Alinhamento de Fibrogramas de Tomografia de Coerência Óptica com Luz Visível com Imagens Confocais da Mesma Retina de Camundongo

Resumo

O presente protocolo descreve os passos para o alinhamento in vivo de imagens de fibrografia por tomografia de coerência óptica de luz visível (vis-OCTF) com imagens confocais ex vivo da mesma retina de camundongos com o objetivo de verificar a morfologia do feixe axonal de células ganglionares da retina observada nas imagens in vivo.

Resumo

Nos últimos anos, a imagem in vivo da retina, que fornece informações não invasivas, em tempo real e longitudinais sobre sistemas e processos biológicos, tem sido cada vez mais aplicada para obter uma avaliação objetiva do dano neural em doenças oculares. Imagens confocais ex vivo da mesma retina são frequentemente necessárias para validar os achados in vivo , especialmente em pesquisas com animais. Neste estudo, demonstramos um método para alinhar uma imagem confocal ex vivo da retina de camundongos com suas imagens in vivo . Uma nova tecnologia de imagem pronta para uso clínico chamada fibra de tomografia de coerência óptica de luz visível (vis-OCTF) foi aplicada para adquirir imagens in vivo da retina de camundongos. Em seguida, realizamos a imagem confocal da mesma retina como "padrão ouro" para validar as imagens in vivo vis-OCTF. Este estudo não só permite uma investigação mais aprofundada dos mecanismos moleculares e celulares, mas também estabelece uma base para uma avaliação sensível e objetiva do dano neural in vivo.

Introdução

As células ganglionares da retina (CGRs) desempenham um papel crítico no processamento da informação visual, recebendo entradas sinápticas através de suas árvores dendríticas na camada plexiforme interna (LIP) e transmitindo a informação através de seus axônios na camada de fibras nervosas da retina (CFNR) para o cérebro 1,2,3,4. Em condições de doença como o glaucoma, a degeneração precoce do CGR pode resultar em alterações sutis na CFNR, na camada de células ganglionares (LCG), na LIP e no nervo óptico, tanto em pacientes quanto^{em modelos de} roedores5,6,7,8,9. A detecção precoce dessas alterações morfológicas nos CGRs é, portanto, essencial para uma intervenção oportuna na prevenção do CGR e da perda da visão.

Recentemente, desenvolvemos uma nova tecnologia de imagem pronta para uso clínico chamada tomografia de coerência óptica com luz visível (vis-OCT) para satisfazer a necessidade de monitoramento in vivo dos danos do CGR. O Vis-OCT melhorou a resolução axial, atingindo 1,3 μm na^retina10,11, permitindo a visualização de feixes axonais RGC individuais na CFNR. Posteriormente, a fibrografia vis-OCT (vis-OCTF) foi estabelecida para rastrear e quantificar o dano do CGR no nível do feixe axônio único em^{camundongos 11,12,13}. No entanto, imagens confocais ex vivo da mesma retina do padrão-ouro são frequentemente necessárias para validar os achados in vivo. Portanto, este estudo demonstrará como alinhar imagens in vivo adquiridas por vis-OCTF com imagens confocais ex vivo da mesma retina de camundongo. O protocolo visa validar os achados in vivo por imagens confocais ex vivo e estabelecer uma base para examinar as alterações moleculares e celulares subjacentes ao dano RGC em condições doentes.

Protocolo

Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade da Virgínia e estão em conformidade com a diretriz sobre Uso de Animais do National Institute of Health (NIH). Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados a todos os materiais, reagentes e instrumentos usados neste protocolo.

1. Imagem in vivo vis-OCT

1. O sistema vis-OCT
   1. Imagine os olhos dos ratos usando um pequeno sistema de animais vis-OCT que usa uma fonte de luz supercontínua, que fornece iluminação de luz visível entre 480 nm e 650 nm. Certifique-se de que a potência incidente na córnea é de 1 mW e use uma taxa de linha A de 25 kHz e um tempo de integração de 39,3 μs por linha A.
   2. Certifique-se de que a faixa de detecção espectral do espectrômetro esteja entre 508 nm e 613 nm, o que fornece uma resolução axial de 1,3 μm na retina. O volume total de imagem é de aproximadamente 700 μm (x) x 700 μm (y) x 1.500 μm (z). A resolução lateral está entre 4,5 μm no centro do campo de visão e 8,7 μm a 350 μm do centro^11,13.
2. Anestesia em camundongos
   1. Anestesiar camundongos de fundo C57BL/6 e ambos os sexos com uma injeção intraperitoneal de coquetel de Cetamina (114 mg/kg) e Xilazina (17 mg/kg) e dilatar suas pupilas usando gotas de tropicamida a 1%. Confirmar anestesia adequada por perda do reflexo pedal após um pinçamento firme dos dedos.
   2. Durante a geração de imagens, mantenha o mouse aquecido usando uma lâmpada de calor infravermelha. Após cada aquisição das imagens, aplicar lágrimas artificiais para evitar a desidratação da córnea.
3. Posicionamento do mouse para obtenção de imagens
   1. Coloque o rato anestesiado no suporte do animal e mantenha o rato na posição com a ajuda de duas Velcro correias.
      NOTA: O suporte do animal permite o movimento em três dimensões (ajuste vertical, ajuste horizontal fino, bem como ajustes de passo e guiada) para colocar o laser no olho do mouse.
4. Ajuste dos parâmetros de imagem
   1. Ligue o computador e abra o software referenciado, que ligará o laser automaticamente.
   2. Ajuste o suporte do animal até que o laser esteja estável e centralizado no olho do rato. Visualize a parte posterior do olho através de uma visualização En Face na interface do software, o campo de visão (FOV) do plexo vascular superficial e um B-scan, a secção transversal da retina dentro do FOV.
   3. Adquira um volume vis-OCT clicando no botão Adquirir na interface do software depois de realizar pequenos ajustes do foco óptico, que consiste em 512 A-lines/B-scan e 512 B-scans/volume.
      Observação : esse processo leva ~ 10,5 s. A aquisição de imagens é guiada por um estimador de índice de qualidade (QI) embutido para garantir que imagens abaixo de um limiar pré-determinado (QI < 45) não sejam incluídas.
      1. Para cada rato, adquira quatro volumes vis-OCT do mesmo olho. Alinhe a cabeça do nervo óptico (ONH) em cada um dos quatro cantos do FOV para cobrir diferentes áreas da retina.
         NOTA: Esta colocação minimiza a curvatura da retina, o que maximiza a reflectância da CFNR ao longo do FOV. Requer ~1 min para reposicionar o olho entre cada aquisição (Figura 1A,B).
5. Análise Vis-OCTF
   NOTA: MATLAB é usado para executar análise de imagem.
   1. Para gerar fibrogramas vis-OCT a partir do volume vis-OCT, use um método de limiar baseado em intensidade (linha de código MATLAB 808) para detectar a superfície da retina.
      Observação : essas linhas usam a função imadjust para ajustar os valores de intensidade do bscan. O argumento [0,0087 0,08] passado para imadjust especifica o intervalo de intensidades a ser mapeado para o intervalo dinâmico completo da imagem de saída.
   2. Corte o RNFL selecionando o primeiro ~16 μm em profundidade. Consulte a linha de código Matlab 782.
      NOTA: A espessura RNFL in vivo típica em um camundongo C57BL/6 selvagem adulto é de ~14 μm e pode variar entre diferentes métodos de segmentação¹³.
   3. Altere os caminhos do arquivo RAW (linha 9), Arquivos para reconstrução (linha 11) e nome do arquivo (linha 15), clique em Executar e aguarde até que a imagem da OCT seja analisada pelo código MATLAB. Calcular a projeção de intensidade média ao longo da direção axial (z) (linhas de código MATLAB 905-908) para gerar a imagem de fibrograma composta por feixes axonais RGC e vasculatura circundante. Monte as quatro imagens após o processamento do fibrograma para cada FOV alinhando os vasos sanguíneos com um editor gráfico de escolha, cobrindo ~1,2 x 1,2 mm no total. Os arquivos RAW geralmente são salvos na pasta: Halo Data, sob a data da imagem da OCT (por exemplo, 0606 Opticent).
      Observação : os códigos MATLAB estão disponíveis no arquivo suplementar 1.

