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要約

本プロトコルは、全細胞パッチクランプ技術を使用して、H9c2心筋細胞における電位依存性カリウム(Kv)チャネル電流をリアルタイムかつ動的に取得するための効率的な方法を記載しています。

要約

心筋細胞膜上のカリウムチャネルは、細胞の電気生理学的活動の調節において重要な役割を果たす。主要なイオンチャネルの1つである電位依存性カリウム(Kv)チャネルは、薬物誘発性心筋損傷や心筋梗塞などのいくつかの深刻な心臓病と密接に関連しています。本研究では、全細胞パッチクランプ技術を使用して、H9c2心筋細胞のKvチャネル電流(IKv)に対する1.5 mM 4-アミノピリジン(4-AP、広域スペクトルカリウムチャネル阻害剤)およびアコニチン(AC、25 μM、50 μM、100 μM、および200 μM)の効果を決定しました。その結果、4-APはIKvを約54%阻害するが、ACのIKv阻害効果は用量依存的な傾向を示した(25μMでは効果なし、50μMでは30%の阻害率、100μMでは46%の阻害率、200μMでは54%の阻害率)を示した。本技術は、高感度・高精度という特性から、イオンチャネルを標的としたエスノメディシンの心毒性や薬理効果の探索を促進する。

概要

イオンチャネルは、細胞膜の脂質二重層に埋め込まれた特別な組み込みタンパク質です。活性化剤の存在下では、このような特殊な集積タンパク質の中心が選択性の高い親水性孔を形成し、適切なサイズと電荷のイオンが受動的な輸送様式で通過することを可能にします1。イオンチャネルは、細胞の興奮性と生体電気の基礎であり、さまざまな細胞活動において重要な役割を果たします2。心臓は、活動電位3によって開始される興奮収縮結合プロセスに起因する定期的な収縮を通じて他の臓器に血液を供給します。これまでの研究では、心筋細胞における活動電位の発生は細胞内イオン濃度の変化によって引き起こされ、ヒト心筋細胞におけるNa+、Ca2+、およびK+イオンチャネルの活性化および不活性化は、特定の配列で活動電位の形成につながることが確認されています4,5,6。電位依存性カリウム(Kv)チャネル電流(IKv)の乱れは、正常な心臓のリズムを変化させ、主要な死因の1つである不整脈を引き起こす可能性があります。したがって、IKvを記録することは、生命を脅かす不整脈を治療するための薬物のメカニズムを理解するために重要です7。

Kvチャネルはカリウムチャネルの重要な成分です。Kvチャネルの配位機能は、哺乳類の心臓の電気的活動および心筋収縮性において重要な役割を果たす8、9、10。心筋細胞では、活動電位の振幅と持続時間は、複数のKvチャネルサブタイプによる外向きのK+電流の共伝導に依存します11。Kvチャネル機能の調節は、心臓活動電位の正常な再分極にとって非常に重要です。Kvコンダクタンスのわずかな変化でさえ、心臓の再分極に大きな影響を与え、不整脈の可能性を高めます12,13。

細胞電気生理学的研究の基本的な方法である細胞膜の小さな領域と、全細胞パッチクランプ記録用のピペットチップとの間の高抵抗シールは、負圧を加えることによって確立することができる。連続的な負圧により、細胞膜がピペットチップに接触し、ピペットの内壁に付着します。結果として生じる完全な電気回路は、細胞膜14の表面を横切る任意の単一のイオンチャネル電流を記録することを可能にする。この技術は、細胞膜イオンチャネル電流に対して非常に高い感度を持ち、すべてのイオンチャネルの電流を検出するために使用でき、アプリケーションは非常に広いです15。さらに、蛍光標識や放射性標識と比較して、パッチクランプはより高い権威と精度を持っています16。現在、全細胞パッチクランプ技術は、Kvチャネル電流17,18,19に作用する伝統的な漢方薬成分を検出するために使用されています。例えば、Wangらは全細胞パッチクランプ技術を使用し、ハス種子の有効成分が活性化状態チャネル19を遮断することによってKv4.3チャネルの阻害を達成する可能性があることを確認した。アコニチン(AC)は、トリカブトカーミカエリデブックスやトリカブト振り子ブッシュなどのトリカブト種の効果的で有効成分の1つです。多くの研究は、ACの過剰摂取が不整脈や心停止さえ引き起こす可能性があることを示しています20。ACと電位依存性イオンチャネル間の相互作用は、心毒性の重要なメカニズムである細胞内イオン恒常性の破壊につながります21。したがって、この研究では、全細胞パッチクランプ技術を使用して、心筋細胞のIKvに対するACの影響を決定します。

プロトコル

市販のH9c2ラット心筋細胞( 材料の表を参照)を、10%熱不活化ウシ胎児血清(FBS)および1%ペニシリン-ストレプトマイシンを含むDMEM中で、5%CO2加湿雰囲気中で37°Cでインキュベートした。次に、全細胞パッチクランプ技術を使用して、正常なH9c2細胞および4-APまたはAC処理細胞におけるIKv の変化を検出しました(図1 および 図2)。

1. 溶液調製

  1. 10%FBSおよび1%ペニシリン-ストレプトマイシンを含むDMEM細胞培養培地を調製します(材料表を参照)。
  2. 100 μLのDMSO溶液に14.1165 mgの4-APを加えて、1.5 M 4-AP溶液を調製します( 材料の表を参照)。細胞外溶液を添加して1.5 M 4-APを1.5 mMに希釈する(ステップ1.5)。
  3. 19.36 μLのDMSO溶液に5 mgのACを加えて、400 mM ACを調製します(材料の表を参照)。
    注意: 上記の溶液はすべて4°Cの冷蔵庫に保管されており、DMSOの最終濃度は0.1%(v / v)を超えてはなりません。
  4. 50 mLの二重蒸留水に0.4100 gのKCl(110.0 mM)、0.0120 gのMgCl 2(1.2 mM)、0.1270 gのNa2 ATP(5.0 mM)、0.1190 gのHEPES(10.0 mM)、および0.1900 gのEGTA(10.0 mM)を加えて、50 mLの細胞内溶液を調製します(表1および材料表を参照)。
    注:細胞内溶液のpH値は、1 M KOHを使用して7.2に調整され、少量(1.5〜2 mL)に分注され、-20°Cで保存されました。
  5. 50 mLの二重蒸留水に0.0185 gのKCl(5.0 mM)、0.3945 gのNaCl(135.0 mM)、0.0203 gのMgCl 2·6H2O(2.0 mM)、0.0595 gのHEPES(5.0 mM)、および0.0990 gのD-グルコース(10.0 mM)を加えて、50 mLの細胞外溶液を調製します( 表1 および 材料表を参照)。
    注:細胞外溶液はすぐに使用できるように準備する必要があり、そのpH値は1 M NaOHを使用して7.4に調整する必要があります。

2. 細胞培養

  1. H9c2培養皿が80%コンフルエントになったら、細胞を0.25%トリプシンで30秒間消化します。
  2. 2 x 10 5細胞/mLを、ガラス板を敷いた35 mmディッシュで、ガラス板を敷いた35 mmディッシュで、5 %のCO2雰囲気と70%から80%の相対湿度で、通常の培地または薬物含有培地(25 μM、50 μM、100 μM、および200 μM AC)で培養します( 材料の表を参照)。

3. マイクロピペットの製作

  1. マイクロピペットプラーの電源を入れ( 材料の表を参照)、30分間予熱します。
  2. フィラメント付きのホウケイ酸ガラスキャピラリー(OD:1.5 mm、ID:1.10 mm、長さ10 cm)をマイクロピペットプーラーに置きます。手順3.3で設定したプログラムを選択し、コントロールパネルの Enter をクリックします。右上隅にある ランプ プログラムをクリックして、ガラスキャピラリーの「熱」値を決定します。
  3. 「ランプ」テストで決定された値に従って電極を引っ張るためのプログラムを作成し、次の手順を使用します:「熱」値=「ランプ」値、引っ張り= 0、Vel=引っ張りロッドの移動速度、時間= 200-250。 プル をクリックして、ピペットの製造を開始します。
    注意: 使用する前に、マイクロピペットプラーの密閉容器内の乾燥剤の色を観察してください。色が青からピンクに変わった場合は、乾燥剤を交換する必要があります。電極チップの汚染を防ぐために、ピペットの準備中はガラスキャピラリーの中央部分に触れないようにしてください。その後、作製したピペットを慎重に取り出し、密閉容器に入れます。

4. 機器のセットアップ

  1. 対応する機器の電源を、デジタル-アナログコンバーター、信号増幅器、マイクロマニピュレーター、顕微鏡、カメラの順にオンにします( 材料表を参照)。
  2. イメージングアプリケーション、信号増幅ソフトウェア、およびデータ集録ソフトウェアを順番に開きます(材料表を参照)。
    注意: 機器は順番にオンにする必要があります。それ以外の場合は、ソフトウェアを開いた後に「デモデジタイザ」状態が表示されます。

