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Method Article
* 이 저자들은 동등하게 기여했습니다
본 프로토콜은 전체 세포 패치 클램프 기술을 사용하여 H9c2 심근 세포에서 전압 게이트 칼륨 (Kv) 채널 전류의 실시간 및 동적 획득을위한 효율적인 방법을 설명합니다.
심근 세포막의 칼륨 채널은 세포 전기 생리 학적 활동의 조절에 중요한 역할을합니다. 주요 이온 채널 중 하나인 전압 게이트 칼륨(Kv) 채널은 약물로 인한 심근 손상 및 심근 경색과 같은 일부 심각한 심장 질환과 밀접한 관련이 있습니다. 본 연구에서, H9c2 심근 세포에서 Kv 채널 전류 (IKv)에 대한 1.5 mM 4- 아미노 피리딘 (4-AP, 광범위 칼륨 채널 억제제) 및 아코 니틴 (AC, 25 μM, 50 μM, 100 μM 및 200 μM)의 효과를 결정하기 위해 전체 세포 패치 클램프 기술을 사용하였다. 4-AP는 I Kv를 약 54% 억제한 반면, IKv에 대한 AC의 억제 효과는 용량 의존적 경향을 나타냄을 알 수 있었다(25μM에 대해서는 효과 없음, 50μM에 대해서는 30% 억제율, 100μM에 대해서는 46% 억제율 및 200μM에 대해서는 54% 억제율). 더 높은 감도와 정밀도의 특성으로 인해이 기술은 심장 독성 및 이온 채널을 표적으로 삼는 민족 의학의 약리학 적 효과에 대한 탐구를 촉진 할 것입니다.
이온 채널은 세포막의 지질 이중층에 내장 된 특수 통합 단백질입니다. 활성화제의 존재 하에서, 이러한 특수 통합 단백질의 중심은 고도로 선택적인 친수성 기공을 형성하여, 적절한 크기 및 전하의 이온이 수동수송 방식으로 통과하도록 한다1. 이온 채널은 세포 흥분성과 생체 전기의 기초이며 다양한세포 활동에서 중요한 역할을 합니다2. 심장은 활동 전위3에 의해 시작된 흥분-수축 결합 과정으로 인한 규칙적인 수축을 통해 다른 기관에 혈액을 공급합니다. 이전 연구에 따르면 심근 세포의 활동 전위 생성은 세포 내 이온 농도의 변화로 인해 발생하며 인간 심근 세포에서 Na +,Ca 2+ 및 K + 이온 채널의 활성화 및 비활성화는 특정 시퀀스 4,5,6에서 활동 전위의 형성으로 이어집니다. 교란된 전압 게이트 칼륨(Kv) 채널 전류(IKv)는 정상적인 심장 리듬을 변화시켜 주요 사망 원인 중 하나인 부정맥을 유발할 수 있습니다. 따라서 IKv를 기록하는 것은 생명을 위협하는 부정맥7을 치료하기위한 약물의 메커니즘을 이해하는 데 중요합니다.
Kv 채널은 칼륨 채널의 중요한 구성 요소입니다. Kv 채널의 배위 기능은 포유류 심장의 전기적 활동 및 심근 수축성에 중요한 역할을합니다 8,9,10. 심근 세포에서 활동 전위의 진폭과 지속 시간은 여러 Kv 채널 하위 유형11에 의한 외부 K + 전류의 공동 전도에 따라 달라집니다. Kv 채널 기능의 조절은 심장 활동 전위의 정상적인 재분극에 매우 중요합니다. Kv 전도도의 가장 작은 변화조차도 심장 재분극에 큰 영향을 미치고 부정맥12,13의 가능성을 증가시킵니다.
세포 전기생리학적 연구의 기본 방법을 나타내는 세포막의 작은 영역과 전체 세포 패치 클램프 기록을 위한 피펫 팁 사이의 고저항 밀봉은 음압을 적용하여 설정할 수 있습니다. 지속적인 음압은 세포막이 피펫 팁과 접촉하여 피펫의 내벽에 달라붙게 합니다. 결과적인 완전한 전기 회로는 세포막(14)의 표면을 가로지르는 임의의 단일 이온 채널 전류를 기록할 수 있게 한다. 이 기술은 세포막 이온 채널 전류에 대해 매우 높은 감도를 가지며 모든 이온 채널에서 전류를 감지하는 데 사용할 수 있으며 응용 분야는 매우 광범위합니다15. 또한, 형광 표지 및 방사성 표지와 비교하여, 패치 클램프는 더 높은 권위 및 정확도를 갖는다16. 현재 전체 셀 패치 클램프 기술은 Kv 채널 전류17,18,19에 작용하는 한의학 성분을 감지하는 데 사용되었습니다. 예를 들어, Wang 등은 전체 세포 패치 클램프 기술을 사용하여 연꽃 종자의 유효 성분이 활성화 된 상태 채널19를 차단함으로써 Kv4.3 채널의 억제를 달성 할 수 있음을 확인했습니다. Aconitine (AC)은 Aconitum carmichaeli Debx 및 Aconitum pendulum Busch와 같은 Aconitum 종의 효과적이고 활성 성분 중 하나입니다. 수많은 연구에 따르면 AC의 과다 복용은 부정맥과 심지어 심장 마비를 유발할 수 있습니다20. AC와 전압 게이트 이온 채널 사이의 상호 작용은 심장 독성21의 핵심 메커니즘 인 세포 내 이온 항상성의 파괴로 이어진다. 따라서이 연구에서는 전체 세포 패치 클램프 기술을 사용하여 심근 세포의 IKv에 대한 AC의 효과를 결정합니다.
상업적으로 입수한 H9c2 래트 심근세포( 재료 표 참조)를 5%CO2 가습 분위기에서 37°C에서 10% 열불활성화된 태아 소 혈청(FBS) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신을 함유하는 DMEM 중에서 인큐베이션하였다. 그런 다음 전체 세포 패치 클램프 기술을 사용하여 정상 H9c2 세포 및 4-AP- 또는 AC 처리 세포에서 IKb 의 변화를 감지했습니다 (그림 1 및 그림 2).
1. 용액 준비
2. 세포 배양
3. 마이크로 피펫 제작
4. 기기 설정
5. IKv 파라미터 설정
6. 전압 클램프 모드에서 I Kv 의 전체 셀 패치 클램프 기록
이 프로토콜은 전체 세포 패치 클램프 기술에서 설정된 파라미터에 따라 IKv의 기록을 허용했습니다. IKv는 -60 mV의 유지 전위에서 -40에서 +60 mV까지 150ms의 탈분극 펄스 자극에 의해 트리거되었습니다(그림 3A). H9c2 쥐 심근 세포의 IKv는 처음에는 -20 mV 부근에서 나타 났으며, 그 후 진폭은 추가 탈분극으로 증가했다. IKv와 막 전위 사이의 평균 관?...
패치-클램프 전기생리학적 기술은 주로 세포막(25) 상의 이온 채널의 전기적 활성 및 기능적 특성을 기록하고 반영하는데 사용된다. 현재, 패치 클램프 기술의 주요 기록 방법은 단일 채널 기록 및 전체 셀 기록(26)을 포함한다. 전체 셀 모드의 경우, 유리 미세전극 및 음압은 세포막의 작은 영역과 피펫 팁(27) 사이에 고저항 밀봉을 형성하는데 ?...
저자는 공개 할 것이 없습니다.
중국 국립 자연 과학 재단 (82130113)과 칭하이 성 과학 기술부 (2020-SF-C33)의 핵심 R & D 및 혁신 프로그램의 재정 지원에 감사드립니다.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
4-Aminopyridine | Sigma | MKCJ2184 | |
Aconitine | Chengdu Lemetian Medical Technology Co., Ltd | DSTDW000602 | |
Amplifier | Axon Instrument | MultiClamp 700B | |
Analytical Balance | Sartorius | 124S-CW | |
ATP Na2 | Solarbio | 416O022 | |
Borosilicate glass with filament (O.D.: 1.5 mm, I.D.: 1.10 mm, 10 cm length) | Sutter Instrument | 163225-5 | |
Cell culture dish (100 mm) | Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd | 1192022 | |
Cell culture dish (35 mm) | Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd | 3012022 | |
Clampex software | Molecular Devices, LLC. | Version 10. 5 | |
Clampfit software | Molecular Devices, LLC. | Version 10. 6. 0. 13 | data acqusition software |
D-(+)-glucose | Rhawn | RH289133 | |
Digital camera | Hamamatsu | C11440 | |
Digitizer | Axon Instrument | Axon digidata 1550B | |
DMSO | Boster Biological Technology Co., Ltd | PYG0040 | |
Dulbecco's modified eagle medium (1x) | Gibco | 8121587 | |
EGTA | Biofroxx | EZ6789D115 | |
Fetal bovine serum | Gibco | 2166090RP | |
Flaming/brown micropipette puller | Sutter Instrument | Model P-1000 | |
H9c2 cells | Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd | CL0111 | |
HCImageLive | Hamamatsu | 4.5.0.0 | |
HCl | Sichuan Xilong Scientific Co., Ltd | 2106081 | |
HEPES | Xiya Chemical Technology (Shandong) Co., Ltd | 20210221 | |
KCl | Chengdu Colon Chemical Co., Ltd | 2020082501 | |
KOH | Chengdu Colon Chemical Co., Ltd | 2020112601 | |
MgCl2 | Tianjin Guangfu Fine Chemical Research Institute | 20160408 | |
MgCl2·6H2O | Chengdu Colon Chemical Co., Ltd | 2021020101 | |
Micromanipulator | Sutter Instrument | MP-285A | |
Microscope | Olympus | IX73 | |
Microscope cover glass (20 × 20 mm) | Jiangsu Citotest Experimental Equipment Co. Ltd | 80340-0630 | |
Milli-Q | Chengdu Bioscience Technology Co., Ltd | Milli-Q IQ 7005 | |
MultiClamp 700B commander | Axon Instrument | MultiClamp commander 2.0 | signal-amplifier software |
OriginPro 8 software | OriginLab Corporation | v8.0724(B724) | |
Penicillin-Streptomycin (100x) | Boster Biological Technology Co., Ltd | 17C18B16 | |
PH meter | Mettler Toledo | S201K | |
Phosphate buffered saline (1x) | Gibco | 8120485 | |
Trypsin 0.25% (1x) | HyClone | J210045 |
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