АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В настоящем протоколе описаны шаги по совмещению in vivo изображений оптической когерентной томографии в видимом свете (vis-OCTF) с конфокальными изображениями той же сетчатки мыши ex vivo с целью верификации наблюдаемой морфологии пучка аксонов ганглиозных клеток сетчатки на изображениях in vivo.

Аннотация

В последние годы визуализация сетчатки in vivo , которая предоставляет неинвазивную информацию о биологических системах и процессах в режиме реального времени и в течение длительного времени, все чаще применяется для получения объективной оценки повреждения нейронов при заболеваниях глаз. Конфокальная визуализация одной и той же сетчатки ex vivo часто необходима для подтверждения результатов in vivo , особенно в исследованиях на животных. В данной работе мы продемонстрировали метод выравнивания конфокального изображения сетчатки мыши ex vivo с ее изображениями in vivo . Новая клинически готовая технология визуализации, называемая оптической когерентной томографией видимого света (vis-OCTF), была применена для получения изображений сетчатки мыши in vivo . Затем мы выполнили конфокальную визуализацию той же сетчатки, что является «золотым стандартом», чтобы проверить изображения in vivo по сравнению с OCTF. Это исследование не только позволяет глубже изучить молекулярные и клеточные механизмы, но и закладывает основу для чувствительной и объективной оценки нейронных повреждений in vivo.

Введение

Ганглиозные клетки сетчатки (RGC) играют важнейшую роль в обработке визуальной информации, получая синаптические входы через свои дендритные деревья во внутреннем плексиформном слое (IPL) и передавая информацию через свои аксоны в слое нервных волокон сетчатки (RNFL) в мозг 1,2,3,4. При таких заболеваниях, как глаукома, ранняя дегенерация RGC может привести к незначительным изменениям в RNFL, слое ганглиозных клеток (GCL), IPL и зрительном нерве как у пациентов, так и у грызуновмоделей 5,6,7,8,9. Таким образом, раннее выявление этих морфологических изменений в РГК имеет важное значение для своевременного вмешательства для предотвращения РГК и потери зрения.

Недавно мы разработали новую клинически готовую технологию визуализации, называемую оптической когерентной томографией видимого света (vis-OCT), чтобы удовлетворить потребность в мониторинге повреждений RGC in vivo. Vis-OCT улучшил осевое разрешение, достигнув 1,3 мкм в сетчатке10,11, что позволило визуализировать отдельные пучки аксонов RGC в RNFL. Впоследствии была создана виз-ОКТ-фибрография (vis-OCTF) для отслеживания и количественной оценки повреждений RGC на уровне пучка одиночных аксонов у мышей11,12,13. Тем не менее, конфокальная визуализация ex vivo той же сетчатки, что является золотым стандартом, часто необходима для подтверждения результатов in vivo. Таким образом, это исследование продемонстрирует, как выровнять изображения in vivo, полученные vis-OCTF, с конфокальными изображениями той же сетчатки мыши ex vivo. Протокол направлен на валидацию результатов in vivo с помощью конфокальной визуализации ex vivo и создание основы для изучения молекулярных и клеточных изменений, лежащих в основе повреждения RGC при болезненных состояниях.

протокол

Все процедуры для животных были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию в Университете Вирджинии и соответствовали рекомендациям по использованию животных Национального института здравоохранения (NIH). См. Таблицу материалов для получения подробной информации, связанной со всеми материалами, реагентами и инструментами, используемыми в этом протоколе.

