Abgleich von optischen Kohärenztomographie-Fasergrammen im sichtbaren Licht mit konfokalen Bildern derselben Maus-Netzhaut

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Schritte zum Abgleich von in vivo Bildern der optischen Kohärenztomographie (Vis-OCTF) mit konfokalen ex vivo Bildern derselben Mausnetzhaut, um die beobachtete Morphologie der retinalen Ganglienzell-Axonbündel in den in vivo Bildern zu verifizieren.

Zusammenfassung

In den letzten Jahren wurde die In-vivo-Netzhautbildgebung, die nicht-invasive, Echtzeit- und Längsschnittinformationen über biologische Systeme und Prozesse liefert, zunehmend eingesetzt, um eine objektive Beurteilung von neuronalen Schäden bei Augenerkrankungen zu erhalten. Die konfokale Ex-vivo-Bildgebung derselben Netzhaut ist oft notwendig, um die in vivo Befunde zu validieren, insbesondere in Tierversuchen . In dieser Studie haben wir eine Methode demonstriert, mit der ein konfokales ex vivo Bild der Maus-Netzhaut mit ihren in vivo Bildern abgeglichen werden kann. Eine neue klinische Bildgebungstechnologie, die optische Kohärenztomographie (vis-OCTF), wurde eingesetzt, um In-vivo-Bilder der Netzhaut der Maus zu erhalten. Anschließend führten wir die konfokale Bildgebung derselben Netzhaut wie den "Goldstandard" durch, um die in vivo vis-OCTF-Bilder zu validieren. Diese Studie ermöglicht nicht nur die weitere Untersuchung der molekularen und zellulären Mechanismen, sondern schafft auch die Grundlage für eine sensitive und objektive Bewertung von neuronalen Schäden in vivo.

Einleitung

Retinale Ganglienzellen (RGCs) spielen eine entscheidende Rolle bei der visuellen Informationsverarbeitung, indem sie synaptische Inputs über ihre dendritischen Bäume in der inneren plexiformen Schicht (IPL) empfangen und die Informationen über ihre Axone in der retinalen Nervenfaserschicht (RNFL) an das Gehirn weiterleiten 1,2,3,4. Bei Erkrankungen wie dem Glaukom kann eine frühe RGC-Degeneration sowohl bei Patienten als auch bei Nagetiermodellen zu subtilen Veränderungen der RNFL, der Ganglienzellschicht (GCL), des IPL und des Sehnervs führen 5,6,7,8,9. Die frühzeitige Erkennung dieser morphologischen Veränderungen bei RGCs ist daher für eine rechtzeitige Intervention zur Vorbeugung von RGC und Sehverlust unerlässlich.

Wir haben kürzlich eine neue klinische Bildgebungstechnologie namens optische Kohärenztomographie (Vis-OCT) entwickelt, um den Bedarf an In-vivo-Überwachung von RGC-Schäden zu decken. Vis-OCT verbesserte die axiale Auflösung auf 1,3 μm in der Netzhaut^10,11 und ermöglichte die Visualisierung einzelner RGC-Axonbündel in der RNFL. In der Folge wurde die Vis-OCT-Fasergraphie (Vis-OCTF) etabliert, um RGC-Schäden auf der Ebene einzelner Axonbündel bei Mäusen zu verfolgen und zu quantifizieren^11,12,13. Eine konfokale Ex-vivo-Bildgebung derselben Netzhaut wie der Goldstandard ist jedoch häufig erforderlich, um die In-vivo-Ergebnisse zu validieren. Daher wird diese Studie zeigen, wie in vivo Bilder, die mit vis-OCTF aufgenommen wurden, mit ex vivo konfokalen Bildern derselben Maus-Netzhaut abgeglichen werden können. Das Protokoll zielt darauf ab, die in vivo Befunde durch konfokale Ex-vivo-Bildgebung zu validieren und eine Grundlage für die Untersuchung der molekularen und zellulären Veränderungen zu schaffen, die RGC-Schäden unter kranken Bedingungen zugrunde liegen.

Protokoll

Alle Tierbehandlungen wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Virginia genehmigt und entsprachen der Richtlinie zur Verwendung von Tieren des National Institute of Health (NIH). In der Materialtabelle finden Sie Einzelheiten zu allen Materialien, Reagenzien und Instrumenten, die in diesem Protokoll verwendet werden.

1. In-vivo-Vis-OCT-Bildgebung

1. Das vis-OCT-System
   1. Bilden Sie die Augen der Mäuse mit einem Vis-OCT-System für kleine Tiere ab, das eine Superkontinuumslichtquelle verwendet, die eine Beleuchtung mit sichtbarem Licht zwischen 480 nm und 650 nm liefert. Stellen Sie sicher, dass der Stromeinfall auf der Hornhaut 1 mW beträgt und verwenden Sie eine A-Linien-Rate von 25 kHz und eine Integrationszeit von 39,3 μs pro A-Linie.
   2. Stellen Sie sicher, dass der spektrale Detektionsbereich des Spektrometers zwischen 508 nm und 613 nm liegt, was eine axiale Auflösung von 1,3 μm in der Netzhaut ermöglicht. Das gesamte Bildvolumen beträgt ca. 700 μm (x) x 700 μm (y) x 1.500 μm (z). Die laterale Auflösung liegt zwischen 4,5 μm in der Mitte des Gesichtsfeldes und 8,7 μm in 350 μm Entfernung von der Mitte^11,13.
2. Anästhesie von Mäusen
   1. Betäuben Sie Mäuse mit C57BL/6-Hintergrund und beiderlei Geschlechts mit einer intraperitonealen Injektion von Ketamin (114 mg/kg) und Xylazin (17 mg/kg) Cocktail und erweitern Sie ihre Pupillen mit 1% Tropicamid-Tropfen. Bestätigen Sie eine ausreichende Anästhesie durch Verlust des Pedalreflexes nach einem festen Einklemmen der Zehen.
   2. Halten Sie die Maus während der Bildgebung mit einer Infrarot-Wärmelampe warm. Tragen Sie nach jeder Bildaufnahme künstliche Tränen auf, um eine Austrocknung der Hornhaut zu verhindern.
3. Positionierung der Maus für die Bildgebung
   1. Legen Sie die betäubte Maus auf den Tierhalter und halten Sie die Maus mit Hilfe von zwei Velcro Gurten in Position.
      HINWEIS: Der Tierhalter ermöglicht eine dreidimensionale Bewegung (vertikale Einstellung, horizontale Feineinstellung sowie Nick- und Giereinstellung), um den Laser in das Auge der Maus zu platzieren.
4. Anpassen von Bildgebungsparametern
   1. Schalten Sie den Computer ein und öffnen Sie die referenzierte Software, die den Laser automatisch einschaltet.
   2. Stellen Sie die Tierhalterung so lange ein, bis der Laser stabil und zentriert im Auge der Maus ist. Visualisieren Sie den hinteren Teil des Auges durch eine En-Face-Vorschau in der Software-Oberfläche, das Sichtfeld (FOV) des oberflächlichen Gefäßplexus und einen B-Scan, den Querschnitt der Netzhaut innerhalb des Sichtfelds.
   3. Erfassen Sie ein Vis-OCT-Volume, indem Sie auf der Softwareoberfläche auf die Schaltfläche Acquire klicken, nachdem Sie geringfügige Anpassungen des optischen Fokus vorgenommen haben, der aus 512 A-Zeilen/B-Bild und 512 B-Bildern/Volumen besteht.
      HINWEIS: Dieser Vorgang dauert ~10,5 s. Die Bilderfassung wird von einem integrierten Qualitätsindex-Schätzer (QI) gesteuert, um sicherzustellen, dass Bilder unterhalb eines vorgegebenen Schwellenwerts (QI < 45) nicht berücksichtigt werden.
      1. Erfassen Sie für jede Maus vier Vis-OCT-Volumina desselben Auges. Richten Sie den Sehnervenkopf (ONH) in jeder der vier Ecken des Sichtfelds aus, um verschiedene Bereiche der Netzhaut abzudecken.
         HINWEIS: Eine solche Platzierung minimiert die Netzhautkrümmung, wodurch der RNFL-Reflexionsgrad im gesamten Sichtfeld maximiert wird. Es dauert ~1 Minute, um das Auge zwischen jeder Aufnahme neu zu positionieren (Abbildung 1A,B).
5. Vis-OCTF-Analyse
   HINWEIS: MATLAB wird zur Durchführung von Bildanalysen verwendet.
   1. Um Vis-OCT-Fibergramme aus dem Vis-OCT-Volumen zu generieren, verwenden Sie eine intensitätsbasierte Schwellenwertmethode (MATLAB-Codezeile 808), um die Oberfläche der Netzhaut zu erkennen.
      HINWEIS: Diese Zeilen verwenden die Imjust-Funktion , um die Intensitätswerte des BScans anzupassen. Das Argument [0.0087 0.08], das an imadjust übergeben wird, gibt den Intensitätsbereich an, der dem vollen Dynamikbereich des Ausgabebilds zugeordnet werden soll.
   2. Schneiden Sie die RNFL zu, indem Sie die ersten ~16 μm in der Tiefe auswählen. Weitere Informationen finden Sie unter Matlab-Codezeile 782.
      HINWEIS: Die typische In-vivo-RNFL-Dicke in einer adulten Wildtyp-C57BL/6-Maus beträgt ~14 μm und kann zwischen verschiedenen Segmentierungsmethoden variieren¹³.
   3. Ändern Sie die Pfade der RAW-Datei (Zeile 9), der Dateien für die Rekonstruktion (Zeile 11) und des Dateinamens (Zeile 15), klicken Sie auf Ausführen und warten Sie, bis das OAT-Bild vom MATLAB-Code analysiert wurde. Berechnen Sie die Projektion der mittleren Intensität entlang der axialen (z) Richtung (MATLAB-Codezeilen 905-908), um das Fibergrammbild zu erzeugen, das aus RGC-Axonbündeln und dem umgebenden Gefäßsystem besteht. Montieren Sie die vier Bilder nach der Fibergramm-Verarbeitung für jedes Sichtfeld, indem Sie die Blutgefäße mit einem Grafikeditor Ihrer Wahl ausrichten und insgesamt ~1,2 x 1,2 mm abdecken. Die RAW-Dateien werden in der Regel im Ordner Halo Data unter dem Datum der OCT-Bildgebung gespeichert (z. B. 0606 Opticent).
      HINWEIS: Die MATLAB-Codes sind in der Zusatzdatei 1 verfügbar.

2. Konfokale Ex-vivo-Bildgebung

1. Euthanasie von Mäusen
   1. Nach der Erfassung von Vis-OCT-Daten werden die Mäuse mit einer Mischung aus Pentobarbital-Natrium (390 mg/ml) und Phenytoin-Natrium (50 mg/ml) eingeschläfert. Phenytoin-Natrium wirkt, indem es die Wirkung von Pentobarbital-Natrium verstärkt, das bei der Euthanasie von Nagetieren weit verbreitet ist^14,15. Für jede Maus werden 0,2 ml/20 g der verdünnten Mischung (156 mg/ml) verwendet und mit 20 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und dann 20 ml 4%igem Paraformaldehyd (PFA) in PBS^16,17 perfundiert.
2. Augendissektion und -orientierung
   1. Enukleieren Sie die Augen und machen Sie eine Markierung auf der Schläfenseite, um die Ausrichtung anzuzeigen.
   2. Nach vorsichtigem Entfernen der vorderen Augenkammer, der Okularlinse, des Glaskörpers und der Fixierung der Augenmuscheln in PFA für 30 Minuten.
   3. Waschen Sie die Augenmuscheln 30 Minuten lang mit PBS und tauschen Sie die PBS-Lösung während des Waschens 3x aus. Dann mit 0,5 % Triton X-100 in PBS (pH 7,5) 30 Minuten lang waschen.
   4. Die Augenmuscheln werden 2 h lang bei Raumtemperatur in Blockierpuffer (5 % Eselsserum mit 2,5 % Rinderserumalbumin und 0,5 % Triton X-100 in Tris-gepufferter Kochsalzlösung [pH 7,5]) inkubiert.
3. Immunfärbung
   HINWEIS: Die Augenmuscheln können jetzt mit den primären Antikörpern von Maus-Anti-Tuj1 zum Nachweis von RGC-Axonbündeln und Ratten-Anti-ICAM-2 zum Nachweis von Blutgefäßen gefärbt werden.
   1. Inkubieren Sie die Augenmuscheln über Nacht mit den primären Antikörpern Maus-Anti-Tuj1 (1:200 im Blockierungspuffer) und Ratten-Anti-ICAM-2 (1:500 im Blockierungspuffer) bei 4 °C.
   2. Waschen Sie die Augenmuscheln jedes Mal 3-5x für 1 Stunde mit einer phosphatgepufferten Kochsalzlösung, die 0,5% Triton X-100 (PBST) enthält, um den Hintergrund zu minimieren und alle ungebundenen Antikörper zu entfernen.
   3. Nach dem Waschen werden die Augenmuscheln über Nacht mit den sekundären Antikörpern, dem Esels-Anti-Maus-Immunglobulin G konjugiert mit dem Farbstoff Alexa Fluor 488 (grüne Fluoreszenz) und dem Esels-Anti-Ratten-IgG mit dem Farbstoff Alexa Fluor 594 (rote Fluoreszenz) konjugiert, alle 1:1000 in Blockierungspuffer bei 4 °C verdünnt.
   4. Am nächsten Tag waschen Sie die Augenmuscheln 3-5x für jeweils 1 h mit PBST, um den Hintergrund zu minimieren und ungebundene Antikörper zu entfernen.
   5. Setzen Sie die Augenmuscheln vor der flachen Montierung in eine Petrischale mit PBS.
4. Flach montierte Netzhaut
   1. Nach der Immunfärbung isolieren Sie die Netzhaut unter dem Mikroskop von den Augenmuscheln.
   2. Schneide die Netzhaut in vier Blätter und befestige sie flach mit der RGC-Schicht nach oben. Lassen Sie die Markierung auf der Schläfenseite an der Netzhaut befestigt, um die Orientierung anzuzeigen.
   3. Deckglas der Netzhaut mit Montagemedium^13,18. Versiegeln Sie die Objektträger mit Nagellack^13,18,19.
5. Konfokale Bildgebung
   HINWEIS: Die Bildverarbeitung der konfokalen Bilder wurde mit der ZEN-Mikroskopie-Software durchgeführt.
   1. Schalten Sie das konfokale Mikroskop ein und suchen Sie im Lokalisierungsmodus den gewünschten Bereich mit dem Okular des Mikroskops.
   2. Richten Sie im Erfassungsmodus Kacheln ein, um die gesamte Netzhaut abzudecken, und Z-Stapel-Schichten, um alle Informationsebenen abzudecken. Bilden Sie mindestens 25 Kacheln über die gesamte Netzhaut ab, um das Gesamtvolumen von 5,99 mm (x) x 5,88 mm (y) x 30 μm (z) bei einer Pixelgröße von 1,24 μm/Pixel abzudecken.
   3. Projizieren Sie die Z-Stapel-Schichten, um zweidimensionale konfokale Mikroskopiebilder zu erstellen (Abbildung 1C,D)11,13,19,20,21.

3. Abgleich von In-vivo- und Ex-vivo-Bildern

1. Erstellen Sie nach der Verarbeitung des Fibergramms ein zusammengesetztes Bild, das die vier von jeder Maus aufgenommenen Bilder enthält, indem Sie alle Blutgefäße mit einem Grafikeditor Ihrer Wahl ausrichten.
   HINWEIS: Im Durchschnitt ist das endgültige zusammengesetzte Bild ungefähr 1,2 mm (x) x 1,2 mm (y) groß, wie in Abbildung 1B dargestellt.
2. Verwenden Sie den Sehnervenkopf (ONH) und das Muster der Blutgefäße als Orientierungspunkte, um das zusammengesetzte Fasergramm auszurichten. Die In-vivo- und Ex-vivo-Ausrichtung wird durch Überlappung des Blutgefäßmusters der zusammengesetzten OCT-Bilder mit den konfokalen Bildern derselben Netzhaut, die mit ICAM-2 gefärbt wurde, erreicht.

Ergebnisse

Das zusammengesetzte Vis-OCT-Fasergramm wird mit dem entsprechenden konfokalen Bild einer flach montierten Netzhaut verglichen, die mit Tuj-1 für RGC-Axone immungefärbt wurde (Abbildung 1D, oben). Axonbündel, die mit vis-OCTF abgebildet werden, können mit den Tu-j1-markierten Axonbündeln auf dem konfokalen Bild abgeglichen werden. Blutgefäße weisen in der Regel unterscheidbare Verzweigungsstrukturen im Vergleich zu umgebenden Axonbündeln in Fibergrammbildern auf, die mit den ICAM-2-m...

Diskussion

Es gibt zwei Schritte in diesem Protokoll, die Aufmerksamkeit erfordern. Zunächst muss sichergestellt werden, dass sich das Tier unter Tiefennarkose befindet und dass seine Augen vor der Vis-OCT-Bildgebung vollständig geweitet sind. Wenn die Mäuse nicht ausreichend betäubt werden, kann ihre schnelle Atmung zu instabilen Bewegungen der Gesichtsbilder führen, was sich negativ auf die Qualität des Fibergramms auswirken kann. Darüber hinaus kann sich eine unzureichende Dilatation auch negativ auf die Bildqual...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Halo 100	Opticent Health, Evanston, IL
Zeiss LSM800 microscope	Carl Zeiss
Drugs and antibodies
4% paraformaldehyde (PFA)	Santz Cruz Biotechnology, SC-281692		1-2 drops
Bovine serum albumin powder	Fisher Scientific, BP9706-100		1:10
Donkey anti Mouse Alexa Fluor 488 dye	Thermo Fisher Scientific, Cat# A-21202		1:1,000
Donkey anti rat Alexa Fluor 594 dye	Thermo Fisher Scientific, Cat# A-21209		1:1,000
Euthasol (a mixture of pentobarbital sodium (390 mg/mL) and phenytoin sodium (50 mg/mL))	Covetrus, NDC 11695-4860-1		15.6 mg/mL
Ketamine	Covetrus, NADA043304		114 mg/kg
Mouse anti-Tuj1	A gift from Anthony J. Spano, University of Virginia		1:200
Normal donkey serum(NDS)	Millipore Sigma, S30-100 mL		1:100
Phosphate-buffered saline (PBS, 10x), pH 7.4 (Contains 1370 mM NaCl, 27 mM KCl, 80 mM Na2HPO4, and 20 mM KH2PO4)	Thermo Fisher Scientific, Cat# J62036.K3		1:10
Rat anti-ICAM-2	BD Pharmingen, Cat#553325		1:500
Tropicamide drops	Covetrus, NDC17478-102-12
Triton X-100 (Reagent Grade)	VWR, CAS: 9002-93-1		1:20
Vectashield mounting medium	Vector Laboratories Inc. H2000-10
Xylazine	Covetrus, NDC59399-110-20		17 mg/kg