JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את השלבים ליישור תמונות טומוגרפיה של טומוגרפיה קוהרנטית אופטית באור נראה (vis-OCTF) עם תמונות קונפוקליות ex vivo של אותה רשתית עכבר לצורך אימות המורפולוגיה של צרור האקסון של תאי גנגליון הרשתית שנצפו בתמונות in vivo .

Abstract

בשנים האחרונות, הדמיית רשתית in vivo , המספקת מידע לא פולשני, בזמן אמת ואורך על מערכות ותהליכים ביולוגיים, מיושמת יותר ויותר כדי לקבל הערכה אובייקטיבית של נזק עצבי במחלות עיניים. הדמיה קונפוקלית Ex vivo של אותה רשתית נחוצה לעתים קרובות כדי לאמת את ממצאי in vivo במיוחד במחקר בבעלי חיים. במחקר זה הדגמנו שיטה ליישור תמונה קונפוקלית ex vivo של רשתית העכבר עם תמונות in vivo שלה. טכנולוגיית הדמיה קלינית חדשה הנקראת סיבוגרפיית טומוגרפיה קוהרנטית אופטית של אור נראה (vis-OCTF) יושמה כדי לרכוש תמונות in vivo של רשתית העכבר. לאחר מכן ביצענו הדמיה קונפוקלית של אותה רשתית כמו "תקן הזהב" כדי לאמת את תמונות in vivo מול OCTF. מחקר זה לא רק מאפשר חקירה נוספת של המנגנונים המולקולריים והתאיים, אלא גם מבסס בסיס להערכה רגישה ואובייקטיבית של נזק עצבי in vivo.

Introduction

תאי גנגליון ברשתית (RGCs) ממלאים תפקיד קריטי בעיבוד מידע חזותי, מקבלים קלט סינפטי דרך העצים הדנדריטיים שלהם בשכבת הפרספקס הפנימית (IPL) ומעבירים את המידע דרך האקסונים שלהם בשכבת סיבי עצב הרשתית (RNFL) למוח 1,2,3,4. במצבים חולים כגון גלאוקומה, ניוון RGC מוקדם עלול לגרום לשינויים עדינים ב- RNFL, בשכבת תאי הגנגליון (GCL), ב- IPL ובעצב הראייה הן בחולים והן בדגמי מכרסמים 5,6,7,8,9. גילוי מוקדם של שינויים מורפולוגיים אלה ב- RGCs חיוני אפוא להתערבות בזמן למניעת RGC ואובדן ראייה.

לאחרונה פיתחנו טכנולוגיית הדמיה חדשה מוכנה קלינית הנקראת טומוגרפיה קוהרנטית אופטית של אור נראה (vis-OCT) כדי לספק את הצורך בניטור in vivo של נזקי RGC. Vis-OCT שיפר את הרזולוציה הצירית, והגיע ל-1.3 מיקרומטר ברשתית10,11, מה שאיפשר הדמיה של צרורות אקסונים בודדים של RGC ב-RNFL. לאחר מכן, סיבים vis-OCT (vis-OCTF) הוקמה כדי לעקוב ולכמת את נזקי RGC ברמת צרור האקסון היחיד בעכברים11,12,13. עם זאת, הדמיה קונפוקלית ex vivo של אותה רשתית כמו תקן הזהב נחוצה לעתים קרובות כדי לאמת את ממצאי in vivo. לכן, מחקר זה ידגים כיצד ליישר תמונות in vivo שנרכשו על ידי vis-OCTF עם תמונות קונפוקליות ex vivo של אותה רשתית עכבר. מטרת הפרוטוקול היא לאמת את ממצאי in vivo באמצעות הדמיה קונפוקלית ex vivo ולבסס בסיס לבחינת השינויים המולקולריים והתאיים העומדים בבסיס נזקי RGC במצבי מחלה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

כל הנהלים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת וירג'יניה ותאמו את ההנחיה לשימוש בבעלי חיים מהמכון הלאומי לבריאות (NIH). עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים הקשורים לכל החומרים, הריאגנטים והמכשירים המשמשים בפרוטוקול זה.