1. Визуализация in vivo по сравнению с ОКТ

  1. Система vis-OCT
    1. Визуализируйте глаза мышей с помощью системы vis-OCT для небольших животных, которая использует источник света суперконтинуума, который обеспечивает освещение в видимом свете в диапазоне от 480 нм до 650 нм. Убедитесь, что мощность, падающая на роговицу, составляет 1 мВт, и используйте частоту линии А 25 кГц и время интегрирования 39,3 мкс на линию А.
    2. Убедитесь, что спектральный диапазон обнаружения спектрометра составляет от 508 нм до 613 нм, что обеспечивает осевое разрешение 1,3 мкм в сетчатке. Общий объем изображения составляет приблизительно 700 мкм (x) x 700 мкм (y) x 1 500 мкм (z). Боковое разрешение составляет от 4,5 мкм в центре поля зрения до 8,7 мкм на расстоянии 350 мкм от центра11,13.
  2. Мышиная анестезия
    1. Обезболивайте мышей с фоном C57BL/6 и любого пола внутрибрюшинной инъекцией коктейля из кетамина (114 мг/кг) и ксилазина (17 мг/кг) и расширяйте их зрачки с помощью 1% капли тропикамида. Подтвердите адекватное обезболивание потерей педального рефлекса после сильного защемления пальца ноги.
    2. Во время визуализации держите мышь в тепле с помощью инфракрасной тепловой лампы. После каждого получения изображения наносите искусственные слезы, чтобы предотвратить обезвоживание роговицы.
  3. Позиционирование мыши для визуализации
    1. Поместите обезболивающую мышь на держатель для животных и удерживайте мышь в нужном положении с помощью двух Velcro ремней.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Держатель для животных позволяет перемещаться в трех измерениях (вертикальная регулировка, точная горизонтальная регулировка, а также регулировка тангажа и рыскания), чтобы поместить лазер в глаз мыши.
  4. Настройка параметров визуализации
    1. Включите компьютер и откройте указанное программное обеспечение, которое автоматически включит лазер.
    2. Отрегулируйте держатель для животных до тех пор, пока лазер не станет стабильным и не будет центрирован в глазу мыши. Визуализируйте заднюю часть глаза с помощью предварительного просмотра En Face в программном интерфейсе, поля зрения (FOV) поверхностного сосудистого сплетения и B-скана, поперечного сечения сетчатки в поле зрения.
    3. Чтобы получить видимый ОКТ-том, нажмите кнопку Take (Получить ) в интерфейсе программного обеспечения после выполнения незначительной настройки оптического фокуса, который состоит из 512 А-линий/B-скана и 512 B-сканов/объема.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот процесс занимает ~10,5 с. Получение изображений осуществляется с помощью встроенного средства оценки индекса качества (QI), чтобы гарантировать, что изображения ниже заданного порогового значения (QI < 45) не будут включены.
      1. Для каждой мыши возьмите четыре виз-ОКТ-тома из одного и того же глаза. Выровняйте головку зрительного нерва (ONH) в каждом из четырех углов в поле зрения, чтобы охватить разные области сетчатки.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Такое размещение сводит к минимуму кривизну сетчатки, что максимизирует отражение RNFL по всему полю зрения. Требуется ~1 минута, чтобы изменить положение глаза между каждым захватом (рис. 1A, B).
  5. Анализ по отношению к OCTF
    ПРИМЕЧАНИЕ: MATLAB используется для анализа изображений.
    1. Чтобы получить виз-ОКТ-фиброграммы из объема виз-ОКТ, используйте пороговый метод на основе интенсивности (кодовая строка MATLAB 808) для определения поверхности сетчатки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти линии используют функцию imadjust для регулировки значений интенсивности bscan. Аргумент [0.0087, 0.08], передаваемый в imadjust , задает диапазон интенсивностей для сопоставления с полным динамическим диапазоном выходного изображения.
    2. Обрежьте RNFL, выделив первые ~16 мкм в глубину. Смотрите строку кода Matlab 782.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Типичная толщина RNFL in vivo у взрослой мыши дикого типа C57BL/6 составляет ~14 мкм и может варьироваться в зависимости от различных методов сегментации13.
    3. Измените пути к RAW-файлу (строка 9), Файлы для реконструкции (строка 11) и имя файла (строка 15), нажмите кнопку Run и дождитесь анализа OCT-изображения кодом MATLAB. Рассчитайте проекцию средней интенсивности вдоль осевого (z) направления (кодовые строки MATLAB 905-908) для получения фиброграммы, состоящей из пучков аксонов RGC и окружающих их сосудов. Смонтируйте четыре изображения после обработки фиброграммы для каждого поля зрения, совместив кровеносные сосуды с помощью графического редактора по выбору, охватывая в общей сложности ~1,2 x 1,2 мм. Файлы RAW обычно сохраняются в папке: Halo Data, под датой ОКТ-изображения (например, 0606 Opticent).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Коды MATLAB доступны в Дополнительном файле 1.