2. Imagem confocal ex vivo

1. Eutanásia em camundongos
   1. Após a aquisição dos dados vis-OCT, eutanasiar os camundongos com uma mistura de pentobarbital sódico (390 mg/mL) e fenitoína sódica (50mg/mL). A fenitoína sódica tem função amplificando os efeitos do pentobarbital sódico, que tem sido amplamente aplicado na eutanásia de roedores^14,15. Para cada camundongo, utilizar 0,2 mL/20 g da mistura diluída (156 mg/mL) e perfundir com 20 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) e, em seguida, 20 mL de paraformaldeído (PFA) a 4% em PBS^16,17.
2. Dissecção e orientação ocular
   1. Enuclear os olhos e fazer uma marca no lado temporal para indicar a orientação.
   2. Após a remoção cuidadosa da câmara anterior, a lente ocular, vítreo, e fixar os óculos em PFA por 30 min.
   3. Lave os óculos com PBS por 30 min e substitua a solução PBS 3x durante a lavagem. Em seguida, lavar com Triton X-100 a 0,5% em PBS (pH 7,5) por 30 min.
   4. Incubar as oculares em tampão de bloqueio (soro de burro a 5% com albumina de soro bovino a 2,5% e Triton X-100 a 0,5% em solução salina tamponada com Tris [pH 7,5]) por 2 h à temperatura ambiente.
3. Imunomarcação
   NOTA: Os óculos estão agora prontos para serem corados com os anticorpos primários de camundongo anti-Tuj1 para detectar feixes de axônio RGC e rato anti-ICAM-2 para detectar vasos sanguíneos.
   1. Incubar os copos oculares durante a noite com os anticorpos primários, anti-Tuj1 de rato (1:200 em tampão de bloqueio) e anti-ICAM-2 de rato (1:500 em tampão de bloqueio), a 4 °C.
   2. Lave os óculos 3-5x por 1 h cada vez, com uma solução salina tamponada com fosfato contendo Triton X-100 a 0,5% (PBST) para minimizar o fundo e remover qualquer anticorpo não ligado.
   3. Após a lavagem, incubar os copos oculares durante a noite com os anticorpos secundários, burro anti-camundongo Imunoglobulina G conjugada ao corante Alexa Fluor 488 (fluorescência verde) e IgG anti-rato de burro conjugado ao corante Alexa Fluor 594 (fluorescência vermelha), todos diluídos 1:1000 em tampão de bloqueio, a 4 °C.
   4. No dia seguinte, lave os óculos 3-5x por 1 h cada com PBST para minimizar o fundo e remover o anticorpo não ligado.
   5. Transfira as oculares para uma placa de Petri de PBS antes da montagem plana.
4. Retina plana
   1. Após o processo de imunomarcação, isole as retinas das oculares ao microscópio.
   2. Corte as retinas em quatro folhas e monte-as planas com a camada RGC virada para cima. Deixe a marca no lado temporal preso à retina para indicar a orientação.
   3. Cobrir as retinas com meio^{de montagem 13,18}. Selar as lâminas com esmalte^13,18,19.
5. Imagem confocal
   OBS: O processamento das imagens confocais foi realizado utilizando o software ZEN Microscopy.
   1. Ligue o microscópio confocal e, no modo Localizar, encontre a área de interesse usando a ocular do microscópio.
   2. No modo de aquisição, configure blocos para cobrir toda a retina e fatias z-stack para cobrir todas as camadas de informações. Imagem de pelo menos 25 blocos em toda a retina para cobrir o volume total de 5,99 mm (x) x 5,88 mm (y) x 30 μm (z) a um tamanho de pixel de 1,24 μm/pixel.
   3. Projetar os cortes Z-stack para criar imagens de microscopia confocal bidimensional en face (Figura 1C,D)11,13,19,20,21.