5. IKv パラメータ設定

  1. 以下の手順に従って、IKv を記録するためのプロトコルを編集します。
    1. [ 編集]をクリックし、データ収集ソフトウェアで [プロトコルの編集 ]を選択します( 材料表を参照)。
    2. 「波形」インターフェースでプログラムを編集します:エポックA(第1レベル= −60 mV、デルタレベル= 0 mV、第1持続時間 = 20 ミリ秒、デルタ持続時間 = 0 ミリ秒)。エポックB(第1レベル= −40 mV、デルタレベル= 10 mV、第1持続時間 = 150ミリ秒、デルタ持続時間 = 0ミリ秒)、およびエポックC(第1レベル= −60 mV、デルタレベル= 0 mV、第1持続時間 = 30ミリ秒、デルタ持続時間 = 0ミリ秒)。
    3. 次に、モード/レートインターフェイスをクリックし、「トライアル階層」データを設定します:トライアル遅延= 0秒、実行= 1、スイープ= 11、スイープ期間= 0.22秒22,23。
      注:制御条件下で−60mVの保持電位で−40mVから+60mVまで150msの脱分極ステップを10mV刻みで印加することにより、IKv チャネル電流を取得します。プロトコルの合計時間は、「波形」プログラムで設定された時間よりも長くする必要があります。
  2. P/Nリークサブトラクションプログラムの編集: プロトコルの編集 をクリックして 刺激 ボタンを選択し、 P/N リークサブトラクションダイアログボックスでリークサブトラクションプログラムを設定します:サブスイープの数= 2-8(この研究では4)、セトリング時間= 100-1,000ミリ秒(この研究では200)、 "極性" = "波形と反対"、保持レベル= -80 mV。
    注意: P / Nリーク減算の保持レベルは、「最初の保持」(-60mV)よりも低くする必要があります。

6.電圧クランプモードでのI Kv の全セルパッチクランプ記録

  1. データストレージパスを確立します: ファイルをクリックし、データ集録ソフトウェアで [データファイル名の設定 ]を選択します。確立されたIKv プロトコル(ステップ5.1)を開くには、[ 編集 ]を選択し、データ収集ソフトウェアの [プロトコルを開く ]をクリックします。最後に、[ ツール ]オプションをクリックし、[ メンブレンテスト ]を選択してプロトコルの実行を開始します。
  2. 細胞外溶液(ステップ1.5)を全細胞パッチクランプ装置( 材料表参照)の細胞浴に加え、H9c2細胞(ステップ2.1で培養)と一緒にカバーガラスを上向きに置きます。
  3. ステップ3で作製したピペットの30%を細胞外溶液で満たし、パッチクランプ装置に内蔵した記録電極ホルダーに取り付けます。Oリングゴム製ガスケットとプラスチックワッシャーでピペットを締めます。次に、マイクロマニピュレーターでピペットをバスに落とします。信号増幅器ソフトウェアの ピペットオフセット インターフェース( 材料表を参照)をクリックして、IKv 電流ベースラインを0pAに維持します。
    注:細胞内溶液(ステップ1.4)は、銀線のAgCl / Ag部分と接触している必要があり、銀線はピペットの内壁に近づいてはいけません。ピペットの抵抗は2〜6MΩである必要があります。ピペットチップの閉塞を避けるために、プラスチックチューブ24を介して記録電極ホルダーに接続された1.0mLシリンジを使用して、連続的な陽圧をピペットに送達しなければならない。
  4. プラスチックチューブを介して記録電極ホルダーに接続された1.0 mLシリンジを使用して、適切な陽圧を手動で供給します。マイクロマニピュレーターを3次元で操作してピペットを少し動かし、細胞に接触させます。
  5. ピペットが細胞膜に触れた後、膜試験の方形波が1/3から1/2低下したら、陽圧を取り除き、手動で適切な負圧を供給します。次に、データ収集ソフトウェアのパッチインターフェースをクリックして、GΩシールを形成します。セルのシーリング中に「C p Fast」および「Cp Slow」信号増幅器ソフトウェアを使用して、高速および低速の容量を補償します。
    注:メンブレンテストが≥1GΩの場合、ピペットチップとセルの間にセル結合構成が形成されます。
  6. 負圧の短いパルスを適用して、細胞膜のパッチを破裂させます。
    注:膜抵抗の急激な減少は、成功した全細胞記録パターンを特徴づけます。アクセス抵抗(Ra)が≥30MΩの場合、ステップ6.3〜6.6でセルを再選択する必要があります。記録されたIKv データの精度を確保するために、細胞膜が破壊された後に負圧を除去する必要があります。
  7. 信号増幅器ソフトウェアの Whole-Cell ボタンをクリックして、全細胞膜容量補償を実行します。最後に、[データ記録]ボタンをクリックしてデータを保存および 記録 します。
  8. 保存したIKvデータをデータ解析ソフトで開きます。電流と電圧(I−V)の関係を保存する:分析をクリックして統計を選択し、次のことを行います:データ分析のために範囲をCousors 1,2として選択します。[ピーク振幅]ボタンと[平均]ボタンをクリックし、[OK]をクリックして[結果]ページにデータを表示します。最後に、IKv平均データの列を関数描画ソフトウェア(材料表を参照)にコピーして、さらに分析します。
  9. 代表的なIKv現在のトレースを保存します:編集をクリックしてトレースの転送を選択します。次に、転送するリージョンで完全なトレースを選択します。次に、トレース選択で選択をクリックし、信号でIN 0(pA)を選択します。最後に、[OK]をクリックして[結果]ページにデータを表示し、合計データを関数描画ソフトウェアにコピーして現在のトレースを描画します。
  10. IKv プロトコルを保存します: 編集 をクリックして 刺激波形信号の作成を選択し、 OKを選択します。次に、「シグナル」で A0#0(mA) を選択した以外はステップ6.9をやり直す。