2. Конфокальная визуализация ex vivo

  1. Эвтаназия мышей
    1. После получения данных vis-OCT усыпляйте мышей смесью пентобарбитала натрия (390 мг/мл) и фенитоина натрия (50 мг/мл). Фенитоин натрия функционирует, усиливая действие пентобарбитала натрия, который широко применяется при эвтаназии грызунов14,15. Для каждой мыши используют 0,2 мл/20 г разбавленной смеси (156 мг/мл) и переливают 20 мл фосфатно-солевого буфера (PBS), а затем 20 мл 4% параформальдегида (PFA) в PBS16,17.
  2. Вскрытие и ориентация глаз
    1. Сделайте энуклеацию глаз и отметьте на височной стороне, чтобы обозначить ориентацию.
    2. После осторожного удаления передней камеры, линзы глаза, стекловидного тела и фиксируют наглазники в ПФА в течение 30 мин.
    3. Промойте наглазники PBS в течение 30 минут и замените раствор PBS 3 раза во время промывки. Затем промыть 0,5% Triton X-100 в PBS (pH 7,5) в течение 30 мин.
    4. Инкубируйте наглазники в блокирующем буфере (5% ослиная сыворотка с 2,5% бычьим сывороточным альбумином и 0,5% Triton X-100 в трис-буферном физиологическом растворе [pH 7,5]) в течение 2 ч при комнатной температуре.
  3. Иммуноокрашивание
    ПРИМЕЧАНИЕ: Наглазники теперь готовы к окрашиванию первичными антителами мышиного анти-Tuj1 для обнаружения пучков аксонов RGC и крысиного анти-ICAM-2 для обнаружения кровеносных сосудов.
    1. Инкубируйте наглазники в течение ночи с первичными антителами, мышиным анти-Tuj1 (1:200 в блокирующем буфере) и крысиным анти-ICAM-2 (1:500 в блокирующем буфере) при 4 °C.
    2. Промывайте наглазники 3-5 раз в течение 1 ч каждый раз фосфатно-буферным солевым раствором, содержащим 0,5% Triton X-100 (PBST), чтобы свести к минимуму фон и удалить любые несвязанные антитела.
    3. После промывания инкубируйте чашки глаз в течение ночи со вторичными антителами, антимышиным иммуноглобулином G, конъюгированным с красителем Alexa Fluor 488 (зеленая флуоресценция) и ослиным антикрысиным IgG, конъюгированным с красителем Alexa Fluor 594 (красная флуоресценция), все они разбавлены 1:1000 в блокирующем буфере при 4 °C.
    4. На следующий день промыть наглазники 3-5 раз в течение 1 ч каждый PBST, чтобы свести к минимуму фон и удалить несвязанные антитела.
    5. Перенесите наглазники в чашку Петри PBS перед плоским креплением.
  4. Плоская сетчатка глаза
    1. После процесса иммуноокрашивания изолируйте сетчатку от наглазников под микроскопом.
    2. Разрежьте сетчатку на четыре листа и приложите их слоем RGC вверх. Оставьте метку на височной стороне, прикрепленной к сетчатке, чтобы обозначить ориентацию.
    3. Покройте сетчатку сетчатки монтажным средством13,18. Запечатайте предметные стекла лаком для ногтей13,18,19.
  5. Конфокальная визуализация
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обработка конфокальных изображений проводилась с помощью программного обеспечения для микроскопии ZEN.
    1. Включите конфокальный микроскоп и в режиме определения местоположения найдите интересующую область с помощью окуляра микроскопа.
    2. В режиме сбора данных настройте плитки так, чтобы они покрывали весь сетчатый экран, и срезы z-стека, чтобы покрыть все слои информации. Изобразите не менее 25 плиток по всей сетчатке, чтобы покрыть общий объем 5,99 мм (x) x 5,88 мм (y) x 30 мкм (z) при размере пикселя 1,24 мкм/пиксель.
    3. Спроецируйте срезы Z-стека для создания двумерных изображений конфокальной микроскопии на грани (рис. 1C,D)11,13,19,20,21.