3. Alinhamento de imagens in vivo e ex vivo

1. Depois de processar o fibrograma, crie uma imagem composta que inclua as quatro imagens adquiridas de cada mouse, alinhando todos os vasos sanguíneos com um editor gráfico de escolha.
   NOTA: Em média, a imagem composta final é de aproximadamente 1,2 mm (x) x 1,2 mm (y), conforme mostrado na Figura 1B.
2. Use a cabeça do nervo óptico (ONH) e o padrão dos vasos sanguíneos como pontos de referência para alinhar o fibrograma composto. Obter o alinhamento in vivo e ex vivo sobrepondo o padrão dos vasos sanguíneos das imagens compostas de OCT com as imagens confocais da mesma retina coradas com ICAM-2.

Resultados

O fibrograma composto vis-OCT é comparado com a imagem confocal correspondente de retina plana imunomarcada com Tuj-1 para axônios RGC (Figura 1D, painel superior). Os feixes de axônio fotografados por vis-OCTF podem ser combinados com os feixes de axônios marcados com Tu-j1 na imagem confocal. Os vasos sanguíneos geralmente exibem estruturas ramificadas distinguíveis em comparação com feixes axonais circundantes em imagens de fibrograma, que podem ser combinados com os vasos sanguí...

Discussão

Há duas etapas nesse protocolo que requerem atenção. Primeiro, é necessário garantir que o animal esteja sob anestesia profunda e que seus olhos estejam totalmente dilatados antes da realização de exames de OCT. Se os camundongos não estiverem adequadamente anestesiados, sua respiração rápida pode levar a movimentos instáveis das imagens da face em face , o que pode afetar negativamente a qualidade do fibrograma. Além disso, a dilatação insuficiente também pode ter um impacto negativo na qualidad...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Halo 100	Opticent Health, Evanston, IL
Zeiss LSM800 microscope	Carl Zeiss
Drugs and antibodies
4% paraformaldehyde (PFA)	Santz Cruz Biotechnology, SC-281692		1-2 drops
Bovine serum albumin powder	Fisher Scientific, BP9706-100		1:10
Donkey anti Mouse Alexa Fluor 488 dye	Thermo Fisher Scientific, Cat# A-21202		1:1,000
Donkey anti rat Alexa Fluor 594 dye	Thermo Fisher Scientific, Cat# A-21209		1:1,000
Euthasol (a mixture of pentobarbital sodium (390 mg/mL) and phenytoin sodium (50 mg/mL))	Covetrus, NDC 11695-4860-1		15.6 mg/mL
Ketamine	Covetrus, NADA043304		114 mg/kg
Mouse anti-Tuj1	A gift from Anthony J. Spano, University of Virginia		1:200
Normal donkey serum(NDS)	Millipore Sigma, S30-100 mL		1:100
Phosphate-buffered saline (PBS, 10x), pH 7.4 (Contains 1370 mM NaCl, 27 mM KCl, 80 mM Na2HPO4, and 20 mM KH2PO4)	Thermo Fisher Scientific, Cat# J62036.K3		1:10
Rat anti-ICAM-2	BD Pharmingen, Cat#553325		1:500
Tropicamide drops	Covetrus, NDC17478-102-12
Triton X-100 (Reagent Grade)	VWR, CAS: 9002-93-1		1:20
Vectashield mounting medium	Vector Laboratories Inc. H2000-10
Xylazine	Covetrus, NDC59399-110-20		17 mg/kg