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  • Déclarations de divulgation
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  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Le présent protocole décrit une méthode efficace pour l’acquisition dynamique et en temps réel des courants des canaux potassiques voltage-dépendants (Kv) dans les cardiomyocytes H9c2 en utilisant la technique de patch-clamp à cellules entières.

Résumé

Les canaux potassiques sur la membrane cellulaire du myocarde jouent un rôle important dans la régulation des activités électrophysiologiques cellulaires. Étant l’un des principaux canaux ioniques, les canaux potassiques voltage-dépendants (Kv) sont étroitement associés à certaines maladies cardiaques graves, telles que les lésions myocardiques induites par les médicaments et l’infarctus du myocarde. Dans la présente étude, la technique de patch-clamp à cellules entières a été utilisée pour déterminer les effets de 1,5 mM de 4-aminopyridine (4-AP, un inhibiteur des canaux potassiques à large spectre) et d’aconitine (AC, 25 μM, 50 μM, 100 μM et 200 μM) sur le courant du canal Kv (IKv) dans les cardiomyocytes H9c2. Il a été constaté que la 4-AP inhibait le I Kv d’environ 54%, tandis que l’effet inhibiteur de l’AC sur le IKv montrait une tendance dose-dépendante (aucun effet pour 25 μM, taux inhibiteur de 30% pour 50 μM, taux inhibiteur de 46% pour 100 μM et taux inhibiteur de 54% pour 200 μM). En raison des caractéristiques de sensibilité et de précision plus élevées, cette technique favorisera l’exploration de la cardiotoxicité et des effets pharmacologiques de l’ethnomédecine ciblant les canaux ioniques.

Introduction

Les canaux ioniques sont des protéines intégrées spéciales intégrées dans la bicouche lipidique de la membrane cellulaire. En présence d’activateurs, les centres de ces protéines intégrées spéciales forment des pores hydrophiles hautement sélectifs, permettant aux ions d’une taille et d’une charge appropriées de passer à travers de manière passive1. Les canaux ioniques sont à la base de l’excitabilité cellulaire et de la bioélectricité et jouent un rôle clé dans une variété d’activités cellulaires2. Le cœur fournit du sang à d’autres organes par des contractions régulières résultant d’un processus couplé excitation-contraction initié par des potentiels d’action3. Des études antérieures ont confirmé que la génération de potentiels d’action dans les cardiomyocytes est causée par le changement de la concentration d’ions intracellulaires, et l’activation et l’inactivation des canaux ioniques Na+, Ca2+ et K+ dans les cardiomyocytes humains conduisent à la formation de potentiels d’action dans une certaine séquence 4,5,6. Les courants perturbés des canaux potassiques voltage-dépendants (Kv) (IKv) pourraient modifier le rythme cardiaque normal, entraînant des arythmies, qui sont l’une des principales causes de décès. Par conséquent, l’enregistrement de l’IKv est essentiel pour comprendre les mécanismes des médicaments pour traiter les arythmies potentiellement mortelles7.

Le canal Kv est un composant important du canal potassique. La fonction de coordination du canal Kv joue un rôle important dans l’activité électrique et la contractilité myocardique du cœur des mammifères 8,9,10. Dans les cardiomyocytes, l’amplitude et la durée des potentiels d’action dépendent de la co-conduction des courants K+ sortants par plusieurs sous-types de canaux Kv11. La régulation de la fonction du canal Kv est très importante pour la repolarisation normale du potentiel d’action cardiaque. Même le moindre changement de conductance Kv a un impact considérable sur la repolarisation cardiaque et augmente la possibilité d’arythmie12,13.

Représentant une méthode fondamentale dans la recherche électrophysiologique cellulaire, un joint à haute résistance entre une petite zone de la membrane cellulaire et une pointe de pipette pour l’enregistrement de patch-clamp à cellules entières peut être établi en appliquant une pression négative. La pression négative continue fait que la membrane cellulaire entre en contact avec l’embout de la pipette et colle à la paroi interne de la pipette. Le circuit électrique complet résultant permet d’enregistrer n’importe quel courant de canal ionique unique à travers la surface de la membrane cellulaire14. Cette technique a une très grande sensibilité pour le courant du canal ionique de la membrane cellulaire et peut être utilisée pour détecter des courants dans tous les canaux ioniques, et les applications sont extrêmement larges15. De plus, par rapport au marquage fluorescent et au marquage radioactif, le patch-clamp a une autorité et une précision plus élevées16. À l’heure actuelle, la technique de patch-clamp à cellules entières a été utilisée pour détecter les composants de la médecine traditionnelle chinoise agissant sur les courants du canal Kv17,18,19. Par exemple, Wang et al. ont utilisé la technique du patch-clamp à cellules entières et ont confirmé que le composant efficace de la graine de lotus pourrait atteindre l’inhibition du canal Kv4.3 en bloquant les canaux d’étatactivés 19. L’aconitine (AC) est l’un des ingrédients efficaces et actifs des espèces d’Aconitum, telles que Aconitum carmichaeli Debx et Aconitum pendulum Busch. De nombreuses études ont montré que les surdoses de CA peuvent provoquer des arythmies et même un arrêt cardiaque20. L’interaction entre l’AC et les canaux ioniques voltage-dépendants conduit à la perturbation de l’homéostasie ionique intracellulaire, qui est le mécanisme clé de la cardiotoxicité21. Par conséquent, dans cette étude, la technique de patch-clamp à cellules entières est utilisée pour déterminer les effets de l’AC sur le IKv des cardiomyocytes.

Protocole

Les cardiomyocytes H9c2 de rat obtenus commercialement (voir le tableau des matières) ont été incubés dans du DMEM contenant 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) inactivé par la chaleur et 1 % de pénicilline-streptomycine à 37 °C dans une atmosphère humidifiée à 5 % de CO2. La technique de patch-clamp à cellules entières a ensuite été utilisée pour détecter les changements dans IKv dans les cellules H9c2 normales et les cellules traitées 4-AP- ou AC (Figure 1 et Figure 2).

1. Préparation de la solution

  1. Préparer le milieu de culture cellulaire DMEM contenant 10 % de FBS et 1 % de pénicilline-streptomycine (voir le tableau des matières).
  2. Préparer une solution de 4-AP de 1,5 M en ajoutant 14,1165 mg de 4-AP à 100 μL de solution de DMSO (voir le tableau des matériaux). Diluer 1,5 M4-AP à 1,5 mM en ajoutant la solution extracellulaire (étape 1.5).
  3. Préparer 400 mM de courant alternatif en ajoutant 5 mg de courant alternatif à 19,36 μL de solution de DMSO (voir le tableau des matériaux).
    REMARQUE: Toutes les solutions ci-dessus ont été stockées dans un réfrigérateur à 4 ° C et la concentration finale du DMSO ne doit pas dépasser 0,1% (v / v).
  4. Préparer 50 mL de solution intracellulaire en ajoutant 0,4100 g de KCl (110,0 mM), 0,0120 g de MgCl2 (1,2 mM), 0,1270 g de Na2 ATP (5,0 mM), 0,1190 g de HEPES (10,0 mM) et 0,1900 g d’EGTA (10,0 mM) dans 50 mL d’eau bidistillée(voir le tableau 1 et le tableau des matières).
    NOTE: La valeur du pH de la solution intracellulaire a été ajustée à 7,2 en utilisant 1 M KOH et a été aliquote en petits volumes (1,5-2 mL) et stockée à -20 °C.
  5. Préparer 50 mL de solution extracellulaire en ajoutant 0,0185 g de KCl (5,0 mM), 0,3945 g de NaCl (135,0 mM), 0,0203 g de MgCl 2·6H2O (2,0 mM), 0,0595 g de HEPES (5,0 mM) et 0,0990 g de D-glucose (10,0 mM) dans 50 mL d’eau bidistillée (voir le tableau 1 et le tableau des matières).
    REMARQUE: La solution extracellulaire doit être préparée pour une utilisation immédiate et sa valeur de pH doit être ajustée à 7,4 en utilisant 1 M NaOH.

2. Culture cellulaire

  1. Une fois que la boîte de culture H9c2 devient confluente à 80%, digérer les cellules avec 0,25% de trypsine pendant 30 s.
  2. Culture de 2 x 10 5 cellules/mL avec un milieu normal ou contenant un médicament (25 μM, 50 μM, 100 μM et 200 μM AC) dans une boîte de 35 mm tapissée de plaques de verre pendant 24 h à 37 °C, avec une atmosphère de CO2 à5 % et une humidité relative de 70 % à 80 % (voir le tableau des matières).

3. Fabrication de micropipettes

  1. Allumez l’extracteur de micropipette (voir le tableau des matériaux) et préchauffez pendant 30 minutes.
  2. Placez un capillaire en verre borosilicaté avec un filament (OD: 1,5 mm, ID: 1,10 mm, 10 cm de longueur) sur l’extracteur de micropipette. Sélectionnez l’ensemble de programmes à l’étape 3.3 et cliquez sur Entrée dans le panneau de configuration. Cliquez sur le programme Rampe dans le coin supérieur droit pour déterminer la valeur « Chaleur » du capillaire en verre.
  3. Écrivez le programme pour tirer l’électrode selon la valeur déterminée par le test « Rampe » et utilisez les étapes suivantes: valeur « Heat » = valeur « Rampe », Pull = 0, Vel = vitesse de déplacement de la tige de traction, Temps = 200-250. Cliquez sur Pull pour commencer à fabriquer les pipettes.
    REMARQUE: Observez la couleur des dessiccants dans le récipient scellé de l’extracteur de micropipette avant de l’utiliser. Si la couleur passe du bleu au rose, les dessiccants doivent être remplacés. Pour éviter la contamination de l’embout de l’électrode, essayez de ne pas toucher la partie médiane du capillaire en verre pendant la préparation de la pipette. Ensuite, retirez soigneusement les pipettes produites et placez-les dans un récipient fermé et scellé.

4. Configuration de l’instrument

  1. Allumez les instruments correspondants dans l’ordre suivant : le convertisseur numérique-analogique, l’amplificateur de signal, le micromanipulateur, le microscope et la caméra (voir Tableau des matériaux).
  2. Ouvrez l’application d’imagerie, le logiciel d’amplificateur de signal et le logiciel d’acquisition de données en séquence (voir le tableau des matériaux).
    REMARQUE: L’instrument doit être allumé séquentiellement; sinon, l’état « Demo Digitizer » apparaîtra après l’ouverture du logiciel.

5. Réglage des paramètres IKv

  1. Modifiez le protocole d’enregistrement du IKv en suivant les étapes ci-dessous.
    1. Cliquez sur Modifier et sélectionnez Modifier le protocole dans le logiciel d’acquisition de données (voir Tableau des matériaux).
    2. Modifiez le programme dans l’interface « Forme d’onde »: Époque A (Premier niveau = −60 mV, Niveau Delta = 0 mV, Première durée = 20 ms et Durée Delta = 0 ms); Époque B (premier niveau = −40 mV, niveau Delta = 10 mV, première durée = 150 ms et durée Delta = 0 ms) et époque C (premier niveau = −60 mV, niveau Delta = 0 mV, première durée = 30 ms et durée delta = 0 ms).
    3. Ensuite, cliquez sur l’interface Mode/Rate et définissez les données « Trial Hierarchy »: Trial delay = 0 s, Runs = 1, Sweeps = 11 et Sweep duration = 0.22 s22,23.
      NOTE: Acquérir les courants du canal IKv en appliquant des pas de dépolarisation de 150 ms de −40 mV à +60 mV avec un incrément de 10 mV à un potentiel de maintien de −60 mV dans des conditions de contrôle. La durée totale du protocole doit être supérieure à la durée définie dans le programme « Waveform ».
  2. Modifier le programme de soustraction de fuite par réfection : cliquez sur Modifier le protocole pour sélectionner le bouton Stimulus , et définissez le programme de soustraction des fuites dans la boîte de dialogue Soustraction des fuites par réfection : nombre de balayages = 2-8 (4 dans cette étude), Temps de stabilisation = 100-1 000 ms (200 dans cette étude), « Polarité » = « Opposé à la forme d’onde », niveau de maintien = −80 mV.
    REMARQUE : La soustraction de fuite P / N doit avoir un niveau de maintien inférieur au « Premier maintien » (−60 mV).

6. Enregistrement patch-clamp à cellules entières de l’I Kv en mode pince de tension

  1. Établissez le chemin de stockage des données : cliquez sur Fichier et sélectionnez Définir les noms des fichiers de données dans le logiciel d’acquisition de données. Ouvrez le protocole IKv établi (étape 5.1) en sélectionnant Modifier et en cliquant sur Ouvrir le protocole dans le logiciel d’acquisition de données. Enfin, cliquez sur l’option Outils et sélectionnez Test de membrane pour commencer à exécuter le protocole.
  2. Ajouter la solution extracellulaire (étape 1.5) au bain cellulaire sur l’appareil de serrage patch-clamp à cellules entières (voir le tableau des matériaux) et placer la lame de couverture vers le haut avec les cellules H9c2 (cultivées à l’étape 2.1) dans le bain.
  3. Remplissez 30% de la pipette (fabriquée à l’étape 3) avec la solution extracellulaire et installez-la sur le porte-électrode d’enregistrement intégré dans l’appareil de serrage patch. Serrez la pipette avec le joint torique en caoutchouc et la rondelle en plastique. Ensuite, déposez la pipette dans le bain avec le micromanipulateur. Cliquez sur l’interface de décalage de la pipette du logiciel d’amplificateur de signal (voir Tableau des matériaux) pour maintenir la ligne de base du courant IKv à 0 pA.
    NOTE: La solution intracellulaire (étape 1.4) doit être en contact avec la partie AgCl/Ag du fil d’argent, et le fil d’argent ne doit pas être proche de la paroi interne de la pipette. La résistance de la pipette doit être de 2-6 MΩ. Pour éviter l’occlusion de l’embout de la pipette, une pression positive continue doit être délivrée à la pipette à l’aide d’une seringue de 1,0 mL reliée au porte-électrode d’enregistrement via un tube en plastique24.
  4. Délivrez manuellement une pression positive appropriée à l’aide d’une seringue de 1,0 mL connectée au porte-électrode d’enregistrement par un tube en plastique. Déplacez légèrement la pipette en manipulant le micromanipulateur en trois dimensions pour entrer en contact avec la cellule.
  5. Une fois que l’onde carrée de test de la membrane chute de 1/3 à 1/2 après que la pipette a touché la membrane cellulaire, retirez la pression positive et délivrez manuellement une pression négative appropriée. Cliquez ensuite sur l’interface Patch du logiciel d’acquisition de données pour former le sceau GΩ. Utilisez le logiciel d’amplificateur de signal « C p Fast » et « Cp Slow » pendant l’étanchéité des cellules pour compenser la capacité rapide et lente.
    REMARQUE: Lorsque l’essai sur membrane est ≥1 GΩ, une configuration fixée à la cellule se forme entre l’extrémité de la pipette et la cellule.
  6. Appliquez de brèves impulsions de pression négative pour rompre un patch de la membrane cellulaire.
    REMARQUE: Une réduction précipitée de la résistance de la membrane caractérise un modèle d’enregistrement de cellules entières réussi. Si la résistance d’accès (Ra) ≥30 MΩ, les cellules doivent être resélectionnées pour les étapes 6.3-6.6. Afin d’assurer l’exactitude des données IKv enregistrées, la pression négative doit être éliminée après la rupture de la membrane cellulaire.
  7. Exécutez la compensation capacitive de la membrane de cellule entière en cliquant sur le bouton Cellule entière du logiciel d’amplificateur de signal. Enfin, enregistrez et enregistrez les données en cliquant sur le bouton Enregistrement des données .
  8. Ouvrez les données IKv enregistrées avec le logiciel d’analyse de données. Enregistrez les relations courant-tension (I−V): cliquez sur Analyser pour sélectionner Statistiques pour effectuer les opérations suivantes: sélectionnez la plage comme Cousors 1,2 pour l’analyse des données; cliquez sur les boutons Amplitude de crête et Moyenne , puis cliquez sur OK pour afficher les données dans la page Résultats . Enfin, copiez la colonne des données moyennes IKv dans le logiciel de dessin de fonction (voir Tableau des matériaux) pour une analyse plus approfondie.
  9. Enregistrer les traces actuelles IKv représentatives : cliquez sur Modifier pour sélectionner Transférer les traces ; ensuite, sélectionnez la trace complète dans la région à transférer ; ensuite, cliquez sur Sélectionner dans Trace Selection, et sélectionnez IN 0 (pA) dans Signaux; enfin, cliquez sur OK pour afficher les données dans la page « Résultats », et copiez les données totales dans le logiciel de dessin de fonction pour dessiner les traces actuelles.
  10. Enregistrez le protocole IKv : cliquez sur Modifier pour sélectionner Créer un signal de forme d’onde de stimulus, puis sélectionnez OK. Ensuite, refaites l’étape 6.9 sauf pour sélectionner A0 # 0 (mA) dans « Signaux ».

Résultats

Ce protocole a permis l’enregistrement du IKv selon les paramètres définis dans la technique du patch-clamp à cellules entières. Le IKv a été déclenché par 150 ms de stimulus d’impulsion dépolarisant de −40 à +60 mV à un potentiel de maintien de −60 mV (Figure 3A). Le IKv des cardiomyocytes H9c2 du rat est d’abord apparu autour de -20 mV, puis l’amplitude a augmenté avec la dépolarisation. La relation moyenne entre le IKv e...

Discussion

La technique électrophysiologique patch-clamp est principalement utilisée pour enregistrer et refléter l’activité électrique et les caractéristiques fonctionnelles des canaux ioniques sur la membrane cellulaire25. À l’heure actuelle, les principales méthodes d’enregistrement de la technique patch-clamp comprennent l’enregistrement monocanal et l’enregistrement de cellules entières26. Pour le mode cellule entière, la microélectrode de verre et la pressio...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous apprécions le soutien financier de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (82130113) et du programme clé de R&D et de transformation du Département des sciences et de la technologie de la province du Qinghai (2020-SF-C33).

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
4-AminopyridineSigmaMKCJ2184
AconitineChengdu Lemetian Medical Technology Co., LtdDSTDW000602
AmplifierAxon InstrumentMultiClamp 700B
Analytical BalanceSartorius124S-CW
ATP Na2Solarbio416O022
Borosilicate glass with filament (O.D.: 1.5 mm, I.D.: 1.10 mm, 10 cm length) Sutter Instrument163225-5
Cell culture dish (100 mm)Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd1192022
Cell culture dish (35 mm)Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd3012022
Clampex softwareMolecular Devices, LLC.Version 10. 5
Clampfit softwareMolecular Devices, LLC.Version 10. 6. 0. 13data acqusition software
D-(+)-glucoseRhawnRH289133
Digital cameraHamamatsuC11440
DigitizerAxon InstrumentAxon digidata 1550B
DMSOBoster Biological Technology Co., LtdPYG0040
Dulbecco's modified eagle medium (1x)Gibco8121587
EGTABiofroxxEZ6789D115
Fetal bovine serumGibco2166090RP
Flaming/brown micropipette pullerSutter InstrumentModel P-1000
H9c2 cellsHunan Fenghui Biotechnology Co., LtdCL0111
HCImageLiveHamamatsu4.5.0.0
HClSichuan Xilong Scientific Co., Ltd2106081
HEPESXiya Chemical Technology (Shandong) Co., Ltd20210221
KClChengdu Colon Chemical Co., Ltd2020082501
KOHChengdu Colon Chemical Co., Ltd2020112601
MgCl2Tianjin Guangfu Fine Chemical Research Institute20160408
MgCl2·6H2OChengdu Colon Chemical Co., Ltd2021020101
MicromanipulatorSutter InstrumentMP-285A
MicroscopeOlympusIX73
Microscope cover glass (20 × 20 mm)Jiangsu Citotest Experimental Equipment Co. Ltd80340-0630
Milli-QChengdu Bioscience Technology Co., LtdMilli-Q IQ 7005
MultiClamp 700B commanderAxon InstrumentMultiClamp commander 2.0signal-amplifier software 
OriginPro 8 softwareOriginLab Corporationv8.0724(B724)
Penicillin-Streptomycin (100x)Boster Biological Technology Co., Ltd17C18B16
PH meter Mettler ToledoS201K
Phosphate buffered saline (1x)Gibco8120485
Trypsin 0.25% (1x)HyCloneJ210045

Références

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