3. Совмещение изображений in vivo и ex vivo

  1. После обработки фиброграммы создайте составное изображение, включающее четыре изображения, полученные от каждой мыши, выровняв все кровеносные сосуды с помощью выбранного графического редактора.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В среднем итоговое составное изображение составляет приблизительно 1,2 мм (x) x 1,2 мм (y), как показано на рисунке 1B.
  2. Используйте головку зрительного нерва (ONH) и рисунок кровеносных сосудов в качестве ориентиров для выравнивания композитной фиброграммы. Получение выравнивания in vivo и ex vivo путем наложения рисунка кровеносных сосудов составных ОКТ-изображений на конфокальные изображения той же сетчатки, окрашенной ICAM-2.

Результаты

Композитная фиброграмма vis-OCT сравнивается с соответствующим конфокальным изображением плоской сетчатки, окрашенной Tuj-1 для аксонов RGC (рис. 1D, верхняя панель). Пучки аксонов, полученные с помощью vis-OCTF, могут быть сопоставлены с пучками аксонов, помеченными Tu-j1 на конфока?...

Обсуждение

В этом протоколе есть два этапа, которые требуют внимания. Во-первых, перед ОКТ-визуализацией необходимо убедиться, что животное находится под глубоким наркозом и что его глаза полностью расширены. Если мыши не находятся под адекватным наркозом, их учащенное дыхание может привести к не?...

Раскрытие информации

Чанг, С., Нет; Сюй, В., Нет; Фан, В., Нет; Макдэниел, Дж.А., Нет; Д.А. Миллер, Никакой; М. Граннонико, Никакой; М. Лю, Никакой; С. Лю, Никакой; Х.Ф. Чжан имеет финансовые интересы в компании Opticent Health, которая не поддержала эту работу.

Благодарности

Это исследование поддержано Фондом исследования глаукомы, Грантом Шаффера, 4-CA Cavalier Collaborative Award, R01EY029121, R01EY035088 и Knights Templar Eye Foundation.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment
Halo 100Opticent Health, Evanston, IL
Zeiss LSM800 microscopeCarl Zeiss
Drugs and antibodies
4% paraformaldehyde (PFA)Santz Cruz Biotechnology, SC-2816921-2 drops
Bovine serum albumin powderFisher Scientific, BP9706-1001:10
Donkey anti Mouse Alexa Fluor 488 dyeThermo Fisher Scientific, Cat# A-212021:1,000
Donkey anti rat Alexa Fluor 594 dyeThermo Fisher Scientific, Cat# A-212091:1,000
Euthasol (a mixture of pentobarbital sodium (390 mg/mL) and phenytoin sodium (50 mg/mL))Covetrus, NDC 11695-4860-115.6 mg/mL
KetamineCovetrus, NADA043304114 mg/kg
Mouse anti-Tuj1A gift from Anthony J. Spano, University of Virginia1:200
Normal donkey serum(NDS)Millipore Sigma, S30-100 mL1:100
Phosphate-buffered saline (PBS, 10x), pH 7.4
(Contains 1370 mM NaCl, 27 mM KCl, 80 mM Na2HPO4, and 20 mM KH2PO4)		Thermo Fisher Scientific, Cat# J62036.K31:10
Rat anti-ICAM-2BD Pharmingen, Cat#5533251:500
Tropicamide drops Covetrus, NDC17478-102-12
Triton X-100
(Reagent Grade)		VWR, CAS: 9002-93-11:20
Vectashield mounting mediumVector Laboratories Inc. H2000-10
XylazineCovetrus, NDC59399-110-2017 mg/kg