結果

このプロトコルにより、全細胞パッチクランプ技術で設定されたパラメータに従ってIKvを記録することができました。IKvは、−60mVの保持電位で−40〜+60mVの150msの脱分極パルス刺激によってトリガーされました(図3A)。H9c2ラット心筋細胞のIKvは、最初に約-20 mVで出現し、その後、振幅はさらなる脱分極とともに増加しました。なお、IKvと?...

ディスカッション

パッチクランプ電気生理学的技術は、主に、細胞膜25上のイオンチャネルの電気的活動および機能的特性を記録および反映するために使用される。現在、パッチクランプ技術の主な記録方法には、シングルチャネル記録と全セル記録26が含まれます。全セルモードの場合、ガラス微小電極および負圧を使用して、細胞膜の小さな領域とピペットチップ

開示事項

著者は開示するものは何もありません。

謝辞

中国国家自然科学基金会(82130113)および青海省科学技術部の主要研究開発および変革プログラム(2020-SF-C33)からの財政的支援に感謝します。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
4-AminopyridineSigmaMKCJ2184
AconitineChengdu Lemetian Medical Technology Co., LtdDSTDW000602
AmplifierAxon InstrumentMultiClamp 700B
Analytical BalanceSartorius124S-CW
ATP Na2Solarbio416O022
Borosilicate glass with filament (O.D.: 1.5 mm, I.D.: 1.10 mm, 10 cm length) Sutter Instrument163225-5
Cell culture dish (100 mm)Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd1192022
Cell culture dish (35 mm)Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd3012022
Clampex softwareMolecular Devices, LLC.Version 10. 5
Clampfit softwareMolecular Devices, LLC.Version 10. 6. 0. 13data acqusition software
D-(+)-glucoseRhawnRH289133
Digital cameraHamamatsuC11440
DigitizerAxon InstrumentAxon digidata 1550B
DMSOBoster Biological Technology Co., LtdPYG0040
Dulbecco's modified eagle medium (1x)Gibco8121587
EGTABiofroxxEZ6789D115
Fetal bovine serumGibco2166090RP
Flaming/brown micropipette pullerSutter InstrumentModel P-1000
H9c2 cellsHunan Fenghui Biotechnology Co., LtdCL0111
HCImageLiveHamamatsu4.5.0.0
HClSichuan Xilong Scientific Co., Ltd2106081
HEPESXiya Chemical Technology (Shandong) Co., Ltd20210221
KClChengdu Colon Chemical Co., Ltd2020082501
KOHChengdu Colon Chemical Co., Ltd2020112601
MgCl2Tianjin Guangfu Fine Chemical Research Institute20160408
MgCl2·6H2OChengdu Colon Chemical Co., Ltd2021020101
MicromanipulatorSutter InstrumentMP-285A
MicroscopeOlympusIX73
Microscope cover glass (20 × 20 mm)Jiangsu Citotest Experimental Equipment Co. Ltd80340-0630
Milli-QChengdu Bioscience Technology Co., LtdMilli-Q IQ 7005
MultiClamp 700B commanderAxon InstrumentMultiClamp commander 2.0signal-amplifier software 
OriginPro 8 softwareOriginLab Corporationv8.0724(B724)
Penicillin-Streptomycin (100x)Boster Biological Technology Co., Ltd17C18B16
PH meter Mettler ToledoS201K
Phosphate buffered saline (1x)Gibco8120485
Trypsin 0.25% (1x)HyCloneJ210045

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