1. הדמיית In vivo vis-OCT

  1. מערכת vis-OCT
    1. דמיינו את עיני העכברים באמצעות מערכת vis-OCT של חיה קטנה המשתמשת במקור אור סופר-רציף, המספק הארה באור נראה בין 480 ננומטר ל-650 ננומטר. ודא כי אירוע החשמל על הקרנית הוא 1 mW ולהשתמש בקצב קו A של 25 kHz וזמן אינטגרציה של 39.3 μs לכל קו A.
    2. ודא שטווח הגילוי הספקטרלי של הספקטרומטר הוא בין 508 ננומטר ל- 613 ננומטר, המספק רזולוציה צירית של 1.3 מיקרומטר ברשתית. נפח ההדמיה הכולל הוא בערך 700 מיקרומטר (x) x 700 מיקרומטר (y) x 1,500 מיקרומטר (z). הרזולוציה הצידית היא בין 4.5 מיקרומטר במרכז שדה הראייה ל-8.7 מיקרומטר ב-350 מיקרומטר ממרכז11,13.
  2. הרדמת עכבר
    1. מרדימים עכברים מרקע C57BL/6 ומקיימים יחסי מין עם זריקה תוך צפקית של קטמין (114 מ"ג/ק"ג) וקסילזין (17 מ"ג/ק"ג) קוקטייל ומרחיבים את אישוניהם באמצעות טיפות טרופיקמיד 1%. ודא הרדמה נאותה על ידי אובדן רפלקס הדוושה לאחר צביטת בוהן יציבה.
    2. במהלך ההדמיה, שמור על חום העכבר באמצעות מנורת חום אינפרא אדום. לאחר כל רכישת תמונה, יש למרוח דמעות מלאכותיות למניעת התייבשות הקרנית.
  3. מיקום העכבר להדמיה
    1. הניחו את העכבר המרדים על בעל החיים והשאירו את העכבר במקומו בעזרת שתי רצועות סקוטש.
      הערה: מחזיק בעלי החיים מאפשר תנועה בתלת מימד (כוונון אנכי, כוונון אופקי עדין, כמו גם כוונון גובה ופיהוק) כדי למקם את הלייזר לעין העכבר.
  4. התאמת פרמטרי הדמיה
    1. הפעל את המחשב ופתח את התוכנה המוזכרת, שתפעיל את הלייזר באופן אוטומטי.
    2. כוונן את מחזיק בעל החיים עד שהלייזר יציב וממורכז לעין העכבר. דמיינו את החלק האחורי של העין באמצעות תצוגה מקדימה של En Face בממשק התוכנה, שדה הראייה (FOV) של מקלעת כלי הדם השטחית, וסריקת B, חתך הרוחב של הרשתית בתוך ה-FOV.
    3. רכוש עוצמת קול vis-OCT על ידי לחיצה על כפתור Purchase בממשק התוכנה לאחר ביצוע התאמות קלות של המיקוד האופטי, המורכב מ- 512 שורות A/B-סריקה ו- 512 סריקות B/עוצמת קול.
      הערה: תהליך זה אורך ~10.5 שניות. רכישת תמונות מונחית על-ידי מעריך מובנה של מדד איכות (QI) כדי להבטיח שתמונות מתחת לסף שנקבע מראש (QI < 45) לא ייכללו.
      1. עבור כל עכבר, רכוש ארבעה אמצעי אחסון vis-OCT מאותה עין. יישרו את ראש עצב הראייה (ONH) בכל אחת מארבע הפינות ב-FOV כדי לכסות אזורים שונים ברשתית.
        הערה: מיקום כזה ממזער את עקמומיות הרשתית, מה שממקסם את החזר ה- RNFL לאורך ה- FOV. נדרשת ~1 דקות כדי למקם מחדש את העין בין כל רכישה (איור 1A,B).
  5. ניתוח Vis-OCTF
    הערה: MATLAB משמש לביצוע ניתוח תמונות.
    1. ליצירת סיבי vis-OCT מאמצעי האחסון vis-OCT, השתמשו בשיטת סף מבוססת עוצמה (שורת קוד 808 של MATLAB) כדי לזהות את פני הרשתית.
      הערה: קווים אלה משתמשים בפונקציה imadjust כדי להתאים את ערכי העוצמה של bscan. הארגומנט [0.0087 0.08] שהועבר לחוסר התאמה מציין את טווח העוצמות שיש למפות לטווח הדינמי המלא של תמונת הפלט.
    2. חתוך את RNFL על ידי בחירת הראשון ~ 16 מיקרומטר עומק. ראו שורת קוד 782 של Matlab.
      הערה: עובי ה-RNFL האופייני in vivo בעכבר C57BL/6 בוגר מסוג פרא הוא ~14 מיקרומטר ויכול להשתנות בין שיטות סגמנטציה שונות13.
    3. שנו את הנתיבים של קובץ RAW (שורה 9), קבצים לבנייה מחדש (שורה 11) ושם הקובץ (שורה 15), לחצו על ' הפעל' והמתינו לניתוח תמונת OCT באמצעות קוד MATLAB. חשב את הקרנת העוצמה הממוצעת לאורך הכיוון הצירי (z) (שורות קוד MATLAB 905-908) כדי ליצור את תמונת הפיבגרם המורכבת מצרורות אקסון RGC וכלי הדם שמסביב. מונטאז' את ארבע התמונות לאחר עיבוד סיבגרם עבור כל FOV על ידי יישור כלי הדם עם עורך גרפי לבחירה, המכסה ~ 1.2 x 1.2 מ"מ בסך הכל. קובצי RAW נשמרים בדרך כלל בתיקייה: Halo Data, תחת תאריך הדמיית OCT (לדוגמה, 0606 Opticent).
      הערה: קודי MATLAB זמינים בקובץ משלים 1.

2. הדמיה קונפוקלית Ex vivo

  1. המתת חסד של עכבר
    1. לאחר קבלת נתוני vis-OCT, הרדימו את העכברים עם תערובת של נתרן pentobarbital (390 מ"ג / מ"ל) ונתרן phenytoin (50mg / mL). Phenytoin נתרן פונקציות על ידי הגברת ההשפעות של נתרן pentobarbital, אשר יושם באופן נרחב המתת חסד מכרסם14,15. עבור כל עכבר, השתמש ב- 0.2 מ"ל / 20 גרם של תערובת מדוללת (156 מ"ג / מ"ל) ונקב עם 20 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (PBS) ולאחר מכן, 20 מ"ל של 4% פרפורמלדהיד (PFA) ב- PBS16,17.
  2. דיסקציה והתמצאות של העין
    1. לחנך את העיניים ולעשות סימן על הצד הטמפורלי כדי לציין את הכיוון.
    2. לאחר הסרה זהירה של החדר הקדמי, עדשת העין, הזגוגית ומקבעים את המשקפיים ב- PFA למשך 30 דקות.
    3. שטפו את המשקפיים עם PBS למשך 30 דקות, והחליפו את תמיסת PBS 3x במהלך הכביסה. לאחר מכן, שטפו עם 0.5% Triton X-100 ב-PBS (pH 7.5) למשך 30 דקות.
    4. יש לדגור על המשקפיים בחיץ חוסם (5% סרום חמורים עם 2.5% אלבומין בסרום בקר ו-0.5% טריטון X-100 במי מלח חוצצים טריס [pH 7.5]) למשך שעתיים בטמפרטורת החדר.
  3. אימונוסטיין
    הערה: המשקפיים מוכנים כעת להיות מוכתמים עם נוגדנים ראשוניים של עכבר anti-Tuj1 כדי לזהות חבילות אקסון RGC וחולדה anti-ICAM-2 כדי לזהות כלי דם.
    1. יש לדגור על כוסות העיניים למשך הלילה עם הנוגדנים הראשוניים, עכבר אנטי-Tuj1 (1:200 בחיץ חוסם) וחולדה אנטי-ICAM-2 (1:500 בחיץ חוסם), בטמפרטורה של 4°C.
    2. שטפו את המשקפיים 3-5x במשך שעה אחת בכל פעם, עם תמיסת מלח חוצצת פוספט המכילה 0.5% Triton X-100 (PBST) כדי למזער את הרקע ולהסיר נוגדנים לא קשורים.
    3. לאחר השטיפה, יש לדגור על כוסות העיניים למשך הלילה עם הנוגדנים המשניים, חמור אנטי-עכברי אימונוגלובולין G מצומד לצבע אלקסה פלואור 488 (פלואורסצנטיות ירוקה) וחמור נגד חולדה IgG מצומד לצבע אלקסה פלואור 594 (פלואורסצנטיות אדומה), כולם מדוללים בקנ"מ 1:1000 בחיץ חוסם, ב-4°C.
    4. למחרת, שטפו את המשקפיים 3-5x במשך שעה כל אחד עם PBST כדי למזער את הרקע ולהסיר נוגדנים לא קשורים.
    5. מעבירים את המשקפיים לצלחת פטרי של PBS לפני ההרכבה השטוחה.
  4. רשתית שטוחה
    1. לאחר תהליך הצביעה החיסונית, בודדו את הרשתית מהמשקפיים מתחת למיקרוסקופ.
    2. חתכו את הרשתית לארבעה עלים והרכיבו אותם בצורה שטוחה כששכבת ה-RGC פונה כלפי מעלה. השאר את הסימן בצד הרקתי המחובר לרשתית כדי לציין התמצאות.
    3. מכסים את הרשתית באמצעי הרכבה13,18. אטמו את המגלשות בלק13,18,19.
  5. הדמיה קונפוקלית
    הערה: עיבוד התמונה של תמונות קונפוקליות בוצע באמצעות תוכנת ZEN Microscopy.
    1. הפעל את המיקרוסקופ הקונפוקלי, ותחת מצב אתר, מצא את אזור העניין באמצעות עינית המיקרוסקופ.
    2. במצב רכישה, הגדר אריחים לכיסוי כל הרשתית ופרוסות מחסנית z כדי לכסות את כל שכבות המידע. תמונה של לפחות 25 אריחים לאורך הרשתית כולה כדי לכסות את הנפח הכולל של 5.99 מ"מ (x) x 5.88 מ"מ (y) x 30 μm (z) בגודל פיקסל של 1.24 μm/pixel.
    3. הקרן את פרוסות ערימת Z כדי ליצור תמונות דו-ממדיות במיקרוסקופ קונפוקלי (איור 1C,D)11,13,19,20,21.

3. יישור של תמונות in vivo ו- ex vivo

  1. לאחר עיבוד הפיברגרם, צור תמונה מורכבת הכוללת את ארבע התמונות המתקבלות מכל עכבר על ידי יישור כל כלי הדם עם עורך גרפי לפי בחירתך.
    הערה: בממוצע, התמונה הסופית ללא הפרדות צבע היא בערך 1.2 מ"מ (x) x 1.2 מ"מ (y), כפי שמוצג באיור 1B.
  2. השתמש בראש עצב הראייה (ONH) ובתבנית כלי הדם כציוני דרך ליישור הסיב המרוכב. השג את היישור in vivo ו- ex vivo על ידי חפיפה של תבנית כלי הדם של תמונות OCT מרוכבות עם תמונות קונפוקליות של אותה רשתית מוכתמת ב- ICAM-2 .

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

הסיבגרם המרוכב vis-OCT מושווה לתמונה קונפוקלית מקבילה של רשתית שטוחה עם Tuj-1 עבור אקסוני RGC (איור 1D, פאנל עליון). ניתן להתאים צרורות אקסונים שצולמו על ידי vis-OCTF עם חבילות האקסון המסומנות ב- Tu-j1 בתמונה הקונפוקלית. כלי דם בדרך כלל מציגים מבנים מסתעפים מובחנים בהשוואה לצרורות האקסון ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

ישנם שני שלבים בפרוטוקול זה הדורשים תשומת לב. ראשית, יש לוודא כי בעל החיים נמצא תחת הרדמה עמוקה וכי העיניים שלהם מורחבות לחלוטין לפני הדמיה vis-OCT. אם העכברים אינם מורדמים כראוי, נשימתם המהירה עלולה להוביל לתנועות לא יציבות של תמונות הפנים , מה שעלול להשפיע לרעה על איכות הסיבגרם. יתר על כ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

צ'אנג, ס', אין; שו, ו', אין; אוהד, ו', אין; מקדניאל, ג'יי, אין; ד.א. מילר, ללא; מ. גרנוניקו, ללא; מ. ליו, ללא; X. ליו, ללא; לה.פ. ג'אנג יש אינטרסים כלכליים בחברת Opticent Health, שלא תמכה בעבודה זו.

Acknowledgements

מחקר זה נתמך על ידי קרן המחקר DrDeramus Shaffer Grant, 4-CA Cavalier Collaborative Award, R01EY029121, R01EY035088, ו Knights Templar Eye Foundation.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment
Halo 100Opticent Health, Evanston, IL
Zeiss LSM800 microscopeCarl Zeiss
Drugs and antibodies
4% paraformaldehyde (PFA)Santz Cruz Biotechnology, SC-2816921-2 drops
Bovine serum albumin powderFisher Scientific, BP9706-1001:10
Donkey anti Mouse Alexa Fluor 488 dyeThermo Fisher Scientific, Cat# A-212021:1,000
Donkey anti rat Alexa Fluor 594 dyeThermo Fisher Scientific, Cat# A-212091:1,000
Euthasol (a mixture of pentobarbital sodium (390 mg/mL) and phenytoin sodium (50 mg/mL))Covetrus, NDC 11695-4860-115.6 mg/mL
KetamineCovetrus, NADA043304114 mg/kg
Mouse anti-Tuj1A gift from Anthony J. Spano, University of Virginia1:200
Normal donkey serum(NDS)Millipore Sigma, S30-100 mL1:100
Phosphate-buffered saline (PBS, 10x), pH 7.4
(Contains 1370 mM NaCl, 27 mM KCl, 80 mM Na2HPO4, and 20 mM KH2PO4)		Thermo Fisher Scientific, Cat# J62036.K31:10
Rat anti-ICAM-2BD Pharmingen, Cat#5533251:500
Tropicamide drops Covetrus, NDC17478-102-12
Triton X-100
(Reagent Grade)		VWR, CAS: 9002-93-11:20
Vectashield mounting mediumVector Laboratories Inc. H2000-10
XylazineCovetrus, NDC59399-110-2017 mg/kg

References

  1. Sernagor, E., Eglen, S. J., Wong, R. O. Development of retinal ganglion cell structure and function. Progress in Retinal and Eye Research. 20 (2), 139-174 (2001).
  2. Sanes, J. R., Masland, R. H. The types of retinal ganglion cells: current status and implications for neuronal classification. Annual Review of Neuroscience. 38, 221-246 (2015).
  3. Seabrook, T. A., Burbridge, T. J., Crair, M. C., Huberman, A. D. Architecture, function, and assembly of the mouse visual system. Annual Review of Neuroscience. 40, 499-538 (2017).
  4. Cang, J., Savier, E., Barchini, J., Liu, X. Visual function, organization, and development of the mouse superior colliculus. Annual Review of Vision Science. 4, 239-262 (2018).
  5. Quigley, H. A. Understanding glaucomatous optic neuropathy: the synergy between clinical observation and investigation. Annual Review of Vision Science. 2, 235-254 (2016).
  6. Whitmore, A. V., Libby, R. T., John, S. W. Glaucoma: thinking in new ways-a role for autonomous axonal self-destruction and other compartmentalised processes. Progress in Retinal and Eye Research. 24 (6), 639-662 (2005).
  7. Syc-Mazurek, S. B., Libby, R. T. Axon injury signaling and compartmentalized injury response in glaucoma. Progress in Retinal and Eye Research. 73, 100769(2019).
  8. Puyang, Z., Chen, H., Liu, X. Subtype-dependent morphological and functional degeneration of retinal ganglion cells in mouse models of experimental glaucoma. Journal of Nature and Science. 1 (5), (2015).
  9. Tatham, A. J., Medeiros, F. A. Detecting structural progression in glaucoma with optical coherence tomography. Ophthalmology. 124, S57-S65 (2017).
  10. Shu, X., Beckmann, L., Zhang, H. Visible-light optical coherence tomography: a review. Journal of Biomedical Optics. 22 (12), 1-14 (2017).
  11. Miller, D. A., et al. Visible-light optical coherence tomography fibergraphy for quantitative imaging of retinal ganglion cell axon bundles. Translational Vision Science and Technology. 9 (11), (2020).
  12. Beckmann, L., et al. In vivo imaging of the inner retinal layer structure in mice after eye-opening using visible-light optical coherence tomography. Experimental Eye Research. 211, 108756(2021).
  13. Grannonico, M., et al. Global and regional damages in retinal ganglion cell axon bundles monitored non-invasively by visible-light optical coherence tomography fibergraphy. Journal of Neuroscience. 41 (49), 10179-10193 (2021).
  14. Allen-Worthington, K. H., Brice, A. K., Marx, J. O., Hankenson, F. C. Intraperitoneal Injection of Ethanol for the Euthanasia of Laboratory Mice (Mus musculus) and Rats (Rattus norvegicus). J Am Assoc Lab Anim Sci. 54 (6), 769-778 (2015).
  15. Boivin, G. P., Bottomley, M. A., Schiml, P. A., Goss, L., Grobe, N. Physiologic, Behavioral, and Histologic Responses to Various Euthanasia Methods in C57BL/6NTac Male Mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 56 (1), 69-78 (2017).
  16. Chen, H., et al. Progressive degeneration of retinal and superior collicular functions in mice with sustained ocular hypertension. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 56 (3), 1971-1984 (2015).
  17. Feng, L., Chen, H., Suyeoka, G., Liu, X. A laser-induced mouse model of chronic ocular hypertension to characterize visual defects. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 78 (78), (2013).
  18. Gao, J., et al. Differential effects of experimental glaucoma on intrinsically photosensitive retinal ganglion cells in mice. Journal of Comparative Neurology. 530 (9), 1494-1506 (2022).
  19. Thomson, B. R., et al. Angiopoietin-1 knockout mice as a genetic model of open-angle glaucoma. Translational Vision Science and Technology. 9 (4), (2020).
  20. Feng, L., et al. Sustained ocular hypertension induces dendritic degeneration of mouse retinal ganglion cells that depends on cell type and location. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 54 (2), 1106-1117 (2013).
  21. Grannonico, M., et al. Longitudinal analysis of retinal ganglion cell damage at individual axon bundle level in mice using visible-light optical coherence tomography fibergraphy. Translational Vision Science and Technology. 12 (5), (2023).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

in vivoEx vivovis OCTF

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved