаться и дифференцироваться, а быстрое ремоделирование мезенхимы меняет ее форму и функцию, что приводит к имплантации эмбриона ^5,9,10. Быстрое увеличение объема и веса участка позволяет бластоцисте внедряться в строму матки, процесс, известный как децидуализация¹¹. Строма эндометрия дифференцируется и ремоделируется при подготовке к беременности, в то время как переход стромальных клеток обеспечивает пространство и новые сигнальные связи для децидуальных клеток для выполнения своих функций^12,13. Стромальные клетки превращаются в децидуальные клетки и секретируют многие знаковые факторы, такие как пролактин (PRL), инсулиноподобный белок, связывающий фактор роста 1 (Igfbp1), и так далее. Исследования показали, что аномальная децидуализация является одной из ключевых причин неудачной имплантации эмбриона, но причина аномальной децидуализации до сих пор неясна и нуждается в дальнейшем выяснении ^1,14.

Модель искусственной децидуализации мыши имеет важное значение для изучения физиологических процессов и молекулярных механизмов, лежащих в основе децидуализации. Искусственная децидуализация (АД) в основном относится к процессу децидуализации эндометрия, установленному искусственными методами для имитации беременности или менструального цикла. С точки зрения морфологии, общая разница между децидуализацией беременности и искусственной децидуализацией^{невелика 15,16}. Маточные железы существуют в эндометрии до формирования децидуа и исчезают после децидуализации. Что касается экспрессии генов, то выявлено лишь небольшое различие между естественной децидуализацией беременности (NPD) и AD¹⁵. Следовательно, модель искусственной децидуализации у мышей может имитировать децидуализацию беременности для изучения неизвестного патогенеза и нового лечения репродуктивных заболеваний человека.

NPD, AD и децидуализация in vitro (IVD) — это три метода достижения децидуализации мыши. Модель NPD зависит от естественной беременности и наиболее близка к физиологическому состоянию матери, включая эффекты от эмбрионов. Сравнение различий между имплантационными и неимплантационными участками является более физиологичным и удобным подходом для изучения децидуализации. Модель AD была разработана с использованием внутриматочной инъекции кунжутного масла в качестве стимулятора, чтобы вызвать децидуализацию у псевдобеременной самки мыши, спаренной с вазэктомией самцов, чтобы избежать воздействия эмбрионов. Модели НРЛ и БА играют важную роль в различных исследовательских целях, но они не могут избежать сбоев спаривания и внутригрупповых различий, вызванных различной активностью метаболизма материнских гормонов. IVD - это метод, зависящий от лечения комбинированным эстрогеном и прогестероном на клеточном уровне, который требует более строгих экспериментальных условий и работоспособности. Однако модель in vitro не может полностью имитировать децидуальный ответ в физиологических условиях¹⁵. Поэтому мы предлагаем простой и улучшенный метод индукции, модифицированный по сравнению с традиционным БА, чтобы уменьшить влияние эндогенных гормонов на децидуализацию. Исходя из обеспечения успешности индукции децидуализации, она ближе к физиологическому состоянию и больше подходит для экспериментов, требующих исключения эмбриональных факторов.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Все описанные эксперименты на животных были одобрены Комитетом по использованию и уходу за животными Медицинской школы Нанкинского университета (No 20171202). Все операции проводятся в соответствии с соответствующими рекомендациями агентства по уходу за животными и их использования, а также национальными рекомендациями.

ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши были выращены в среде, свободной от патогенов (SPF), с температурой 22 °C ± 1 °C, относительной влажностью 50% ± 1%, циклом свет/темнота 12 ч/12 ч и свободным доступом к пище и воде.

1. Овариэктомия мыши

1. Стерилизуйте хирургические инструменты с помощью высокотемпературного стерилизатора и стерилизатора высокого давления за 1 день до операции.
2. Взвесьте 8-недельных мышей C57BL / 6 и внутрибрюшинно (внутривенно) введите 1% пентобарбитала натрия соответственно, чтобы обезболить мышей. Используемая доза составляет 40 мг / кг¹⁷. Эта доза обеспечивает 40-60 минут седации, что соответствует требованиям овариэктомии. Для предоперационной анальгезии вводите мышам 5 мг / кг мелоксикама (/к).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Об успешном обезболивании у мышей может свидетельствовать исчезновение глубоких мышечных рефлексов и ровное дыхание. Признаки успешной анестезии включают отсутствие моргания при прикосновении к внутреннему кантусу, отсутствие глотания при вытягивании языка, отсутствие сгибания ног при защемлении кожи между пальцами ног и отсутствие подпрыгивания при уколе хвоста.
3. Нанесите защитную глазную мазь на глазные яблоки, чтобы предотвратить сухость во время анестезии.
4. Начинайте операцию, когда мыши полностью обезболиваются. Поместите и зафиксируйте мышей в положении лежа на рабочей поверхности, а волосы на спине сбритье, предварительно намочив их мыльным раствором. Продезинфицируйте кожу 70% этанолом после бритья.
5. Найдите место разреза на 0,5 см (или на 1,0 см ниже ребра) на верхнем крае корня бедра обеих задних конечностей параллельно позвоночнику (рис. 1А).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Правильное расположение разреза необходимо для быстрой локализации яичника.
6. Возьмите место разреза в качестве центра и продезинфицируйте область разреза йодофором 3x, затем наденьте хирургическую простыню вокруг области разреза.
7. Сделайте продольный надрез около 0,5-1,0 см с помощью ножниц. Разрежьте фасцию и пассивно разделите мышцы пинцетом.
8. Найдите кусочек белого жирового мешка в поле разреза рядом с нижним полюсом почки через тонкий мышечный слой (рис. 1B).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Белая жировая подушка является наиболее очевидным индикатором расположения яичника.
9. Зажмите жировую массу кровоостанавливающими зажимами, а яичник, обернутый жировой подушкой, вытащите из разреза.
10. Зажмите соединение яичника и маточной трубы изогнутым пинцетом, а ножницами удалите яичник вдоль ножки яичника. Остановите кровотечение с помощью шприц-ручки для электрокоагуляции или иглы шприца объемом 1 мл, нагретой на спиртовой лампе.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно сохраняют маточную трубу, которая является анатомическим ориентиром для последующего введения кунжутного масла в рога матки.
11. Промойте хирургический разрез обычным физиологическим раствором, чтобы предотвратить слипание тканей, используйте шов 4-0, чтобы сшить мышцу и кожу соответственно, и снова продезинфицируйте хирургический разрез йодофором.
12. Поместите мышей в положение лежа в клетке и реанимируйте их в инкубаторе с температурой 25 °C, оснащенном источником света и системой вентиляции, примерно на 2 часа.
13. Обратите внимание на мышей после операции, поместите их обратно в исходное место кормления в одиночестве, пока они полностью не выздоровеют, и дайте им достаточно воды и еды.

2. Послеоперационный покой и состав эстрогена и прогестерона

1. Убедитесь, что мыши отдыхают в течение 2 недель после овариэктомии.
2. В ультрачистом шкафу добавьте эстроген (2 нг/мкл) и прогестерон (0,2 нг/мкл) в кунжутное масло в центрифужных пробирках без РНК-ферментов.
3. Поместите центрифужные пробирки в термостатическую водяную баню при температуре 37 ° C и непрерывно встряхивайте пробирки для ускорения растворения.
4. После полного растворения разделите раствор кунжутного масла на аликуты по 100 мкл для удобного использования. Приготовленные растворы эстрогена и прогестерона хранить в холодильнике при температуре 4 °C.

3. Модель индуцированной искусственной децидуализации

1. Подкожно (/к) вводят 100 нг эстрогена в 50 мкл кунжутного масла каждой мыши в течение 3 дней, а затем 2 дня отдыха¹⁵.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что эстроген и прогестерон были сформулированы и размещены в разных местах. Любое загрязнение эстрогена прогестероном может привести к неудаче.
2. Вводите (/к) 1 мг прогестерона и 10 нг эстрогена в 50 мкл кунжутного масла каждой мыши в течение еще 3 дней¹⁵.
3. Оперируют мышей для индуцирования модели искусственной децидуализации через^{15 через} 6 ч после третьей комбинированной инъекции эстроген-прогестерон.
4. Найдите рог матки на нижнем конце фаллопиевых труб и медленно введите 20 мкл кунжутного масла вместе с рогом матки, отодвинуте ткань назад, зашите разрез и дайте мышке восстановиться. Подход к операции такой же, как и при овариэктомии^{мыши 15}.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Приступайте ко второй операции только в случае успешной овариэктомии (разрез кожи хорошо заживает, яичник полностью иссечен, а остаточный конец фаллопиевой трубы не прилипает к окружающим тканям).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для индуцирования модели AD достаточно 20 мкл кунжутного масла; более 20 мкл кунжутного масла легко проникнет на другую сторону.
5. Введите (/к) 50 мкл кунжутного масла, содержащего 1 мг прогестерона и 10 нг эстрогена (H.), в течение еще 4 дней. Подробнее см. на рисунке 2^15,18.

4. Сбор образцов

1. Усыпьте мышей (n = 6) путем удушья углекислым газом и соберите матку. Понаблюдайте за формой двусторонней матки, сделайте фотографии и взвесьте рога матки (рис. 3А, Б).
2. Зафиксируйте 3-5 мм ткани матки 10% формалином, всадите в парафин и разрезайте их. Окрашивают срезы гематоксилином и эозином, чтобы наблюдать морфологические изменения¹⁹ (рис. 4А).
3. Поместите еще 3-5 мм ткани матки в смесь с оптимальной температурой резки (OCT), заморозьте в жидком азоте и храните в холодильнике с температурой -80 °C. Замораживают срез ткани до 10 мкм и определяют активность щелочной фосфатазы в ткани матки методом^{азосвязывания 20} (рис. 4Б).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Удовлетворительные результаты могут быть получены с использованием замороженных срезов для определения содержания ALP, а не срезов парафина.
4. Извлеките общее количество РНК матки с помощью реагента тризола и выполните количественную ПЦР в реальном времени (кПЦР) на системе ПЦР в реальном времени (Таблица материалов) с мастер-миксом кПЦР (Таблица материалов) для обнаружения относительной экспрессии мРНК члена подсемейства 2 семейства пролактина 8 (Prl8a2), щелочной фосфатазы печени/костей/почек (Alpl) и инсулиноподобного белка, связывающего фактор роста 1 (Igfbp1)¹⁵ путем нормализации до уровней мРНК 18S (рис. 4C-E ). Соблюдайте условия ПЦР: стадия 1, 95 °C в течение 30 с; Стадия 2, 95 °C в течение 10 с и 60 °C в течение 30 с; Повторите цикл 40 раз. Полный список последовательностей праймеров приведен в таблице 1.
5. Анализируйте данные кПЦР с помощью метода ^{2-ΔΔCT и метода t-критерия} для статистического анализа в соответствующем программном обеспечении. В данном исследовании p < 0,05 считался статистически значимым.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Индексы модели децидуализации мыши включают общую морфологию матки, соотношение массы децидуализированной и недецидуализированной матки, гистологическую морфологию эндометрия и уровень экспрессии молекул маркера децидуализации. Общая морфология искусственной децидуализированно?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Децидуализация у мышей — это спонтанный процесс, зависящий от наличия эмбрионов, который отличается от человеческого. Однако было обнаружено, что искусственная стимуляция, такая как инъекция стеклянных шариков в матку и разрыв матки, может вызвать децидуализацию эндометрия вместо эм?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Estrogen	Sigma	E2758	Hormone supplement
Progesterone	Sigma	P0130	Hormone supplement
Sesame oil	Sigma	S3547	Hormone supplement
Sodium pentobarbital	Dainippon Sumitomo Pharma Co.,Ltd.		Anaesthesia
Meloxicam injection	Qilu Animal Health Products Co., Ltd		Analgesia
Alkaline phophatase stain kit(kaplow's/azo coupling method)	Solarbio	G1480	Alkaline phophatase stain
Eosin	Servicebio	G1005-2	HE stain
Hematoxylin	Servicebio	G1005-1	HE stain
ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix	Vazyme	Q711-02	qPCR
70% ethanol	Lircon	ZH1120090	Disinfect
Iodophor	Runzekang	RZK-DF	Disinfect
Erythromycin Eye Ointment	Guangzhou Baiyunshan		Mice eyeball protect
4-0 suture	Ethicon	W329	Incision suture
10% formalin	Yulu	L25010118	Tissue fix
Optimal cutting temperature compound	Sakura	4583	Ssection
Trizol reagent	Ambion	15596018	qPCR