Ссылки

  1. Sernagor, E., Eglen, S. J., Wong, R. O. Development of retinal ganglion cell structure and function. Progress in Retinal and Eye Research. 20 (2), 139-174 (2001).
  2. Sanes, J. R., Masland, R. H. The types of retinal ganglion cells: current status and implications for neuronal classification. Annual Review of Neuroscience. 38, 221-246 (2015).
  3. Seabrook, T. A., Burbridge, T. J., Crair, M. C., Huberman, A. D. Architecture, function, and assembly of the mouse visual system. Annual Review of Neuroscience. 40, 499-538 (2017).
  4. Cang, J., Savier, E., Barchini, J., Liu, X. Visual function, organization, and development of the mouse superior colliculus. Annual Review of Vision Science. 4, 239-262 (2018).
  5. Quigley, H. A. Understanding glaucomatous optic neuropathy: the synergy between clinical observation and investigation. Annual Review of Vision Science. 2, 235-254 (2016).
  6. Whitmore, A. V., Libby, R. T., John, S. W. Glaucoma: thinking in new ways-a role for autonomous axonal self-destruction and other compartmentalised processes. Progress in Retinal and Eye Research. 24 (6), 639-662 (2005).
  7. Syc-Mazurek, S. B., Libby, R. T. Axon injury signaling and compartmentalized injury response in glaucoma. Progress in Retinal and Eye Research. 73, 100769 (2019).
  8. Puyang, Z., Chen, H., Liu, X. Subtype-dependent morphological and functional degeneration of retinal ganglion cells in mouse models of experimental glaucoma. Journal of Nature and Science. 1 (5), (2015).
  9. Tatham, A. J., Medeiros, F. A. Detecting structural progression in glaucoma with optical coherence tomography. Ophthalmology. 124, S57-S65 (2017).
  10. Shu, X., Beckmann, L., Zhang, H. Visible-light optical coherence tomography: a review. Journal of Biomedical Optics. 22 (12), 1-14 (2017).
  11. Miller, D. A., et al. Visible-light optical coherence tomography fibergraphy for quantitative imaging of retinal ganglion cell axon bundles. Translational Vision Science and Technology. 9 (11), (2020).
  12. Beckmann, L., et al. In vivo imaging of the inner retinal layer structure in mice after eye-opening using visible-light optical coherence tomography. Experimental Eye Research. 211, 108756 (2021).
  13. Grannonico, M., et al. Global and regional damages in retinal ganglion cell axon bundles monitored non-invasively by visible-light optical coherence tomography fibergraphy. Journal of Neuroscience. 41 (49), 10179-10193 (2021).
  14. Allen-Worthington, K. H., Brice, A. K., Marx, J. O., Hankenson, F. C. Intraperitoneal Injection of Ethanol for the Euthanasia of Laboratory Mice (Mus musculus) and Rats (Rattus norvegicus). J Am Assoc Lab Anim Sci. 54 (6), 769-778 (2015).
  15. Boivin, G. P., Bottomley, M. A., Schiml, P. A., Goss, L., Grobe, N. Physiologic, Behavioral, and Histologic Responses to Various Euthanasia Methods in C57BL/6NTac Male Mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 56 (1), 69-78 (2017).
  16. Chen, H., et al. Progressive degeneration of retinal and superior collicular functions in mice with sustained ocular hypertension. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 56 (3), 1971-1984 (2015).
  17. Feng, L., Chen, H., Suyeoka, G., Liu, X. A laser-induced mouse model of chronic ocular hypertension to characterize visual defects. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 78 (78), (2013).
  18. Gao, J., et al. Differential effects of experimental glaucoma on intrinsically photosensitive retinal ganglion cells in mice. Journal of Comparative Neurology. 530 (9), 1494-1506 (2022).
  19. Thomson, B. R., et al. Angiopoietin-1 knockout mice as a genetic model of open-angle glaucoma. Translational Vision Science and Technology. 9 (4), (2020).
  20. Feng, L., et al. Sustained ocular hypertension induces dendritic degeneration of mouse retinal ganglion cells that depends on cell type and location. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 54 (2), 1106-1117 (2013).
  21. Grannonico, M., et al. Longitudinal analysis of retinal ganglion cell damage at individual axon bundle level in mice using visible-light optical coherence tomography fibergraphy. Translational Vision Science and Technology. 12 (5), (2023).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

in vivoex vivovis OCTF

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены