Совмещение фиброграмм оптической когерентной томографии видимого света с конфокальными изображениями той же сетчатки мыши

Резюме

В настоящем протоколе описаны шаги по совмещению in vivo изображений оптической когерентной томографии в видимом свете (vis-OCTF) с конфокальными изображениями той же сетчатки мыши ex vivo с целью верификации наблюдаемой морфологии пучка аксонов ганглиозных клеток сетчатки на изображениях in vivo.

Аннотация

В последние годы визуализация сетчатки in vivo , которая предоставляет неинвазивную информацию о биологических системах и процессах в режиме реального времени и в течение длительного времени, все чаще применяется для получения объективной оценки повреждения нейронов при заболеваниях глаз. Конфокальная визуализация одной и той же сетчатки ex vivo часто необходима для подтверждения результатов in vivo , особенно в исследованиях на животных. В данной работе мы продемонстрировали метод выравнивания конфокального изображения сетчатки мыши ex vivo с ее изображениями in vivo . Новая клинически готовая технология визуализации, называемая оптической когерентной томографией видимого света (vis-OCTF), была применена для получения изображений сетчатки мыши in vivo . Затем мы выполнили конфокальную визуализацию той же сетчатки, что является «золотым стандартом», чтобы проверить изображения in vivo по сравнению с OCTF. Это исследование не только позволяет глубже изучить молекулярные и клеточные механизмы, но и закладывает основу для чувствительной и объективной оценки нейронных повреждений in vivo.

Введение

Ганглиозные клетки сетчатки (RGC) играют важнейшую роль в обработке визуальной информации, получая синаптические входы через свои дендритные деревья во внутреннем плексиформном слое (IPL) и передавая информацию через свои аксоны в слое нервных волокон сетчатки (RNFL) в мозг 1,2,3,4. При таких заболеваниях, как глаукома, ранняя дегенерация RGC может привести к незначительным изменениям в RNFL, слое ганглиозных клеток (GCL), IPL и зрительном нерве как у пациентов, так и у грызунов^{моделей} 5,6,7,8,9.....

протокол

Все процедуры для животных были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию в Университете Вирджинии и соответствовали рекомендациям по использованию животных Национального института здравоохранения (NIH). См. Таблицу материалов для получения подробной информации, связанной со всеми материалами, реагентами и инструментами, используемыми в этом протоколе.

1. Визуализация in vivo по сравнению с ОКТ

1. Система vis-OCT
   1. Визуализируйте глаза мышей с помощью системы vis-OCT для небольших животных, которая использует источник света суперконтинуума, который обеспечивает освещен....

Результаты

Композитная фиброграмма vis-OCT сравнивается с соответствующим конфокальным изображением плоской сетчатки, окрашенной Tuj-1 для аксонов RGC (рис. 1D, верхняя панель). Пучки аксонов, полученные с помощью vis-OCTF, могут быть сопоставлены с пучками аксонов, помеченными Tu-j1 на конфока?.......

Обсуждение

В этом протоколе есть два этапа, которые требуют внимания. Во-первых, перед ОКТ-визуализацией необходимо убедиться, что животное находится под глубоким наркозом и что его глаза полностью расширены. Если мыши не находятся под адекватным наркозом, их учащенное дыхание может привести к не?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Halo 100	Opticent Health, Evanston, IL
Zeiss LSM800 microscope	Carl Zeiss
Drugs and antibodies
4% paraformaldehyde (PFA)	Santz Cruz Biotechnology, SC-281692		1-2 drops
Bovine serum albumin powder	Fisher Scientific, BP9706-100		1:10
Donkey anti Mouse Alexa Fluor 488 dye	Thermo Fisher Scientific, Cat# A-21202		1:1,000
Donkey anti rat Alexa Fluor 594 dye	Thermo Fisher Scientific, Cat# A-21209		1:1,000
Euthasol (a mixture of pentobarbital sodium (390 mg/mL) and phenytoin sodium (50 mg/mL))	Covetrus, NDC 11695-4860-1		15.6 mg/mL
Ketamine	Covetrus, NADA043304		114 mg/kg
Mouse anti-Tuj1	A gift from Anthony J. Spano, University of Virginia		1:200
Normal donkey serum(NDS)	Millipore Sigma, S30-100 mL		1:100
Phosphate-buffered saline (PBS, 10x), pH 7.4 (Contains 1370 mM NaCl, 27 mM KCl, 80 mM Na2HPO4, and 20 mM KH2PO4)	Thermo Fisher Scientific, Cat# J62036.K3		1:10
Rat anti-ICAM-2	BD Pharmingen, Cat#553325		1:500
Tropicamide drops	Covetrus, NDC17478-102-12
Triton X-100 (Reagent Grade)	VWR, CAS: 9002-93-1		1:20
Vectashield mounting medium	Vector Laboratories Inc. H2000-10
Xylazine	Covetrus, NDC59399-110-20		17 mg/kg