הדמיה של אברונים באתרם על ידי טומוגרפיה Cryo-STEM

Summary

טומוגרפיה Cryo-STEM מספקת אמצעי לדמיין אברונים של תאים שלמים ללא הטבעה, חתך או תכשירים פולשניים אחרים. הרזולוציה התלת-ממדית המתקבלת נמצאת כיום בטווח של ננומטרים בודדים, עם שדה ראייה של מספר מיקרומטרים ועובי נגיש בסדר גודל של 1 מיקרומטר.

Abstract

מיקרוסקופ אלקטרונים קריוגני (cryo-EM) מסתמך על הדמיה של דגימות ביולוגיות או אורגניות המשובצות בתווך המימי הטבעי שלהן; מים מתמצקים לכוס (כלומר, מזוגגים) ללא התגבשות. שיטת cryo-EM נמצאת בשימוש נרחב כדי לקבוע את המבנה של מקרומולקולות ביולוגיות לאחרונה ברזולוציה כמעט אטומית. הגישה הורחבה לחקר אברונים ותאים באמצעות טומוגרפיה, אך המצב הקונבנציונלי של הדמיית EM בשידור שדה רחב סובל ממגבלה חמורה בעובי הדגימה. זה הוביל לנוהג של כרסום lamellae דק באמצעות קרן יונים ממוקדת; הרזולוציה הגבוהה מתקבלת על ידי ממוצע סובטומוגרפיה מהשחזורים, אך יחסים תלת מימדיים מחוץ לשכבה הנותרת אובדים. ניתן לעקוף את מגבלת העובי על ידי הדמיית בדיקה סרוקה, בדומה ל- EM סורק או מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי. בעוד שסריקת מיקרוסקופ אלקטרונים (STEM) במדעי החומרים מספקת רזולוציה אטומית בתמונות בודדות, הרגישות של דגימות ביולוגיות קריוגניות לקרינת אלקטרונים דורשת שיקולים מיוחדים. פרוטוקול זה מציג הגדרה עבור קריו-טומוגרפיה באמצעות STEM. התצורה האקטואלית הבסיסית של המיקרוסקופ מתוארת עבור מערכות שניים ושלושה מעבים, בעוד אוטומציה מסופקת על ידי תוכנת SerialEM הלא מסחרית. מתוארים גם שיפורים ברכישת אצווה ויישור מתאם למפות פלואורסצנטיות שנרכשו בעבר. לדוגמה, אנו מראים שחזור של מיטוכונדריה, ומצביעים על גרגרי הממברנה הפנימית והחיצונית ועל גרגרי סידן פוספט, כמו גם על מיקרוטובולים, חוטי אקטין וריבוזומים שמסביב. טומוגרפיית Cryo-STEM מצטיינת בחשיפת התיאטרון של אברונים בציטופלסמה, ובמקרים מסוימים, אפילו את הפריפריה הגרעינית של תאים דבקים בתרבית.

Introduction

הדמיה תלת-ממדית (תלת-ממדית) של אברונים היא משימה חשובה ביותר בביולוגיה המודרנית של התא. בהתחשב בקשקשים המעורבים, החל מעשרות ננומטרים עבור שלפוחיות הפרשה ועד מיקרונים רבים עבור גרעין התא, מאתגר למצוא טכניקת מיקרוסקופיה אחת שתתאים לכל היישומים. בעוד שמיקרוסקופ פלואורסצנטי מודרני יכול להקיף את רוב הטווח במונחים של רזולוציה, רק המולקולות המסומנות מופיעות. התיאטרון הסלולרי נותר תחום מיקרוסקופ האלקטרונים. שיטות קונבנציונליות של קיבוע כימי, הטבעה פלסטיק, צביעה עם מתכות כבדות הם פולשניים מאוד, ולכן התוצאות עשויות להיות תלויות בפרטים של הכנת הדגימה. Cryo-EM, לעומת זאת, מוגבל על ידי הצורך לזגוג את התווך המימי; גבישי קרח הנוצרים מפזרים את תאורת האלקטרונים, וגורמים לתוצרי ניגוד בעלי ניגודיות גבוהה יותר מהחומר האורגני המעניין.

בעשור האחרון חלה התפשטות של טכניקות הדמיה אלקטרומגנטית שפותחו או הותאמו למחקרים תאיים¹. הקפאה בלחץ גבוה בשילוב עם כרסום קרן יונים ממוקדת איטרטיבית (FIB) והדמיית פני שטח טורית באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (כלומר, FIB-SEM) היא כיום השיטה המועדפת עבור דגימות גדולות². טומוגרפיית רנטגן רכה קריוגנית (cryo-SXT) מתאימה לדגימות בגודל של מספר מיקרונים, המוגבלות על ידי אורך הספיגה האופייני של קרני הרנטגן הרכות במים ^3,4,5. סולם זה כולל סוגי תאים שלמים רבים, והאופי הכמותי של ניגודיות בליעת קרני רנטגן מוסיף היבט של מדידת ריכוז⁶ או ספקטרוסקופיה⁷. בשילוב עם ממוצע תת-טומוגרפיה, טומוגרפיית אלקטרונים בשידור קריו-שידור (cryo-ET), המבוססת על מיקרוסקופ אלקטרונים להעברת ניגודיות פאזה (TEM), מציעה את הרזולוציה הגבוהה ביותר עבור מקרומולקולות או קומפלקסים 8,9,10. עם זאת, נדיר שאברונים שלמים הם כל כך סדירים שניתן לחשב אותם בשלמותם. יתר על כן, המצב המקובל של TEM רחב שדה מוגבל לעובי הדגימה לכמה מאות ננומטרים על ידי שילוב של פיזור קשיח (הכרוך באיבוד אנרגיה) בדגימה וסטייה כרומטית בעדשת האובייקט המגנטי^11,12. פיזור האנרגיה הגדול מכתיב את השימוש במסנן אנרגיה כדי להסיר את האובך החריג מהמיקוד שנוצר, אך הדגימה הרגישה עדיין סובלת מנזקי קרינה בעוד שאות התמונה נחלש אקספוננציאלית עם עובי הולך וגדל.

מצב ההדמיה החלופי, סריקת EM (STEM), עוקף את הצורך בסינון אנרגיה ושומר על האלקטרונים המפוזרים באופן בלתי אלסטי ליצירת תמונה, אם כי כיום ברזולוציה נמוכה יותר מאשר בטומוגרפיית TEM (איור 1). למעשה, לא נוצרת תמונה אמיתית. במקום זאת, כמו בסריקת EM, המדידות נעשות נקודה אחר נקודה, והתמונה מורכבת על ידי המחשב. ההגדלה נקבעת רק לפי גודל שלבי הסריקה מבלי לשנות את זרמי העדשה. כאשר הוא מוגדר כראוי, הטווח השימושי של עובי הדגימה עבור טומוגרפיה cryo-STEM (CSTET) יכול להגיע ל -1.5 או אפילו 2 מיקרומטר, אם כי אזור הנוחות, שבו עוצמת האות השימושית נשארת חלק משמעותי של התאורה, הוא סביב 600-900 ננומטר^11,13. זה מספיק כדי לראות חלק גדול של הציטופלסמה, ולפעמים קצה של גרעין התא. בפועל, אנו מוצאים כי ויטריפיקציה בשיטה הסטנדרטית של צלילה לתוך נוזל קריוגני מטילה מגבלה חמורה יותר על עובי מאשר הדמיית STEM. מטרת מאמר וידאו זה היא להקל על שילוב CSTET בתיבת הכלים להדמיית תאים ואברונים במעבדות מחקר ומתקני מיקרוסקופיה.

האתגר הראשון הוא שפעולות מיקרוסקופ ב- CSTET עדיין אינן סטנדרטיות ליישומי מדעי החיים כפי שהיו עבור טומוגרפיית cryo-ZEM. חומרת STEM כמעט ולא (אם בכלל) הייתה ממוקדת לשוק ה-cryo-EM. עם זאת, זה משתנה עם הדור החדש ביותר של מיקרוסקופים, וכלים קיימים רבים ניתן לשדרג. STEM כטכניקה המריא והשתלט במידה רבה במדעי החומרים, שם יש גם ניצני עניין בשיטות קריוגניות ובמינון נמוך^14,15. ספרות מדעי החומרים משופעת בראשי תיבות BF-STEM, ADF-STEM, HAADF-STEM, 4D-STEM, DPC-STEM וכו ', המוסיפים לבלבול. אנו מציעים כאן נקודת התחלה מומלצת, אשר, מניסיוננו הקולקטיבי במכון ויצמן למדע, מספקת את הפרוטוקול הכללי ביותר לתוצאות שימושיות המבוססות על הדמיית STEM בשדה בהיר (BF)¹⁶. בשום אופן זה לא ממצה או אפילו לחקור את מגוון האפשרויות, אבל זה ישמש בסיס לשיפורים נוספים. בעוד אנו מדגישים cryo-STEM, רוב הפרוטוקול רלוונטי באותה מידה עבור טומוגרפיית STEM בטמפרטורת החדר של חלקים משובצים פלסטיק.

