רישום זרם אשלגן תלוי מתח על קרדיומיוציטים H9C2 באמצעות טכניקת הידוק טלאי של תאים שלמים

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה יעילה לרכישה דינמית בזמן אמת של זרמי תעלה אשלגן מגודר מתח (Kv) בקרדיומיוציטים H9c2 באמצעות טכניקת הידוק טלאי של תאים שלמים.

Abstract

תעלות אשלגן על קרום תא שריר הלב ממלאות תפקיד חשוב בוויסות הפעילות האלקטרופיזיולוגית של התא. בהיותו אחד מתעלות היונים העיקריות, תעלות אשלגן מגודרות מתח (Kv) קשורות קשר הדוק לכמה מחלות לב חמורות, כגון נזק לשריר הלב הנגרם על ידי תרופות ואוטם שריר הלב. במחקר הנוכחי, נעשה שימוש בטכניקת הידוק טלאי של תאים שלמים כדי לקבוע את ההשפעות של 1.5 mM 4-aminopyridine (4-AP, מעכב תעלות אשלגן רחב טווח) ואקוניטין (AC, 25 μM, 50 μM, 100 μM ו- 200 μM) על זרם ערוץ Kv (_{I Kv}) בקרדיומיוציטים H9c2. נמצא כי 4-AP עיכב את ה-I Kv בכ-54%, בעוד שההשפעה המעכבת של AC על_{ה-I Kv} הראתה מגמה תלוית מינון (ללא השפעה עבור 25 μM, שיעור מעכב של 30% עבור 50 μM, שיעור מעכב של 46% עבור 100 μM ושיעור מעכב של 54% עבור 200 μM). בשל המאפיינים של רגישות ודיוק גבוהים יותר, טכניקה זו תקדם את חקר הקרדיוטוקסיות ואת ההשפעות הפרמקולוגיות של אתנו-רפואה המכוונות לתעלות יונים.

Introduction

תעלות יונים הן חלבונים משולבים מיוחדים המוטבעים בדו-שכבת השומנים של קרום התא. בנוכחות אקטיבטורים, המרכזים של חלבונים משולבים מיוחדים כאלה יוצרים נקבוביות הידרופיליות סלקטיביות ביותר, המאפשרות ליונים בגודל ומטען מתאימים לעבור באופן הובלה פסיבי¹. תעלות יונים הן הבסיס לרגישות התאים ולביו-אלקטריות וממלאות תפקיד מפתח במגוון פעילויות תאיות². הלב מספק דם לאיברים אחרים באמצעות התכווצויות קבועות הנובעות מתהליך עירור-כיווץ-מצומד היזום על ידי פוטנציאל פעולה³. מחקרים קודמים אישרו כי הדור של פוטנציאל הפעולה בקרדיומיוציטים נגרם על ידי השינוי בריכוז היונים התוך-תאיים, וההפעלה וההשבתה של תעלות יונים Na+, Ca²+, ו-K⁺ בקרדיומיוציטים אנושיים מובילות להיווצרות פוטנציאלי פעולה ברצף מסוים 4,5,6. זרמי תעלה של אשלגן מגודר מתח (Kv) (I_Kv) עלולים לשנות את קצב הלב הרגיל, ולהוביל להפרעות קצב, שהן אחת הסיבות המובילות למוות. לכן, הקלטת_{ה-I Kv} היא קריטית להבנת המנגנונים של תרופות לטיפול בהפרעות קצב מסכנות חיים⁷.

תעלת Kv היא מרכיב חשוב בתעלת האשלגן. פונקציית הקואורדינציה של תעלת Kv ממלאת תפקיד חשוב בפעילות החשמלית ובהתכווצות שריר הלב של לב היונקים ^8,9,10. בקרדיומיוציטים, המשרעת ומשך פוטנציאל הפעולה תלויים בהולכה משותפת של זרמי K⁺ חיצוניים על ידי תת-סוגים מרובים של ערוץ Kv¹¹. הרגולציה של פונקציית ערוץ Kv חשובה מאוד עבור repolarization נורמלי של פוטנציאל הפעולה הלב. אפילו השינוי הקל ביותר במוליכות Kv משפיע מאוד על רה-פולריזציה של הלב ומגדיל את האפשרות להפרעות קצב^12,13.

כמייצגת שיטה בסיסית במחקר אלקטרופיזיולוגי תאי, ניתן ליצור חותם בעל עמידות גבוהה בין אזור קטן של קרום התא לבין קצה פיפטה לרישום מהדק טלאי של תא שלם על ידי הפעלת לחץ שלילי. הלחץ השלילי המתמשך גורם לקרום התא לבוא במגע עם קצה הפיפטה ולהידבק לדופן הפנימית של הפיפטה. המעגל החשמלי השלם המתקבל מאפשר להקליט כל זרם של תעלת יונים בודדת על פני השטח של קרום התא¹⁴. לטכניקה זו רגישות גבוהה מאוד לזרם תעלת היונים של קרום התא וניתן להשתמש בה לאיתור זרמים בכל תעלות היונים, והיישומים רחבים ביותר¹⁵. יתר על כן, בהשוואה לתיוג פלואורסצנטי ותיוג רדיואקטיבי, למהדק טלאי יש סמכות ודיוק גבוהים יותר¹⁶. נכון לעכשיו, נעשה שימוש בטכניקת הידוק המדבקות של תאים שלמים כדי לזהות את רכיבי הרפואה הסינית המסורתית הפועלים על זרמי ערוץ Kv^17,18,19. לדוגמה, Wang et al. השתמשו בטכניקת הידוק טלאי של תאים שלמים ואישרו כי הרכיב היעיל של זרע הלוטוס עשוי להשיג את העיכוב של ערוץ Kv4.3 על ידי חסימת ערוצי המדינה המופעלים¹⁹. אקוניטין (AC) הוא אחד המרכיבים היעילים והפעילים של מיני אקוניטום, כגון אקוניטום קרמיכאלי דבקס ואקוניטום מטוטלת בוש. מחקרים רבים הראו כי מנת יתר של AC יכול לגרום הפרעות קצב ואפילו דום לב²⁰. האינטראקציה בין AC לתעלות יונים מגודרות מתח מובילה לשיבוש של הומאוסטזיס יונים תוך תאי, שהוא מנגנון המפתח של קרדיוטוקסיות²¹. לכן, במחקר זה, טכניקת הידוק טלאי של תאים שלמים משמשת לקביעת ההשפעות של AC על_{I Kv} של קרדיומיוציטים.

Protocol

הקרדיומיוציטים של חולדות H9c2 שהתקבלו באופן מסחרי (ראו טבלת החומרים) דוגרו ב-DMEM המכיל 10% סרום בקר עוברי מומת חום (FBS) ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספירה לחה של 5% CO₂. לאחר מכן, נעשה שימוש בטכניקת הידוק טלאי של תאים שלמים כדי לזהות את השינויים_{ב-I Kv} בתאי H9c2 רגילים ובתאים שטופלו ב-4-AP או ב-AC (איור 1 ואיור 2).

1. הכנת פתרון

1. הכינו את תרבית תאי ה-DMEM המכיל 10% FBS ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין (ראו טבלת חומרים).
2. הכן תמיסת 1.5 M 4-AP על-ידי הוספת 14.1165 מ"ג של 4-AP ל- 100 μL של תמיסת DMSO (ראה טבלת חומרים). דלל 1.5 M 4-AP ל-1.5 mM על-ידי הוספת הפתרון החוץ-תאי (שלב 1.5).
3. הכן 400 mM AC על-ידי הוספת 5 מ"ג AC ל-19.36 מיקרון ליטר של תמיסת DMSO (ראה טבלת חומרים).
   הערה: כל התמיסות הנ"ל אוחסנו במקרר של 4 מעלות צלזיוס, והריכוז הסופי של ה-DMSO לא יעלה על 0.1% (v/v).
4. הכן 50 מ"ל של תמיסה תוך-תאית על-ידי הוספת 0.4100 גרם של KCl (110.0 mM), 0.0120 גרם של MgCl 2 (1.2 mM), 0.1270 גרם של Na₂ ATP (5.0 mM), 0.1190 גרם של HEPES (10.0 mM) ו-0.1900 גרם של EGTA (10.0 mM) לתוך 50 מ"ל של מים מזוקקים כפולים (ראה טבלה 1 וטבלת חומרים).
   הערה: ערך ה- pH של התמיסה התוך-תאית הותאם ל- 7.2 באמצעות 1 M KOH והוכנס לנפחים קטנים (1.5-2 מ"ל) ואוחסן ב- −20 °C.
5. הכן 50 מ"ל של תמיסה חוץ-תאית על-ידי הוספת 0.0185 גרם של KCl (5.0 mM), 0.3945 גרם של NaCl (135.0 mM), 0.0203 גרם של MgCl 2·6H2O (_2.0 mM), 0.0595 גרם של HEPES (5.0 mM), ו-0.0990 גרם של D-גלוקוז (10.0 mM) לתוך 50 מ"ל של מים מזוקקים כפולים (ראה טבלה 1 וטבלת חומרים).
   הערה: יש להכין את התמיסה החוץ-תאית לשימוש מיידי, ולהתאים את ערך ה-pH שלה ל-7.4 באמצעות 1 M NaOH.

2. תרבית תאים

1. ברגע שצלחת התרבית H9c2 הופכת ל-80% מפגש, עכלו את התאים עם 0.25% טריפסין למשך 30 שניות.
2. תרבית 2 x 10 5 תאים למ"ל עם מדיום רגיל או מדיום המכיל תרופות (25 μM, 50 μM, 100 μM, ו- 200 μM AC) בצלחת 35 מ"מ עם שטיח עם לוחות זכוכית במשך 24 שעות ב 37 °C,^{עם 5%} _{CO 2} אטמוספירה ו 70% עד 80% לחות יחסית (ראה טבלת חומרים).

3. ייצור מיקרופיפטים

1. הפעילו את מושך המיקרופיפטה (ראו טבלת חומרים), וחממו מראש למשך 30 דקות.
2. שים נימי זכוכית בורוסיליקט עם נימה (OD: 1.5 מ"מ, ID: 1.10 מ"מ, 10 ס"מ אורך) על מושך micropipette. בחר את התוכנית שהוגדרה בשלב 3.3 ולחץ על Enter בלוח הבקרה. לחץ על תוכנית הרמפה בפינה השמאלית העליונה כדי לקבוע את הערך "חום" של נימי הזכוכית.
3. כתוב את התוכנית למשיכת האלקטרודה בהתאם לערך שנקבע על ידי בדיקת "רמפה", והשתמש בשלבים הבאים: ערך "חום" = ערך "רמפה", משיכה = 0, Vel = מהירות נעה של מוט משיכה, זמן = 200-250. לחץ על משיכה כדי להתחיל לייצר את הפיפטות.
   הערה: שימו לב לצבע חומרי ההתייבשות במיכל האטום של מושך המיקרופיפטה לפני השימוש בו. אם הצבע משתנה מכחול לוורוד, יש להחליף את חומרי הייבוש. כדי למנוע את הזיהום של קצה האלקטרודה, נסה לא לגעת בחלק האמצעי של נימי הזכוכית במהלך הכנת הפיפטה. לאחר מכן, בזהירות להסיר את פיפטות המיוצר, ומניחים אותם במיכל סגור ואטום.

4. הגדרת מכשירים

1. הפעל את המכשירים המתאימים בסדר הבא: הממיר הדיגיטלי-אנלוגי, מגבר האות, המיקרומניפולטור, המיקרוסקופ והמצלמה (ראה טבלת חומרים).
2. פתח את יישום ההדמיה, את תוכנת מגבר האותות ואת תוכנת רכישת הנתונים ברצף (ראה טבלת חומרים).
   הערה: יש להפעיל את המכשיר ברצף; אחרת, המצב "הדגמה Digitizer" יופיע לאחר פתיחת התוכנה.

5. הגדרת פרמטר_{I Kv}

1. ערוך את הפרוטוקול להקלטת_{ה- I Kv} בהתאם לשלבים הבאים.
   1. לחץ על ערוך, ובחר ערוך פרוטוקול בתוכנת איסוף הנתונים (ראה טבלת חומרים).
   2. ערוך את התוכנית בממשק "צורת גל": עידן A (רמה ראשונה = −60 mV, רמת דלתא = 0 mV, משך ראשון = 20 אלפיות השנייה, ומשך דלתא = 0 אלפיות השנייה); עידן B (רמה ראשונה = −40 mV, רמת דלתא = 10 mV, משך ראשון = 150 אלפיות השנייה, ומשך דלתא = 0 אלפיות השנייה), ותקופה C (רמה ראשונה = −60 mV, רמת דלתא = 0 mV, משך ראשון = 30 אלפיות השנייה, ומשך דלתא = 0 אלפיות השנייה).
   3. לאחר מכן, לחץ על ממשק Mode/Rate והגדר את נתוני "היררכיית הניסיון": השהיית ניסיון = 0 שניות, ריצות = 1, מטאטא = 11, ומשך טאטוא = 0.22 שניות^22,23.
      הערה: רכוש את זרמי ערוץ_{I Kv} על-ידי החלת צעדים דה-פולריזציה של 150 אלפיות השנייה מ- −40 mV ל- +60 mV עם תוספת של 10 mV בפוטנציאל החזקה של −60 mV בתנאי בקרה. הזמן הכולל של הפרוטוקול צריך להיות גדול יותר מהזמן שנקבע בתוכנית "צורת גל".
2. ערוך את תוכנית חיסור הדליפה P/N: לחץ על ערוך פרוטוקול כדי לבחור בלחצן גירוי , והגדר את תוכנית חיסור הדליפה בתיבת הדו-שיח חיסור דליפה P/N : מספר תת-גורפים = 2-8 (4 במחקר זה), זמן התיישבות = 100-1,000 אלפיות השנייה (200 במחקר זה), "קוטביות" = "מנוגדת לצורת גל", רמת החזקה = −80 mV.
   הערה: רמת ההחזקה של חיסור דליפת P/N חייבת להיות נמוכה מרמת ההחזקה הראשונה (−60 mV).

6. הקלטת מהדק טלאי של תא שלם של ה _{- I Kv} במצב מהדק מתח

1. צור את נתיב אחסון הנתונים: לחץ על קובץ ובחר הגדר שמות קבצי נתונים בתוכנת רכישת הנתונים. פתח את פרוטוקול_{I Kv} שהוקם (שלב 5.1) על ידי בחירת עריכה ולחיצה על פרוטוקול פתוח בתוכנת רכישת הנתונים. לבסוף, לחץ על כלים אפשרות ובחר בדיקת ממברנה כדי להתחיל להפעיל את הפרוטוקול.
2. הוסיפו את התמיסה החוץ-תאית (שלב 1.5) לאמבטיית התאים במנגנון הידוק הטלאי של התא כולו (ראו טבלת חומרים), והניחו את הכיסוי כלפי מעלה עם תאי H9c2 (בתרבית בשלב 2.1) באמבטיה.
3. מלאו 30% מהפיפטה (המיוצרת בשלב 3) בתמיסה החוץ-תאית, והתקינו אותה על מחזיק אלקטרודת ההקלטה המשולב במנגנון המדבקה-מהדק. הדקו את הפיפטה עם אטם הגומי o-ring ומכונת הכביסה מפלסטיק. לאחר מכן, שחרר את פיפטה לתוך האמבטיה עם micromanipulator. לחץ על ממשק ההסטה של Pipette של תוכנת מגבר האותות (ראה טבלת חומרים) כדי לשמור על קו הבסיס הנוכחי_{של I Kv} ב- 0 pA.
   הערה: התמיסה התוך-תאית (שלב 1.4) חייבת להיות במגע עם חלק AgCl/Ag של חוט הכסף, וחוט הכסף לא יכול להיות קרוב לדופן הפנימית של הפיפטה. ההתנגדות של פיפטה צריך להיות 2-6 MΩ. כדי למנוע חסימה של קצה הפיפטה, יש להעביר לחץ חיובי מתמשך לפיפטה באמצעות מזרק 1.0 מ"ל המחובר למחזיק אלקטרודת ההקלטה באמצעות צינורות פלסטיק²⁴.
4. ספק לחץ חיובי מתאים באופן ידני עם מזרק 1.0 מ"ל המחובר למחזיק אלקטרודת ההקלטה דרך צינור פלסטיק. הזז את הפיפטה מעט על ידי מניפולציה של המיקרומניפולטור בשלושה ממדים כדי ליצור קשר עם התא.
5. לאחר שהגל המרובע של בדיקת הממברנה יורד ב-1/3 עד 1/2 לאחר שהפיפטה נוגעת בקרום התא, הסר את הלחץ החיובי והעביר לחץ שלילי מתאים באופן ידני. לאחר מכן, לחץ על ממשק התיקון של תוכנת רכישת הנתונים כדי ליצור את חותם GΩ. השתמש בתוכנת מגבר האותות "C p Fast" ו-"C_p Slow" במהלך איטום התאים כדי לפצות על הקיבוליות המהירה והאיטית.
   הערה: כאשר בדיקת הממברנה היא ≥1 GΩ, נוצרת תצורה המחוברת לתא בין קצה הפיפטה לתא.
6. החל פולסים קצרים של לחץ שלילי כדי לקרוע טלאי של קרום התא.
   הערה: הפחתה חדה בהתנגדות הממברנה מאפיינת דפוס מוצלח של רישום תאים שלמים. אם התנגדות הגישה (R_a) ≥30 MΩ, יש לבחור מחדש את התאים עבור שלבים 6.3-6.6. על מנת להבטיח את הדיוק של נתוני_{I Kv} שנרשמו, יש להסיר את הלחץ השלילי לאחר שבירת קרום התא.
7. בצע פיצוי קיבוליות של קרום תא שלם על ידי לחיצה על כפתור התא השלם של תוכנת מגבר האותות. לבסוף, שמור והקלט את הנתונים על ידי לחיצה על הקלטת נתונים לחצן.
8. פתח את נתוני_{ה- I Kv} השמורים באמצעות תוכנת ניתוח הנתונים. שמור את קשרי הגומלין בין מתח זרם למתח (I−V): לחץ על נתח כדי לבחור סטטיסטיקה כדי לבצע את הפעולות הבאות: בחר את הטווח כ - Cousors 1,2 לניתוח נתונים; לחץ על הלחצנים משרעת שיא וממוצע ולאחר מכן לחץ על אישור כדי להציג את הנתונים בדף התוצאות . לבסוף, העתק את העמודה של נתוני ממוצע I_Kv לתוכנת שרטוט הפונקציות (ראה טבלת חומרים) לניתוח נוסף.
9. שמור את העקיבה הנוכחית_{של I Kv} המייצג: לחץ על ערוך כדי לבחור העבר מעקבים; לאחר מכן, בחר את המעקב המלא באזור להעברה; לאחר מכן, לחץ על בחר בבחירת מעקב, ובחר IN 0 (pA) באותות; לבסוף, לחץ על אישור כדי להציג את הנתונים בדף "תוצאות", והעתק את סך הנתונים לתוכנת ציור הפונקציה כדי לצייר את העקבות הנוכחיים.
10. שמור את פרוטוקול_{I Kv} : לחץ על ערוך כדי לבחור צור אות צורת גל של גירוי ובחר אישור. לאחר מכן, בצע שוב את שלב 6.9 למעט בחירת A0 # 0 (mA) ב "אותות".

תוצאות

פרוטוקול זה איפשר הקלטה של_{I Kv} על פי הפרמטרים שנקבעו בטכניקת תיקון תא שלם. _{ה-I Kv} הופעל על-ידי 150 מילישניות של גירוי דופק דה-פולריזציה מ-40+ עד +60 mV בפוטנציאל החזקה של −60 mV (איור 3A). ה-_{I Kv} של קרדיומיוציטים של חולדות H9c2 הופיע לראשונה בסביבות −20 mV, ואז המשרעת גדלה עם ד...

Discussion

הטכניקה האלקטרופיזיולוגית של מהדק טלאי משמשת בעיקר לתיעוד ושיקוף הפעילות החשמלית והמאפיינים התפקודיים של תעלות יונים על קרום התא²⁵. כיום, שיטות ההקלטה העיקריות של טכניקת מהדק הטלאי כוללות הקלטה חד-ערוצית והקלטת תאים שלמים²⁶. עבור מצב התא כולו, מיקרואלקטרודת הזכו?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-Aminopyridine	Sigma	MKCJ2184
Aconitine	Chengdu Lemetian Medical Technology Co., Ltd	DSTDW000602
Amplifier	Axon Instrument	MultiClamp 700B
Analytical Balance	Sartorius	124S-CW
ATP Na2	Solarbio	416O022
Borosilicate glass with filament (O.D.: 1.5 mm, I.D.: 1.10 mm, 10 cm length)	Sutter Instrument	163225-5
Cell culture dish (100 mm)	Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd	1192022
Cell culture dish (35 mm)	Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd	3012022
Clampex software	Molecular Devices, LLC.	Version 10. 5
Clampfit software	Molecular Devices, LLC.	Version 10. 6. 0. 13	data acqusition software
D-(+)-glucose	Rhawn	RH289133
Digital camera	Hamamatsu	C11440
Digitizer	Axon Instrument	Axon digidata 1550B
DMSO	Boster Biological Technology Co., Ltd	PYG0040
Dulbecco's modified eagle medium (1x)	Gibco	8121587
EGTA	Biofroxx	EZ6789D115
Fetal bovine serum	Gibco	2166090RP
Flaming/brown micropipette puller	Sutter Instrument	Model P-1000
H9c2 cells	Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd	CL0111
HCImageLive	Hamamatsu	4.5.0.0
HCl	Sichuan Xilong Scientific Co., Ltd	2106081
HEPES	Xiya Chemical Technology (Shandong) Co., Ltd	20210221
KCl	Chengdu Colon Chemical Co., Ltd	2020082501
KOH	Chengdu Colon Chemical Co., Ltd	2020112601
MgCl2	Tianjin Guangfu Fine Chemical Research Institute	20160408
MgCl2·6H2O	Chengdu Colon Chemical Co., Ltd	2021020101
Micromanipulator	Sutter Instrument	MP-285A
Microscope	Olympus	IX73
Microscope cover glass (20 × 20 mm)	Jiangsu Citotest Experimental Equipment Co. Ltd	80340-0630
Milli-Q	Chengdu Bioscience Technology Co., Ltd	Milli-Q IQ 7005
MultiClamp 700B commander	Axon Instrument	MultiClamp commander 2.0	signal-amplifier software
OriginPro 8 software	OriginLab Corporation	v8.0724(B724)
Penicillin-Streptomycin (100x)	Boster Biological Technology Co., Ltd	17C18B16
PH meter	Mettler Toledo	S201K
Phosphate buffered saline (1x)	Gibco	8120485
Trypsin 0.25% (1x)	HyClone	J210045