המהות של STEM היא לסרוק את הדגימה עם גשושית אלקטרונים ממוקדת (איור 1), חרוט ההארה, ולהקליט אותות ממישור העקיפה (פיזור) בשידור, פיקסל אחר פיקסל, כדי להפיק תמונות דו-ממדיות^17,18. דגימות אמורפיות, כולל רוב החומרים התאיים, ייצרו דפוס פיזור מפוזר בשידור. תצורת STEM המעשית הפשוטה ביותר היא להציב גלאי מעגלי כדי להקליט את הדיסק המרכזי (כלומר, תאורת הגשושית שתועבר ללא דגימה). הדגימה מפזרת אלקטרונים הרחק מחרוט ההארה הזה עד כדי כך שהאות פוחת. זה מייצר תמונת BF - הדגימה נראית כהה על רקע בהיר. גלאי טבעתי עשוי לשמש גם (או לחילופין) כדי לזהות את הפיזור מהדגימה מחוץ לחרוט התאורה. עם הסרת הדגימה, אין אות. כשדגימה נמצאת במקומה, עצמים נראים בהירים על רקע כהה בתמונת השדה הכהה (DF). המינוח ל-STEM (BF, שדה כהה טבעתי [ADF], שדה כהה טבעתי בזווית גבוהה [HAADF] וכו') מתייחס בעיקר לטווחי זוויות האיסוף של הגלאים.

זווית ההתכנסות של התאורה מייצגת התאמה חיונית של STEM לטומוגרפיה תאית. כאשר העדיפות העליונה היא רזולוציה גבוהה, זווית ההתכנסות צריכה להיות גדולה ככל האפשר. (הדבר דומה למיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי; הרזולוציה נקבעת על ידי קוטר הגשושית, אשר משתנה כאורך הגל חלקי הצמצם המספרי. שים לב שאנו מתייחסים לזווית חצי זווית או חצי התכנסות עבור EM.) כאשר העדיפות היא עומק השדה, לעומת זאת, פשרה ברזולוציה מעניקה יתרון גדול, שכן הקרן הממוקדת נשארת מקבילה בערך למרחק השווה לכפול מאורך הגל חלקי חצי זווית בריבוע. באופן אידיאלי, נפח התא כולו נשאר בפוקוס¹⁹. לדוגמה, ב-300 keV, אורך הגל של האלקטרון דה-ברויי הוא 0.002 ננומטר, כך שהתכנסות של 1 mrad מניבה רזולוציה של 2 ננומטר ועומק שדה של 4 מיקרון. בתנאים אלה, טומוגרפיה יכולה להתבצע גם מבלי להתמקד בתהליך איסוף הנתונים, אלא רק פעם אחת בתחילת הרכישה. STEM קונבנציונלי בעל יכולת טומוגרפיה יכול להגיע לזווית התכנסות למחצה של 7 או 8 mrad; לכן, באופן עקרוני, אנחנו יכולים להגיע לרזולוציה בסדר גודל של 0.25 ננומטר, אבל אז עם עומק מוקד של רק 62 ננומטר. זה בבירור דק מדי עבור הדמיה תאית. מיקרוסקופים מתקדמים יותר עם שלוש עדשות מעבה מציעים התאמה רציפה של זווית ההתכנסות למחצה על פני טווח ניכר. בתצורה המסורתית יותר של שני מעבים, ההתכנסות קבועה באופן דיסקרטי על ידי צמצם המעבה (C2).

עבור דגימות חזקות המשובצות בפלסטיק, ניתן להקליט סדרת מוקדים בכל הטיה ולשלב אותן לקבלת רזולוציה גבוהה²⁰, אך עבור דגימות קריוגניות, תקציב הקרינה מוגבל מדי. לבסוף, בשקלול היתרונות של הדמיית BF או DF, עבור דגימות עבות, יש לקחת בחשבון את ההשפעות של פיזור אלסטי מרובה בדגימה. אות BF פחות פגום על ידי פיזור מרובה ומראה רזולוציה גבוהה יותר עבור דגימות עבות ^16,21.

כלל אצבע שימושי היה לקבוע זוויות איסוף גדולות פי כמה מההתכנסות. ככל שהדגימה עבה יותר, כך דיסק האיסוף צריך להיות גדול יותר. דיסק קטן מדי יספק עוצמת אות נמוכה; דיסק גדול מדי יגרום לניגודיות תמונה גרועה, מכיוון שרק הפיזור בזווית הגבוהה ביותר יתרום. זוויות האיסוף צריכות להיות מותאמות למדגם נתון. זוויות הגלאי כפונקציה של אורך המצלמה (עקיפה) חייבות להיות מכוילות באופן עצמאי. הם עשויים להיות מוצגים בנוחות על ידי תוכנת המיקרוסקופ. בפועל, פקטור של שניים עד חמישה ביחס בין האוסף לחצאי זוויות הארה, θ עד α, בהתאמה (איור 1), הוא נקודת מוצא מומלצת עבור CSTET של דגימות תאיות.

הפרוטוקול הבא מתאר פעולת טומוגרפיה STEM באמצעות תוכנת SerialEM הפופולרית לבקרת מיקרוסקופ^22,23. SerialEM אינו קשור ליצרן מסוים, והוא נמצא בשימוש נרחב בטומוגרפיה TEM. רוב הפעולות בהגדרת טומוגרפיה ניתן לבצע ישירות מ TEM. אסטרטגיית SerialEM היא למדל את מערכת הסריקה כמצלמה. זה מאפשר את ההצלבה הפשוטה מ-TEM ל-STEM. יש לזכור, עם זאת, כי פרמטרים כגון הגדלה וכריכה הם מלאכותיים לחלוטין. הפרמטרים החשובים הם שדה הראייה במיקרונים, מספר הפיקסלים בשדה הראייה וזמן החשיפה. מרווח הפיקסלים, או הדגימה, הוא השדה הליניארי חלקי מספר הפיקסלים, ואילו זמן השהייה הוא מספר הפיקסלים חלקי זמן החשיפה.

התצורה המינימלית עבור STEM ו- CSTET כוללת שלוש תכונות במיקרוסקופ: מחולל סריקה, גלאי STEM ותוכנת בקרת טומוגרפיה. הפרוטוקול מתייחס למינוח של FEI/Thermo Fisher Scientific (TFS), אך המושגים הם גנריים. התוכנה הקניינית של TFS תוארה ב- JoVE עבור TEM²⁴, ופעולת STEM דומה מאוד.

אנו מניחים כי המיקרוסקופ יושר מראש על ידי צוות השירות או הצוות המנוסה וכי ניתן לקרוא ליישור עמודות על ידי טעינת קובץ. התאמות קלות נקראות יישור ישיר וניתן לאחסן אותן במה שמכונה אוגרי FEG (מיקרוסקופים TFS). יישור ישיר כולל מרכז סיבוב, נקודות ציר, יישור עקיפה ופיצוי על אסטיגמציה של מעבה. יש לבצע התאמות באופן איטרטיבי. שים לב שמיקרוסקופ TFS מיישם מצבי ננו-פרוב (nP) ומיקרו-פרוב (μP) נפרדים; עבור צמצם מעבה נתון, אלה מספקים שדה ראייה צר או רחב יחסית עם תאורה מקבילה ב- TEM וקרן אלקטרונים מתכנסת פחות או יותר (ממוקדת היטב) ב- STEM, בהתאמה. יצרנים אחרים משתמשים בתוכניות שונות כדי לכסות את טווח זוויות ההתכנסות.

לפני שמתחילים, יש לבחור את שדה הראייה, L, ואת הדגימה (רוחב פיקסל), l, בהתאם למדגם הנחקר. לדוגמה, עבור l = 1 ננומטר/פיקסל, יש לבחור תמונה בגודל 4,000 x 4,000 פיקסלים שתכסה שדה ראייה בגודל 4 מיקרומטר² . הרזולוציה תהיה, במקרה הטוב, כפולה מהדגימה המרחבית, כך ש-2 ננומטר, וקוטר הגשושית, d, אמור להתאים לכך. כיול זווית הבדיקה הוא מעבר לטווח של פרוטוקול זה, ולכן אנו מניחים כי טבלה או קריאת מסך זמין. קוטר הגשושית הוא בערך אורך גל האלקטרונים חלקי זווית ההתכנסות למחצה (ברדיאנים): d = λ/θ. אורך הגל, λ, הוא 0.002 ננומטר עבור 300 keV ו-0.0025 ננומטר עבור 200 keV אלקטרונים, כך θ של 1 mrad יספק קוטר נקודתי של 2 או 2.5 ננומטר, בהתאמה.

הפרוטוקול מוצג בתהליך של מורכבות הולכת וגוברת. המשימה הראשונה היא לייצר תמונת STEM, התלויה בתוכנת יצרן המיקרוסקופ, ולאחר מכן סדרת הטיה, שעבורה אנו משתמשים ב- SerialEM. קוראים רבים ללא ספק יכירו את SerialEM, ולכן המשימות המסובכות יותר יבואו באופן טבעי. אין צורך לעקוב אחר הנהלים בקפדנות. פיתוחים הקשורים לאוטומציה עשויים להיות מיושמים ישירות עבור STEM כמו גם עבור TEM. סביר להניח שמשתמשים מנוסים יהפכו את הפרוטוקול, החל מרישום מתאם של מפות פלואורסצנטיות והמשך בהגדרת טומוגרפיית אצווה. פרטים נוספים ניתן למצוא בספריות התיעוד וההדרכה הנרחבות עבור SerialEM עצמה, כולל מאמר שפורסם לאחרונה ב- JoVE על ההתפתחויות האחרונות באוטומציה²⁵.

Protocol

1. הגדרת STEM

1. יישור ראשוני: טען את קובץ יישור העמודות ולאחר מכן פתח את שסתומי עמודה. אם אתה משתמש במחזיק קריו-כניסה צדדי, פתח את Cryo-shield. התחל במצב TEM. הקרן אמורה להופיע על המסך. אם לא, הנמיכו את ההגדלה.
2. הביאו את המיקרוסקופ למיקוד אאוצנטרי על ידי לחיצה על הכפתור בלוח הבקרה.
3. הגדר את גודל הספוט לערך נוח (לדוגמה, 6) להמחשת המסך הפלואורסצנטי, ישירות או באמצעות המצלמה המובנית (בהתאם לדגם המיקרוסקופ).
4. הגדר את המיקרוסקופ למצב STEM וודא שהמיקוד משתמש בעדשות המעבה (עוצמה) ולא במטרה. הגדר מיקוד אאוצנטרי. לאחר מכן, צא ממצב עקיפה לצורך התאמות ראשוניות.
5. ודא שהקרן אינה ריקה. הקטן את ההגדלה עד להופעת הקרן על המסך. כוונן את הסטת הקרן למרכז והגדל את ההגדלה במדרגות עד כ 70kx תוך שמירה על הקרן במרכז.
6. הכנס את מפתח הצמצם הרצוי, בדרך כלל 50 מיקרומטר. בדוק את מרכוז הצמצם. כאשר מסובבים את ידית המיקוד מעט קדימה ואחורה, הכתם אמור להתרחב ולהתכווץ אך להישאר במקומו, כאילו מטוס חותך שעון חול אנכי דמיוני. אם הצמצם אינו ממורכז, התאורה תזוז לרוחב, כאילו שעון החול מוטה.
7. הבא את האלומה למיקוד ולחץ על מיקוד רשימת עוצמה (אם זמין) בכרטיסיה יישור, או חזור למיקוד אאוצנטרי כמו ב- 1.2. כוונן מחדש את מיקום הקרן למרכז.
8. התאם את מרכז הסיבוב. סובב את גלגל צעדי המיקוד למינימום או צעד אחד מעל, כך שהקרן פועמת בעדינות, וודא שהיא נשארת נייחת כאשר המיקוד נע למעלה ולמטה.
9. בחר את נקודות הציר ושלב את שתי הנקודות באמצעות התאמות X ו- Y.
   הערה: אם לוח פאזה מותקן במכשיר TFS, יש להשתמש רק בכוונון X.
10. מקדו מעט את האלומה, וכווננו את הסטיגמטורים של המעבה כדי להפוך את הדיסק לעגול. לעלות ולרדת באמצעות מיקוד כדי לייעל; לא צריכה להיות נטייה להתארך בכיוון זה או אחר בעת העברת מיקוד.
11. נרמלו את העדשות. לאחר מכן, הגדל את ההגדלה בהדרגה לכ- 240kx תוך שימוש בהסטת הקרן כדי לשמור על המקום ממורכז, וחזור על התאמות מרכז הסיבוב ונקודת הציר (שלבים 1.6-1.8).
12. חזור למצב עקיפה. הקרן צריכה להופיע כדיסק אחיד על מסך הפלואורסצנט. אורך המצלמה (CL) שולט כעת ביעילות על המרחק האופטי לגלאי, כמו בקריסטלוגרפיה של קרני רנטגן. שנו אותו וצפו כיצד הדיסק מתכווץ ומתרחב, כאילו מיקום המסך ינוע לכיוון הדגימה או מתרחק ממנה. חרוט זה מייצג את תאורת BF.
    הערה: עבור כל CL, יש להתאים את יישור העקיפה על מנת להביא את הקרן המוקרנת לציר המרכזי. בדרך כלל אין צורך לעדן את כולם, אלא רק את האחד (או כמה) שישמשו לזיהוי.
13. הפעל מצב STEM בהגדלה גבוהה.
    1. אם גלאי BF STEM זמין, התחל עם זה. הביאו את הבמה לאזור עם חור ריק והתאימו את יישור העקיפה למרכז הקרן באמצעות CL הרצוי.
    2. מיקרוסקופים רבים מצוידים רק בגלאי HAADF; יש טריק להשתמש בזה כגלאי BF. ראשית, משכו את הגלאי, מרכזו את הקרן כנ"ל ביישור הישיר, הכניסו צמצם אובייקטיבי, בדרך כלל קטן כגון 20 מיקרומטר, וכוונו את מיקומו כך שיקיף את הקרן באופן אחיד. (הדרך הקלה ביותר לעשות זאת היא על ידי הכנסת דגימה או רשת בדיקה כדי לראות הילה סביב התאורה). לאחר מכן, השתמש ביישור העקיפה כדי להזיז את הקרן מציר אל אזור הגלאי. הכנס ושלוף את הגלאי תוך כדי צפייה באלומה על המסך על מנת לוודא שהקרן חסומה על ידי הגלאי.
    3. התחל סריקה בתוכנת המיקרוסקופ וכוונן את הגדרות הבהירות והניגודיות (B/C) כך שהאות יהיה קרוב ל-0 כאשר הקרן ריקה, וקרוב לרוויה כאשר התאורה המלאה נופלת על הגלאי. השתמש בתצוגת הטווח כדי לסייע. ההגדרות עשויות להיות מצומדות בדרכים בלתי צפויות, ולכן יש לחזור על ההתאמה מספר פעמים.
14. החזר את המיקרוסקופ להגדלה נמוכה יחסית באוגר ההגדלה הגבוהה (מצב SA), מבלי להיכנס למצב מאג נמוך (LM).
15. שים לב לעיון המסך הנוכחי מאוחר יותר (ראה שלב 3.1.1). ניתן לשנות את הזרם באמצעות עדשת האקדח והגדרות גודל הספוט, כמו ב- TEM, עם מספרים הולכים וגדלים המתאימים לזרם מופחת.
16. בשלב זה, שמור אוגר FEG כדי להקל על החזרה לערכים סטנדרטיים.
    הערה: המתקן יכול להכין ערכת ברירת מחדל של אוגרי FEG כך שמשתמשים יוכלו להתחיל מתצורת עבודה.

2. הצבת הדגימה

1. במצב LM TEM, ודא שהרשת אינה אטומה. מצא ריבוע רשת לביצוע התאמות ראשוניות. נוח למצוא שטח ריק, חור או ריבוע רשת קרוע. הקלט את עמדות הבמה על מנת לחזור אליהן בנוחות.
2. הביאו את הדגימה לגובה אאוצנטרי. ישנן מספר שיטות לעשות זאת. לדוגמה, השתמשו בנדנוד הבמה להטיית הרשת תוך הזזת גובה הדגימה לאורך ציר Z עד שהתמונה תפסיק לזוז לרוחב. לחלופין, סמן תכונות מסוימות במסך הצפייה והטה את הבמה ל- 30°. התכונה תנוע לרוחב. התאימו את גובה הדגימה כדי להחזיר אותה למקומה המקורי. הגדל את ההגדלה או את הטיית הבמה כדי לחדד. חזור להטיה של 0°.
3. חזור למצב STEM והכנס את גלאי STEM. עבור למצב הגדלה גבוהה (SA) הנמוך ביותר. ודא שנצפתה תמונה על מסך המחשב. סרוק במהירות על מנת למנוע חשיפה מיותרת; 1 μs/pixel או פחות יהיה אופייני. שימו לב שהתמונה עשויה להיראות מעוותת בגבול השמאלי כאשר הסריקה מהירה מדי (ראו איור 2).
4. לחץ על Eucentric Focus, הגדל את ההגדלה ומקד את המיקוד בזמן הסריקה. נוח להשתמש בזכוכית מגדלת המיקוד המסופקת על ידי תוכנת המיקרוסקופ.
5. כוונן את אסטיגמציית המעבה. זה יכול להיעשות בצורה המדויקת ביותר על ידי שיטת Ronchigram. כאשר הקרן נמצאת מעל אזור דגימה דק, התמקדו בנקודה שבה הקרן המשודרת מתפוצצת, בין תמונות צל של הדגימה משני הצדדים. לאחר מכן, התאם את כוונון המעבה כדי להפוך את הדיסק המרכזי עגול. זה דורש קצת תרגול, במיוחד עבור דגימות קריוגניות.
   הערה: חלופה היא למצוא כמה חלקיקי זהב (המשמשים לעתים קרובות כסמנים פידוקיאליים ליישור בטומוגרפיה). הגדל את ההגדלה והתמקד למעלה ולמטה, וכוונן את האסטיגמציה כך שהחלקיקים יישארו עגולים ללא התארכות לשני הכיוונים.
6. עבור למצב LM STEM והמשך לסרוק כדי למצוא אזור מעניין. התאם מחדש את הגדרות B/C של הגלאי במידת הצורך (שלב 1.13.3), בערך בשלב זה.

3. הקלטת תמונה

1. להעריך את המינון להקלטה. ככלל אצבע, יש לשאוף ל-100-150 e^-/Ų עבור כל הטומוגרפיה. בדוק את סובלנות המינון לכל דגימה. הזרם באמפר (A) חלקי המטען לאלקטרון מייצג ספירה של e-/s, אשר מוכפלת בזמן החשיפה, T, בשניות ומחולקת בשדה הראייה ^{ב-Å 2}. לנוחיותכם, בטאו את הזרם בננו-אמפר (כפי שהוא נקרא מהמסך), את רוחב שדה הראייה במיקרומטרים ואת זמן החשיפה לפריים בשניות, עם גורמים מתאימים:
   
   יש להכפיל מספר זה במספר ההטיות כדי לקבל את סך החשיפה בסדרה. לדוגמה, עם זרם I = 0.04 nA, שדה L = 4 מיקרומטר, וזמן חשיפה של 12 שניות, אנו מקבלים 1.9 e-/Å 2 לכל הטיה, או בערך 110 e^-/Ų עבור סדרה של 61 הטלות.
2. החזירו את הבמה לחור (או משכו את הרשת) וכווננו את זרם הקרן באמצעות גודל ספוט ו/או הגדרות עדשת אקדח כדי להגיע לזרם המסך הרצוי. אם המדידה היא 0, הוסף מפתח צמצם C2 גדול יותר כדי להגדיל את הזרם. לאחר מכן, לתקן על ידי חלוקת המדידה על ידי ריבוע של יחס הקטרים, ולבסוף לחזור צמצם קטן יותר.
3. לטש את הגדרות B/C בהתאם לשלב 1.13.3, ולבסוף להחזיר את השלב לאזור עניין ולבדוק מחדש יישור ישיר ואסטיגמציה בתנאי ההדמיה.
4. רכוש תמונת בדיקה.

4. טומוגרפיה עם SerialEM

1. הפעל את שרת SerialEM במחשב המיקרוסקופ (SerialEM מותקן בדרך כלל במחשב אחר). לאחר מכן, פתח את SerialEM. STEM מופיע ב-SerialEM כמו מצלמה, עם אותו ממשק. ודא שהתקשורת פועלת כראוי עבור ההתקנה. לדוגמה, כרטיסיית המיקרוסקופ אמורה להציג את ההגדלה הנכונה. אם זה לא עובד, עצור כאן ופתור בעיות.
2. אתר את הכרטיסיה מצלמה וסקריפט ופתח את הגדרה. ודא שמצלמת ה-STEM נבחרה, ועבור כל מצב בחר זמני קשירה ושהייה מתאימים. ודא שהגלאי (או הגלאים) המתאימים מופיעים בתיבה "ערוצים לרכישה" בפינה השמאלית התחתונה. לחץ על רכוש בחלק התחתון כדי לבדוק. שוב, אל תמשיך אם שום דבר לא קורה, או אם הקרן לא מתרוקנת. עצור ובדוק את התקשורת.
   הערה: המצבים משמשים באופן דומה לטומוגרפיה של HEM. Binning הוא מלאכותי לתאימות עם TEM. הפרמטר החשוב הוא ספירת הפיקסלים; מערכות מיקרוסקופ שונות משתמשות בכריכה שונה כדי להגיע לאותה ספירה.
   1. תצוגה וחיפוש צריכות להיות סריקות מהירות עם מעט פיקסלים יחסית (לדוגמה, 512 x 512 פיקסלים בשנייה אחת).
   2. פוקוס הוא בדרך כלל אזור קטן עם הקלטה מהירה. לכן, במצב מינון נמוך, בחר פוקוס כדי להיות בהגדלה שונה למצב הקלטה, אשר יכול לסייע בדיוק. השאירו את גודל הספוט ללא שינוי.
   3. במצב Record, השתמש בפרמטרים שנבחרו לעיל בהערכת החשיפה. אם אפשרות זו זמינה, בחרו גם 'מיקוד דינמי', המתקן את המיקוד שורה אחר שורה בתמונה מוטה.
   4. לנוחות מאוחר יותר, בחר את האיגוד לתצוגה מקדימה כך שיהיה זהה לזה של תצוגה (ראה שיפור #1, שלב 5.5). גודל התמונה (מספר הפיקסלים) אינו חייב להיות זהה.
   5. השתמש במצב ניסיון כדי לשמור על אזור הרשומות ממורכז במהלך הרכישה. הוא יכול להיות דומה ל-View, אבל שימו לב שלא יהיו עיוותים בסריקה בצד שמאל של הפריים (ראו איור 2 לדוגמה). שוב, במצב מינון נמוך, גירסת הניסיון יכולה להיות בעלת הגדלה שונה מאשר במצב רשומה.
   6. השתמש במצב מונטאז' באופן מיידי לסריקת הרשת. זה צריך להיות צפוף פיקסלים מספיק כדי למצוא תחומי עניין; המלצה: 512 x 512 או 1024 x 1024. ודא שהתמונה טובה, עם טווח דינמי סביר (ניתן לראות בפקדי תצוגת התמונה), מכיוון שמצב זה משמש למציאת אזורי הדגימה.
   7. שמור את קובץ ההגדרות כך שאפשרויות אלה יישמרו כברירת מחדל עבור ההפעלה הבאה (שעשויה להתרחש בקרוב במקרה שהתוכנית קורסת).
3. בדוק את כיול היסט התמונה והיסט השלב. במצב microprobe (או nanoprobe), לחץ על הצג תמונה, רחף מעליה עם העכבר, החזק את הלחצן למטה וגרור באלכסון בכרבע משדה הראייה. לאחר מכן, צלם תצוגה נוספת. התמונות צריכות להיות חופפות בצורה מושלמת. חזור על הפעולה על-ידי גרירה חוזרת תוך השארת מקש Shift לחוץ (כדי לאכוף תנועת שלב). התמונות אמורות להיות חופפות היטב, אם כי אולי פחות מדויקות.
4. עבור למצב LM ובדוק את שינוי השלב. אם בדיקות אלה נכשלות, עצור ופתור בעיות. השאר לא יעבוד.
5. צור מפת LM מונטאז' של הרשת כולה. ניתן לעשות זאת גם ב- TEM.
   1. עבור למצב STEM בהגדלה הנמוכה ביותר שבו התמונה אינה חסומה על-ידי צמצמים, בדרך כלל בסביבות 185x.
   2. לחץ על תפריט נווט > פתח. לאחר מכן, לחץ על תפריט נווט > ניווט. אפשרויות > בטלו את הבחירה באפשרות 'המר מפות לבתים'.
   3. בחר תפריט נווט > מונטאז' ורשתות > הגדרת מונטאז' מלא. ייפתח תפריט. האפשרויות שיש לבדוק הן: הזזת במה במקום הזזה של תמונה, יצירת מפה מכל מונטאז' אם הנווט פתוח , ושימוש במיפוי מונטאז', לא בפרמטרים של הקלטה. גודל רשת התמונה צריך להיות בערך 6 x 6 או 7 x 7. חפש את האזור הכולל שיש לתעד. אם נדרשות תמונות רבות מדי, ייתכן שההגדלה לא תיקרא כראוי מהמיקרוסקופ (איור 3). עצרו ובדקו.
   4. כדי להתחיל ברכישת Montage, לחץ על התחל בפקדי מונטאז' או על מונטאז' תחת מצלמה וסקריפט. תפריט נוסף ייפתח לבחירת פרמטרי הקובץ: mrc, לאחסן כמספרים שלמים, ובתיבת דו-שיח נוספת, לבחור את שם הקובץ לאחסון. הקפד לאחסן נתונים באזור הנתונים המתאים ולא תחת הגדרות המשתמש של SerialEM עצמה. מומלץ לא לאחסן נתונים גדולים בדיסק C שבו שוכנת המערכת.
   5. בסיום הרכישה, המונטאז' יופיע בחלון הראשי (איור 4). כעת ניתן לנווט ברחבי הרשת באמצעות הסמן והנקודות על הנווט, בדיוק כמו ב- TEM.
6. בדוק שוב את תיקון האסטיגמציה. בדרך כלל, מספיק לסרוק אזור קטן במהירות ולהתאים את עצמו יחד עם הפוקוס, כך שתכונות דמויות נקודה כגון ננו-חלקיקי זהב יישארו עגולות לחלוטין כאשר הם עוברים פנימה והחוצה ממיקוד (כמו ב- SEM) בהגדלה גבוהה. באופן שמרני יותר, ניתן לחזור על היישור הישיר של שלבים 1.5-1.8 לפני תיקון אסטיגמציה.
7. התאימו את הדמיית ההגדלה הגבוהה למונטאז' LM.
   1. עבור למיקום במונטאז' LM עם תכונה קלה לזיהוי. הוסף נקודה, לחץ על חלון נווט > הוסף נקודות, ולחץ על התכונה. לחץ שוב (הפסק להוסיף) כדי להשבית את ההפעלה.
   2. צלם תמונת תצוגה או ניסיון בהגדלה הנמוכה ביותר של מאג גבוה (HM) ומצא את הפריט שצוין. מקמו שם את הסמן (צלב ירוק), וכשהנקודה המתאימה מסומנת בחלון 'נווט', בתפריט ' נווט > 'Shift לסמן...', בתיבת הדו-שיח שנפתחת, בחרו ' כל המפות ' ו'שמור Shift', כפי שמוצג באיור 5.
   3. בדוק על ידי הזזת הבמה למיקומים אחרים ואימות שתמונת HM ממורכזת באותם מיקומים שנבחרו במונטאז' LM. אם התכונה אינה גלויה בתמונת HM, ייתכן שהמעבר בין מצבי LM ו-HM גדול מדי. במקרה זה, בצע מונטאז' מצולע על פני שטח גדול יותר. לחץ/י על חלון הנווט >״הוסף מצולע״, בחר/י כמה נקודות ולאחר מכן לחץ/י שוב על ״הוסף מצולע ״ כדי לסגור. לחץ על תפריט ניווט > Montaging ו- Grids > Setup Polygon Montage ו- Montage Controls > Start. לאחר מכן, מצא נקודות מתאימות כמו לעיל ולחץ על Shift to Marker....
8. הגדר מצב מינון נמוך.
   1. פתח את הכרטיסיה בקרת מינון נמוך וסמן את התיבה מצב מינון נמוך .
   2. סמן את עדכון רציף ועבור אל תצוגה. בחר את הגדלת המיקרוסקופ עבור מצב זה, בדרך כלל הנמוך ביותר או ליד הנמוך ביותר. בחר כל אחד מהמצבים הבאים והגדר את ההגדלה המתאימה. יש להגדיר את הרשומה כדי להשיג את גודל הפיקסלים הרצוי, והגדלת המיקוד צריכה להיות גבוהה מספיק כדי שסמני פידוקיאל או תכונות ניגודיות גבוהה אחרות למיקוד ייפתרו בבירור. לאחר מכן, בטל מיד את הסימון של עדכון רציף.
      הערה: מצב ניסיון עשוי להיות מוגדר בדומה לרשומה, ובמקרה זה יהיה צורך להזיז את אזור המעקב מאזור הרשומה כדי למזער את החשיפה, או להגדלה נמוכה, המקיפה חלק גדול מהסביבה.
   3. צלם תמונת תצוגה והגדר את מיקום גירסת הניסיון באמצעות הגדר מיקום של אזור: גירסת ניסיון.
      הערה: המלצה #1: בהתחשב בשינוי באזור ובזמן שנדגמו, החשיפה הנוספת לניסוי מאג נמוך עשויה להיות מינימלית. כל עוד סרגל הרשת אינו נכנס לשדה הראייה, שיטת מעקב זו בדרך כלל אמינה יותר. המלצה #2: ניתן גם לעדכן את גודל הספוט על מנת להתאים את המינון למצבים שונים, כגון פוקוס. לצורך יציבות בהגדרות אופטיקת המיקרוסקופ, אנו ממליצים לא לעשות זאת, אלא להשאיר את גודל הספוט כפי שמתאים להקלטה ולאחר מכן להתאים את זמן החשיפה במידת הצורך למצבי הסריקה המהירים יותר.
   4. לחץ על הכרטיסייה Low Dose Control > עבור אל: Rec. ולאחר מכן לחץ על תפריט Navigator > Open Imaging States > Add Current State. תן לו שם כך שניתן יהיה להיזכר בו בקלות (למשל, μP STEM עבור microprobe STEM). מצבים שונים עשויים להיות מוגדרים עבור משימות שונות.
9. העבר את הבמה למקום עניין לטומוגרפיה (עוד על השימוש בנווט בהמשך).
   1. הוסף נקודה בנווט על-ידי לחיצה על חלון הנווט > הוסף נקודות.
   2. לטש את הגובה האוצנטרי על-ידי בחירה באפשרות משימות > Eucentricity > Rough. חלון הנווט > עדכון Z.
   3. הגדר את האזורים עבור מיקוד וניסיון. ראשית, צלם תמונת תצוגה. לאחר מכן, בכרטיסיה בקרת מינון נמוך , תחת הגדר מיקום של אזור, בחר מיקוד או ניסיון. התאימו את המיקומים לשני האזורים לאורך ציר ההטיה. המוקד לא אמור לחפוף לאזור הרשומה.
      הערה: זכור שיש צילום יתר, במיוחד בקצה השמאלי, כך שאין להגדיר אף אחד מהם בסמוך לאזור הרשומה. ניתן להעריך את היקף צילום היתר באזור הבדיקה על ידי סריקה חוזרת ונשנית בהגדלת הרשומה, ולאחר מכן הקטנת ההגדלה כדי לקבל תצוגה רחבה יותר.
10. למדידה טובה (אופציונלי עם ניסיון), הטה את הבמה ל- +60° ולאחר מכן ל- -60°, ובכל פעם צלם תמונה מסוג View או Preview כדי לוודא שסרגל הרשת אינו נכנס לשדה הראייה של אזור הרשומה המוצג בירוק.
11. הגדר את סדרת ההטיה.
    1. פתח קובץ חדש כדי לשמור את הנתונים על-ידי לחיצה על קובץ > פתח חדש ובחר שם קובץ. בחר בתפריט Tilt Series > Tilt Series Setup (איור 6). פתרון בעיות: אם הלחצן פתח חדש אפור, ודא שסידרת ההטיה הקודמת הסתיימה. אם לא, סיים על-ידי לחיצה על הטיית סידרה > סיום.
    2. קבעו את זוויות ההטיה הקיצוניות בתיבות ' הטה אל ' ו'סוף ב' , בדרך כלל -60° ו- +60°, בהתאמה, וכן את ההפרש הקבוע, בדרך כלל 2°.
    3. עבור מצב מינון סימטרי (מומלץ - ודא שמצב מינון נמוך עדיין פעיל), סמן את הפעל סדרה בשני כיוונים מ- ___. הריק הוא בדרך כלל 0, אך ניתן להשתמש בו כדי לפצות על למלה FIB מוטה מראש (למשל, ב- 20°).
    4. לשם הפשטות, סמן את שמור על זמן חשיפה קבוע. שינוי זה דורש עיבוד מחדש של חישוב החשיפה, ויכול גם להפריע לשחזורים אלגבריים (למשל, ART/SART/SIRT), המשווים עוצמות חזויות לנתונים המקוריים (ראה שלב 7.1).
    5. סמן את דלג על מיקוד אוטומטי. זווית התכנסות למחצה קטנה, כגון 1 mrad, מרמזת על עומק שדה כה ארוך שייתכן שאין צורך להתמקד. בבדיקה, התמקדו ב-0°, הטו ל-60° או -60°, ולחצו על Record. שמירה על מיקוד היא בעיקר עניין של גובה אאוצנטרי מדויק. עבור התכנסות גדולה יותר, ייתכן שיהיה צורך להתמקד במהלך הסדרה. במקרה זה, קבל תצוגה, ובכרטיסייה Low Dose Control , הגדר את מיקום האזור והמיקוד והתאם את אזור המיקוד.
    6. פעולות ראשוניות וסופיות: אם התאמת גובה אאוצנטרית בוצעה במדויק, אין צורך לחזור עליה. בטל את הסימון של סגור שסתומי עמודות בסוף הסדרה , אלא אם כן יש סיבה טובה לא לעשות זאת.
    7. למעקב אחר פרמטרי הבקרה, ישנן אפשרויות רבות. עבור איסוף נתונים ללא השגחה, העדיפות העליונה היא למנוע את עצירת התוכנית לקלט משתמש. השתמש בהגדרות המומלצות: חזור על Record אם אחוז השדה שאבד הוא יותר מ- 5. לאחר מכן, עקוב אחר ובדוק את יישור עם תצוגה מקדימה לפני קבלת חומר עזר חדש לרצועה וקבל חומר עזר לרצועה חדשה אם יישור הרשומה שונה ב- 2%. עבור איסוף נתונים נוכחים, החל פרמטרים מחמירים יותר כדי למנוע את הסיכון של אובדן שעות של זמן המכשיר.
    8. כאשר אתה מוכן להתחיל, לחץ על GO בתחתית החלון. בסוף, בחר הטיה סידרה > סיום.

5. רכישת אצווה במספר נקודות באמצעות הנווט (שיפור #1)

הערה: הפרוטוקול הוא בסיסי מכיוון ש-א) הוא זהה ל-TEM ו-ב) כלים חדשים הופכים לזמינים שככל הנראה יהפכו תיאור מלא למיושן.

1. טען את מונטאז' הרשת המלא לחלון הראשי.
2. בחר מספר תחומים שנראים מבטיחים. לחצו על 'הוסף נקודות ' והוסיפו למרכז ריבועי הרשת שנבחרו. לחץ שוב על הוסף נקודות כדי להשבית את המצב.
3. כאשר מצב ההדמיה במינון נמוך מופעל, בחר חלון נווט > סמן את האפשרות רכוש וקובץ חדש בפריט עבור כל אחד מהריבועים שנבחרו. עבור הראשון, תיפתח תיבת דו-שיח עבור מאפייני הקובץ (איור 7) ולאחר מכן עבור שם הקובץ. בחרו תמונות מונטאז' ולאחר מכן, בתיבת הדו-שיח 'הגדרת מונטאז '" (איור 8), בדקו את האפשרות 'השתמש בפרמטרי תצוגה במצב מינון נמוך ' וצרו רשת גדולה מספיק כדי לכסות את הריבוע (בערך 100 x 100 מיקרומטר).
4. לחץ על תפריט Navigator > רכוש בפריטים ובחר את הפרמטרים למיפוי. והכי חשוב, בפעולות ראשוניות, סמן את Make Navigator Map, לאחר מכן Rough Eucentricity and Fine Eucentricity, ולחץ על Go (איור 9). עבור רשת של 200 רשתות שינוי, התוצאה תהיה מפה של בערך כל הריבוע (איור 10)
5. היכונו לבחירת עמדות טומוגרפיה. פתח קובץ חדש על-ידי לחיצה על קובץ > פתח חדש. תן לו שם קובץ (לדוגמה, AnchorMaps.mrc).
   1. כאשר מצב מינון נמוך פעיל, הזן Camera &; Script > Setup וודא שהתצוגה והתצוגה המקדימה נמצאות באותו איגוד (אחרת, לא ניתן לשמור אותן באותו קובץ).
   2. בקר בנקודות במפות הריבועיות על-ידי לחיצה על חלון נווט > עבור אל XYZ.
   3. בחר מיקום עבור הטומוגרפיה הראשונה עם הסמן. צלם תמונת תצוגה מקדימה ומקד את המיקום על-ידי גרירה באמצעות לחצן העכבר הימני. לאחר מכן, בחר חלון נווט > מפה חדשה ולחץ על כן לתיבת הדו-שיח כדי לשמור. לאחר מכן, צלם תמונת תצוגה של אותו אזור ושוב שמור כמפה חדשה. ודא שמפת התצוגה מסומנת, וסמן את מצב העיגון בחלון הנווט בפינה השמאלית העליונה.
   4. בחר את המיקום השני, שוב קח תצוגה מקדימה ומקד את המיקום כנ"ל, והפעם לדחוף מפת עוגן בחלון נווט. פעולה זו תשמור הן את התצוגה המקדימה והן את התצוגה כמפות חדשות בנווט.
   5. חזור על שלב 5.5.4 עבור כל המיקומים הרצויים. עבור מריבוע רשת אחד לאחר על-ידי בחירת הנקודה והקשה על Go to XYZ בחלון Navigator.
6. למיקוד התייחסות, בחר אזור ברור ברשת והתמקד בזהירות, ביד או במיקוד אוטומטי. לחץ על Reset defocus בחלונית המיקרוסקופ. צור סקריפט ב- SerialEM על ידי לחיצה על Script > Edit > Edit 15 (או מספר חופשי אחר) והזן שתי שורות: ScriptName SetDefocus ו- SetDefocus 0.
7. בחלון נווט, סמן את המיקום הראשון (תצוגה מקדימה או תצוגה). הקש Shift-T ולאחר מכן סמן את המיקום האחרון ושוב הקש Shift-T. תיבת הדו-שיח מאפייני קובץ תיפתח. בחרו תמונות ופרמטרים של מסגרת בודדת לשמירה, כולל שם הקובץ. ערוך את שם הקובץ אך השאר את תווית הפריט בסוף.
   הערה: שמות קבצים המסתיימים במספרים יתעדכנו אוטומטית עבור סדרות הטיה עוקבות. נוח להשתמש באפשרות תפריט ניווט > ניווט. אפשרויות > שימוש בתוויות פריטים בשמות קבצים.
8. לאחר מכן, תפריט הגדרת סדרת הטיה ייפתח באופן אוטומטי. מלאו כמו קודם (איור 6), אך אל תבחרו באפשרות 'חדד את האאוצנטריות'. נקודות התצוגה המקדימה בנווט יסומנו כעת כ- TS. ניתן לחזור לתפריט זה באמצעות הלחצן בחלון הנווט מעל רשימת הפריטים.
9. בחר בתפריט נווט > רכוש בפריטים. הפעם, בחר פרמטרים עבור נתונים סופיים. בחר פעולה ראשית: רכוש סדרת הטיה ובחר Manage Dewars/Vacuum, Realign to Item, Fine Eucentricity ו-Run Script לפני פעולה, עם Script להפעלה: SetDefocus. בחר אפשרויות כלליות: אין תיבת הודעה כאשר מתרחשת שגיאה וסגור שסתומי עמודות בסוף, ולאחר מכן לחץ על GO (איור 11). SerialEM יבקר כעת בכל מפות העוגן ויקליט סדרת הטיה בכל מיקום (איור 12).

6. רישום מפת CLEM (שיפור #2)

1. אם זה עדיין לא נעשה, טען את מונטאז' הרשת המלא בחלון הראשי ולאחר מכן צור חלון חדש על-ידי לחיצה על חלון > חלון חדש ותן לו שם. שים לב שמונטאז' הרשת המלא מופיע ברישום 1.
2. ייבא את תמונת מפת CLEM על-ידי לחיצה על תפריט ניווט > ייבוא מפה. זה צריך להיכנס לרישום 2. ניתן גם להקצות לו חלון חדש כנ"ל.
3. בדוק את מפת CLEM כדי לקבוע את הסיבוב היחסי ביחס למונטאז' הרשת המלא. הכי קל לעשות זאת על מפה שבה מופיעים פסי הרשת. שים לב שגם המפה עשויה להיות הפוכה. יישרו אותו בערך באמצעות תפריט 'נווט >'סובב מפה', עם 'היפוך' במידת הצורך.
   הערה: השלב הבא יכול להתאים גם להיפוך, אך פעולה זו מראש הופכת את הפעולות הבאות לקלות הרבה יותר. ניתן לחזור על שלב זה עד ליישור נראה משביע רצון, אך אין צורך לדייק.
4. הצג נקודות רישום ליישור מדויק. מקם מספר נקודות מתאימות בחלון אחד ולאחר מכן בחלון השני. עבור כל נקודה כזו, סמן את נקודת הרישום בחלק העליון של חלון הנווט. נקודות מתאימות יסומנו באינדקס עולה, ואחריו R1 או R2 עבור מונטאז' הרשת או המפה המיובאת, בהתאמה.
   הערה: השימוש ברשתות איתור הופך שלב זה לפשוט מאוד. אחרת, בחרו תכונות מוצקות כגון הסמן המרכזי או פינות ריבועי הרשת. באופן עקרוני, שלוש נקודות מספיקות ליישור גס, אך יותר נקודות עוזרות לפצות על אי התאמות קלות במבני המונטאז'.
5. אם דרושים מספר ערוצים של מפת CLE, לדוגמה, צבעים פלואורסצנטיים שונים או פלואורסצנטיות ללא רקע שדה בהיר, יבא אותם כמו בשלב 6.2 לעיל ושנה את הרישומים ל- 2. בדרך זו, הם יירשו את נקודות הרישום מהמפה הראשונה.
6. כפה את הרישום בתפריט Navigator > שינוי צורה של פריטים. נקודות הרישום המתאימות יופיעו כעת בכל המפות, אשר יופיעו ברישום 1. כדי ליישר באופן חזותי, לחץ על תפריט נווט > סובב מפה. שים לב שכאשר מפה נטענת מחלון הנווט, היא אינה מסובבת באופן אוטומטי אלא אם התיבה סובב בעת טעינה מסומנת. תמיד ניתן לסובב אותו מחלון הנווט.
7. כעת אמור להיות אפשרי למקם את הסמן או נקודה על מפת הפלואורסצנטיות ולהזיז את הבמה למיקום המתאים ברשת (איור 13).

7.3D שחזור

1. זה כרוך באותם שלבים בסיסיים כמו טומוגרפיית HEM: יישור של סדרת ההטיה ואחריו בדרך כלל הקרנה לאחור. קיימות מספר פלטפורמות תוכנה, וניתן להתייחס לנתונים באופן דומה לנתוני TEM, למעט העובדה שיש לדלג על תיקון CTF.
2. החל נורמליזציה של עוצמה כדי לשפר את התרומה של תחזיות הטיה גבוהה או כדי לאזן שינוי בתאורה במהלך הסדרה, עם האזהרה כי מידע כמותי מושפע. IMOD²⁶ עובד היטב, למשל, בעוד AreTomo²⁷ שימושי מאוד עבור יישור פידוקיאלי פחות; כאשר קיימים חלקיקים פידוקיאליים, ClusterAlign²⁸ יכול לעקוב אחריהם כצבירים ולא כנקודות בודדות; הדבר שימושי במיוחד עבור נתוני STEM שבהם כתמים עלולים ללכת לאיבוד או להיות מוסתרים על-ידי תכונות בעלות ניגודיות גבוהה.
3. בצע שחזור עם deconvolution^{3D 29} לשיפור ניגודיות ו denoising. לאחר השחזור, ייצג את נתוני נפח ה- STEM בכל אחת מהשיטות הסטנדרטיות, כגון אורתופרוסות או פילוח איזו-משטח. יש לציין כי התפלגות העוצמה היא חד-קוטבית, ללא היפוכי ניגודיות או שולי פורייה המופיעים ב-TEM קונבנציונלי של ניגודיות פאזה. אמצעי מעניין לייצוג טומוגרפיות STEM, באופן כללי, הוא היפוך השדה הבהיר (איור 14). ההשפעה היא של "עיני רנטגן", הרואות את האובייקטים הצפופים המעניינים דרך התא הבהיר³⁰.

תוצאות

מונטאז' רשת מלא שהוכן ב-STEM מראה את האזורים עם התאים המעניינים (איור 4). שים לב שהתמונה נמצאת בשדה כהה, כך שהחורים הריקים נראים כהים. התאים נראים בהירים חלקית, כאשר האלקטרונים מפוזרים לכיוון גלאי HAADF. בחלקים העבים ביותר, בדרך כלל במרכז או ליד פסי הרשת, הניגודיות מחשיכה שוב. הסיבה לכך היא פיזור מרובה, שבו האלקטרונים מגיעים לזוויות שלא נלכדו על ידי הגלאי. בפועל, אזורים אלה יהיו עבים מדי לטומוגרפיה.

השלב הבא כולל מפות של הגדלה בינונית (איור 10). מפות אלה נקראות לעתים קרובות מפות מונטאז' בינוניות, או מפות מרובעות, המתייחסות לריבועי הרשת ולא לצורה. אפילו במצב STEM של מיקרו-פרוב הנמוך ביותר, הם יירכשו גם כתמונות מונטאז'. לחיצה על הפריט בחלון הנווט טוענת את תמונת המפה בחלון הראשי. נקודות ספציפיות לרכישת טומוגרפיה נבחרות בתחום זה. השתמש במצב תצוגה מקדימה כדי לאתר את האזור בהגדלת ההקלטה. זכור שייתכן שינוי רוחבי בין Preview ל- Record, בהתאם למהירויות הסריקה. ניתן לרשום כאן סדרת הטיה יחידה. מיטוכונדריה, לדוגמה, עשויה להיות מזוהה לעתים קרובות בתמונת התצוגה המקדימה והרשומה (איור 12).

עבור טומוגרפיית אצווה, הבמה תנוע ברחבי הרשת וייתכן שלא תחזור לאותו מיקום בדיוק. מפות עיגון משמשות כדי להבטיח שאזורי הרשומה הרצויים יזוהו מחדש באופן מהימן על-ידי התאמת תמונת התצוגה המקדימה לתצוגת הגדלה נמוכה יותר, גם אם תנועת הבמה זזה. PyEM^23,24 מציע חלופה מהירה יותר שבהחלט מומלצת, אך עדיין אינה חלק מההתקנה הסטנדרטית.

בגישת LEM, ניתן להשתמש במפת פלואורסצנטיות כדי לזהות את תחומי העניין לטומוגרפיה. הפלואורסצנטיות נרכשת חיצונית ויש לרשום אותה במונטאז' הרשת המלא. כדאי לראות את פסי הרשת והחורים, כך שניתן להכין פלואורסצנטיות ממוזגת + שדה בהיר מרוכב לפני הייבוא, למשל בתוכנת GIMP (https://www.gimp.org) או ImageJ³¹ (יש לוודא ש- ImageJ הופך את הציר האנכי). כאשר הטווח הדינמי של הפלואורסצנטיות גדול, ייתכן שיהיה קשה ליצור מיזוג כזה ללא רוויה. במקרה זה, ניתן לייבא את שתי המפות בנפרד ולאחר מכן לרשום אותן יחד כמתואר (איור 13). בדרך זו, נקודה על מפת הפלואורסצנטיות בחלון הנווט, ואחריה "Go To XY", מביאה את הבמה למיקום המתאים ברשת כפי שהיא מותקנת ב- TEM. דאגו שחוסר עקביות קטן ביצירת המונטאז' (או מפת הפלואורסצנציה, אם גם היא מונטאז') יוביל לתזוזות קטנות; לכן, לדיוק מיטבי, יש לרשום מחדש את הפלואורסצנטיות במיוחד במפה הריבועית. לעתים קרובות מספיק לבצע רישום זה בעין, על בסיס חורים בסרט התמיכה או תכונות המשותפות עם תמונת אור השדה הבהיר.

שחזור של סדרת ההטיה יוצר נפח תלת-ממדי (איור 14). לדוגמה זו גודל הפיקסלים הוא 2.042 ננומטר, והתוצאה היא שדה ראייה של ~4 מיקרומטר. משקעי סידן פוספט (ראשי חץ כתומים) בולטים, בגלל המספר האטומי הגבוה יותר בהשוואה לסביבה. מיקרוטובולים (ראשי חץ אדומים) ניתן לעקוב לאורך כל שדה הראייה. כמו כן, ניתן לראות בבירור את הקרומים המיטוכונדריאליים הפנימיים והחיצוניים (ראשי חץ ירוקים). אקטין ניתן לראות כמו צרורות או כמו חוטים בודדים. כדי להשיג רזולוציה איזוטרופית יותר, השחזור עשוי להיות מעובד על ידי deconvolution.

איור 1: השוואה בין TEM לעומת STEM. ב-TEM, שדה הראייה מואר על ידי קרן מקבילה כמעט, והעדשה האובייקטיבית יוצרת תמונה מוגדלת על המצלמה. עבור cryo-TEM, הצמצם האובייקטיבי נפתח כדי לעבור את גלי האלקטרונים המפוזרים (קו אדום מקווקו), אשר, עם ביטול המיקוד, מייצרים ניגודיות פאזה על ידי הפרעה לגלים הבלתי מפוזרים (ירוקים). STEM, לעומת זאת, מפעיל רסטר של קרן ממוקדת על פני הדגימה ואוסף את האלקטרונים המפוזרים באופן פיקסל אחר פיקסל. גלאים מרובים עשויים לאסוף אלקטרונים המפוזרים לזוויות שונות. נתון זה שונה^מ-30. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: דוגמה לעיוות תמונה בצד שמאל עקב קצב סריקה גבוה. שימו לב לעיוות המסומן על ידי ראשי חץ צהובים, כמו גם לחורים המעוותים בצורת אליפסה בקוונטיפויל. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: דיאלוג הגדרת מונטאז' עבור מונטאז' הרשת כולו. בחר את ההגדלה ואת מספר החלקים ב- X וב- Y כך שהשטח הכולל יגיע לכ- 2,000 מיקרומטר כדי לקבל מפה עבור רוב הרשת. כמו כן, בחרו 'הזזת במה' במקום 'הזזת תמונה' ו'השתמש במיפוי מונטאז', ולא 'הקלט פרמטרים'. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: GridMap מלא בהגדלה נמוכה שהוקלט במצב STEM. אזורים מנותקים נראים שחורים לחלוטין בתמונת השדה הכהה. אזורים אפורים כהים הם ככל הנראה עבים מדי וזגוגיים גרועים. אזורים מועמדים טובים לטומוגרפיה הם לבנים או אפורים בהירים בסריקה זו. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: מעבר לתהליך סמן. אובייקט הניתן לזיהוי מסומן במפה ברזולוציה נמוכה באמצעות Add Points (38 בתמונה זו). שים לב למעבר בין המפה ברזולוציה נמוכה (עיגול ירוק) למפה ברזולוציה בינונית (עיגול כתום). לאחר מכן, האובייקט מסומן על-ידי הסמן (צלב ירוק, עיגול אדום) ותיבת הדו-שיח Shift to Marker מופעלת. האפשרות שנבחרה מזיזה את כל המפות במהירות של 245x באותה כמות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 6: דיאלוג הגדרת סדרת Tilt עבור סדרת הטיית STEM. סכמת המינון הסימטרית משמשת מ- -60° עד +60° בצעדים של 2°. מדלגים על מיקוד אוטומטי עקב עומק המיקוד הגבוה בעת שימוש בזווית התכנסות נמוכה. אין צורך לעדן את האאוצנטריות כפי שנעשה בעבר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 7: תיבת הדו-שיח של מאפייני קובץ עבור מפות ברזולוציה בינונית. שמור כקובץ אוסף MRC, בחר מספרים שלמים ושמור מידע נוסף בקובץ מטא-נתונים מסוג mdoc. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 8: דיאלוג הגדרת מונטאז' לשמירת מפות ברזולוציה בינונית. עבור ריבוע על רשת של 200 רשת, שרוחבו 90 מיקרומטר, מומלץ שטח כולל של לפחות 90 מיקרומטר x 90 מיקרומטר. בחרו 'הזזת במה' במקום 'הזזת תמונה' ו'השתמש בפרמטרי תצוגה' במצב מינון נמוך. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 9: הקלטת מפה ברזולוציה בינונית. רכוש בתיבת הדו-שיח פריטים להקלטת מפות ברזולוציה בינונית. בחר מיפוי, רכוש ושמור תמונה או מונטאז' וסמן את צור מפת נווט. במשימות לפני או אחרי ראשי, בחר Eucentricity גס ובסדר. כאשר לא מקבל סיוע, בחר באופן אופציונלי בתיבה ללא הודעה כאשר מתרחשת שגיאה וסגור שסתומי עמודה בסוף. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 10: תמונה של מפה ברזולוציה בינונית. מפה ברזולוציה בינונית (מפה מרובעת) שהוקלטה במצב STEM במונטאז' של 3 x 3. שתי מפות העוגן ברזולוציה בינונית לאיסוף נתונים מסומנות על-ידי הריבועים הכחולים. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 11: נתוני סדרת הטיית אצווה. רכוש בדיאלוג פריטים לאיסוף סדרות הטיית אצווה. לאיסוף נתונים של סדרות הטיה, בחרו 'נתונים סופיים' ו'רכוש סדרות הטיה'. ב'משימות לפני או אחרי ראשי', סמן את Manage Dewars/Vacuum (בחר הגדרות מתאימות בתפריט Setup), Realign to Item, Fine Eucentricity ו-Run Script before Action. באפשרויות כלליות, סמן את התיבה אין הודעה כאשר מתרחשת שגיאה ואת סגור שסתומי עמודה בסוף (ראה 5.14). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 12: הטיה של 0° של סדרת הטיית STEM של מיטוכונדריה. ראשי חץ כתומים מצביעים על מרבצי סידן פוספט (גרגרי מטריצה), ראשי חץ ירוקים לקריסטה, וראשי חץ אדומים לסמנים פידוקיאליים של זהב 15 ננומטר. סרגל קנה מידה = 500 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 13: מפות cryo-CLEM רשומות. (A) מפת STEM ברזולוציה בינונית (מפה מרובעת, 26-A) רשומה במפת STEM (B) ברזולוציה נמוכה, (C) מפת cryo-FM של ערוץ BF ו-(D) מפת cryo-FM של ערוץ GFP. תשע נקודות הרישום (תוויות 4-21) מוצגות ב- (E) Navigator. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 14: עיבוד נפח. עיבוד נפח של (A) 60 ננומטר ומקטעים בעובי 40 ננומטר (B) באמצעות טומוגרפיה מסוננת דמוית SIRT (30 מחזורים) בעומקים שונים. גודל הפיקסל הוא 2.048 ננומטר, מה שיוצר שדה ראייה של כ-4 מיקרומטר. שימו לב לצפיפות ההפוכה בהשוואה לאיור 12, כלומר תכונות בעוצמה גבוהה הן בהירות. ראשי חץ כתומים, לבנים, אדומים, ירוקים ותכולים מצביעים על מרבצי סידן זרחתי, ריבוזומים, מיקרוטובולים, קרום המיטוכונדריה הפנימי והחיצוני וחוטי אקטין בהתאמה. סרגל קנה מידה = 500 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

הפרוטוקול אמור לסייע למיקרוסקופים במדעי החיים המעוניינים לקבל תצוגה תלת-ממדית של אברונים תוך-תאיים באזורים בתא שאינם נגישים לטומוגרפיית TEM קונבנציונלית. אותו פרוטוקול עשוי לשמש גם לטומוגרפיית STEM של קטעי פלסטיק, עם אילוצים מקלים על החשיפה. יש להתייחס לפרוטוקול כנקודת מוצא ולא כמערכת של כללים קשיחים. ואכן, כוחו של STEM הוא בגמישותו; אין דרך אחת נכונה להפעיל אותו.

נדגיש כי STEM, כשלעצמו, מתייחס רק לגשושית הסרוקה ואינו מגדיר את היווצרות התמונה. הניגודיות תלויה בעיקר בתצורת הגלאים. השיטות הפשוטות יותר משתמשות בגלאים בעלי סימטריה צירית, או דיסק שבמרכזו הציר האופטי או בטל המקיף אותו. באופן כללי, כאשר התאורה פוגעת ישירות בגלאי, אנו רושמים תמונת BF שבה הדגימה (פיזור אלקטרונים) נראית כהה; לעומת זאת, כאשר הגלאי אוסף רק אלקטרונים מפוזרים, אנו רושמים תמונת DF שבה הדגימה הצפופה נראית בהירה. כאשר חומרה מתאימה זמינה, SerialEM יכולה לרכוש ולהקליט את שני האותות הללו בו זמנית. תצורות מתוחכמות עוד יותר זמינות, החל מגלאים עם מקטעים מרובים ועד מצלמות מפוקסלות לחלוטין. ניתן להשיג הדמיית ניגודיות פאזה, למשל, על ידי הערכת ההבדל בין רכיבי גלאי מחוץ לציר^32,33. איסוף כל תבנית הפיזור הדו-ממדית (עקיפה) לפיקסל מגדיר את השיטה הידועה בשם 4D STEM³⁴, המאפשרת בנייה מחדש של ניגודי תמונה מרובים מאותם נתונים מקוריים. STEM ארבע-ממדי מאפשר פטיכוגרפיה של אלקטרונים, המספקת אמצעי נוסף להשגת ניגודיות פאזה³⁵.

התמקדנו בשיטת ה-STEM המסוימת שאנו מחשיבים כשימושית ביותר לחקר אברונים ותאים שלמים או חלקי תאים בעובי מיקרון. זה כרוך במיוחד בשימוש בהדמיית BF עם זווית חצי התכנסות קטנה בתאורה וזווית איסוף גדולה יחסית בגלאי. ההתכנסות הקטנה מספקת עומק שדה גדול כך שכל הדגימה נשארת בפוקוס לאורך סדרת ההטיה¹⁹. בפועל, עם שלב מיקרוסקופ טוב, זה יכול גם לבטל את הצורך בהתאמת מיקוד במהלך הרכישה. המחיר הוא פשרה ברזולוציה, כמתואר בסעיף 3 לפרוטוקול. הצענו תמונות 4k עם בדיקה של ~2 ננומטר, אשר עם מרווח פיקסלים של 1 ננומטר מגיע לשדה ראייה של 4 מיקרומטר. עם זאת, מומלץ מאוד לקורא להתנסות. השיקול השני הוא בצד הגלאי. כאשר דיסק ההארה ממלא את גלאי BF על הציר, ניגודיות הפאזה מדוכאת וניגודיות הפיזור (משרעת) שולטת; מצב זה נקרא ניגודיות שדה בהיר לא קוהרנטית³⁶. השאלה היא באיזה חלק למלא, והתשובה תלויה במדגם. דגימה דקה מאוד תציג את הניגודיות הטובה ביותר עם הגלאי המלא לחלוטין (כלומר, זווית האיסוף תואמת לזו של התאורה), אך דגימה עבה יותר תפזר את כל העוצמה ותשאיר אות רועש עם ניגודיות גרועה. כלל אצבע שימושי הוא שככל שהדגימה עבה יותר, כך זווית החיתוך החיצונית של גלאי BF צריכה להיות^גדולה יותר. גודל הגלאי ומיקומו קבועים כמובן, ולכן גודל דיסק העקיפה מותאם באמצעות אורך המצלמה, כמתואר בסעיף 1. אם הגדרות מגבר הגלאי הן כאלה שהאות ממלא את הטווח הדינמי אך אינו רווי תחת תאורה ישירה (1.12.3), ניתן להגדיל את אורך המצלמה עד שמגיעים לעוצמת אות וניגודיות סבירים. שוב, הקורא מוזמן להתנסות. האמנות, כביכול, נמצאת בזוויות.

פרמטר נוסף, שלא נדון בפרוטוקול, הוא מתח התאוצה במיקרוסקופ. האינטראקציה של האלקטרונים המאירים עם הדגימה תהיה חזקה יותר במתח נמוך יותר. עם כל השאר שווה, אנו יכולים לצפות לניגודיות גבוהה יותר במתח נמוך יותר. מצד שני, תחילתו של פיזור מרובה בתוך הדגימה היא המגבילה את עובי הדגימה השמישה, ולכן מתח גבוה יותר מאפשר שימוש בדגימות עבות יותר. עם זאת, השפעות אלה עדינות למדי. החוויות שלנו עד כה עם תאוצות של 200 קילו-וולט ו-300 קילו-וולט דומות.

בהתחשב במה שניתן לצפות מ- STEM במונחים של רזולוציה, זה שוב תלוי בדגימה ובתצורת הגלאי. באמצעות גישה של ניתוח חלקיקים יחידים, יוני מתכת על פריטין יכולים להיות ממוקמים על ידי שדה כהה טבעתי STEM לדיוק של כמה אנגסטרום³⁷. לאחרונה, הושגה רזולוציה תת-ננומטרית עבור דגימות וירוסים וחלבונים באמצעות תמונות שהתקבלו על ידי ניגודיות פאזה דיפרנציאלית משולבת (iDPC) STEM³² וכן פטיכוגרפיה³⁵. עבור עצמים ייחודיים בדגימות תאיות עבות, ובשיטות המתוארות כאן, רזולוציה כה גבוהה אינה מציאותית. הרזולוציה האופטימלית היא קוטר הבדיקה, המתייחס לזווית ההתכנסות למחצה כמתואר. גורמים אחרים יפגעו ברזולוציה, במיוחד דגימת פיקסלים גסה כדי להגיע לשדה ראייה גדול, חוסר התאמה בסדרת ההטיה, והתפשטות קרן הגשושית בשידור. תמונות להשוות היטב עם טומוגרפיה סעיף פלסטיק. עם ההתקנה המתוארת כאן, למשל, זה צריך להיות קל לראות את הליבה החלולה של microtubules, אבל לא protofilaments בודדים.

לסיכום, שיטות STEM וחומרה נמצאות שתיהן בשלב פיתוח. אנו יכולים לצפות כי חידושים בהדמיה ישפיעו גם על טומוגרפיה, ויובילו את STEM לתחומים שלא היו נגישים על ידי טכניקות אחרות. אנו צופים כי התכנסות עם הדמיה פלואורסצנטית קריוגנית מתאמת המבוססת על שיטות אופטיות מודרניות ברזולוציית על תהיה פורייה במיוחד. קנה המידה של אברונים, 100-1,000 ננומטר, הוא יעד אידיאלי עבור שיטות מתפתחות אלה.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
SerialEM	University of Colorado	Veriosn 4.0	SerialEM is a free software platform for microscope control and data acquisition.
STEM-capable transmission electron microscope			The protocol was written based on experience with several microscopes of Thermo Fisher Scientific: Titan Krios, Talos Arctica, and Tecnai T20-F. In principle it should be applicable to other manufacturers as well.