זרימת עבודה לקביעה כמותית של שינויים ספציפיים לנגע ניוון מקולרי הקשור לגיל בפונדוס אוטופלואורסנציה

Summary

מחקר זה מתאר זרימת עבודה לקביעה והשוואה של רמות אוטופלואורסצנטיות מאזורי עניין בודדים (למשל, משקעי דרוסן ודרוזנואידים תת-רשתית בניוון מקולרי הקשור לגיל [AMD]) תוך התחשבות ברמות אוטופלואורסצנטיות משתנות ברחבי הקרן.

Abstract

הדמיה אוטופלואורסצנטית של פונדוס (FAF) מאפשרת מיפוי לא פולשני של פלואורופורים פנימיים של פונדוס העין, במיוחד אפיתל פיגמנט הרשתית (RPE), הניתן כעת לכימות עם הופעת הסריקה הקונפוקלית של לייזר אוטופלואורסצנטי כמותי מבוסס אופטלמוסקופיה (QAF). הודגם כי QAF יורד באופן כללי בקוטב האחורי בניוון מקולרי הקשור לגיל (AMD). הקשר בין QAF לנגעי AMD שונים (דרוסן, משקעי דרוסנואידים תת-רשתית) עדיין אינו ברור.

מאמר זה מתאר זרימת עבודה לקביעת QAF ספציפי לנגע ב- AMD. נעשה שימוש בגישת הדמיה multimodal in vivo , כולל, אך לא רק, טומוגרפיה קוהרנטית אופטית בתחום ספקטרלי (SD-OCT), סריקת נפח מקולרי ו- QAF. באמצעות תוספי FIJI מותאמים אישית, תמונת QAF המתאימה מיושרת עם תמונת האינפרא-אדום הקרוב מסריקת SD-OCT (ציוני דרך אופייניים; כלומר, התפצלויות כלי שיט). הפובולה וקצה ראש עצב הראייה מסומנים בתמונות OCT (ומועברים לתמונת QAF הרשומה) למיקום מדויק של רשתות הניתוח.

לאחר מכן ניתן לסמן נגעים ספציפיים ל-AMD על גבי OCT BScans בודדים או על תמונת QAF עצמה. מפות QAF נורמטיביות נוצרות כדי להסביר את הממוצע המשתנה וסטיית התקן של ערכי QAF ברחבי הפונדוס (תמונות QAF מקבוצת AMD מייצגת הוערכו בממוצע לבניית מפות QAF AMD סטנדרטיות סטנדרטיות נורמטיביות). התוספים רושמים את קואורדינטות X ו- Y, ציון z (מדידה מספרית המתארת את ערך QAF ביחס לממוצע של מפות מיקוד אוטומטי במונחים של סטיית תקן מהממוצע), ערך עוצמה ממוצעת, סטיית תקן ומספר הפיקסלים המסומנים. הכלים קובעים גם ציוני z מאזור הגבול של נגעים מסומנים. זרימת עבודה זו וכלי הניתוח ישפרו את ההבנה של הפתופיזיולוגיה ופענוח התמונה הקלינית של AF ב- AMD.

Introduction

הדמיית פונדוס אוטופלואורסנציה (FAF) מספקת מיפוי לא פולשני של פלואורופורים טבעיים ופתולוגיים של פונדוס העין¹. האוטופלואורסצנטיות הכחולה הנפוצה ביותר (עירור 488 ננומטר) מעוררת גרגרי ליפופוסצין ומלנוליפופוסצין של אפיתל פיגמנט הרשתית (RPE)^2,3,4. פיזור ועלייה/ירידה של גרגירים ממלאים תפקיד מרכזי בהזדקנות תקינה ובמחלות רשתית שונות, כולל ניוון מקולרי תלוי גיל (AMD)⁵.

פיתוח נוסף של FAF, כמותי fundus autofluorescence (QAF), מאפשר כעת קביעה מדויקת של עוצמות AF רשתית^{טופוגרפיות 4,6}. על-ידי שילוב הפניה במסלול האופטי של התקן ההדמיה FAF, ניתן להשוות את עוצמות המיקוד האוטומטי בין התקנים, נקודות זמן ונושאים. טכניקה זו הביאה לשינוי פרדיגמה ביחס לגורם פתוגנטי משוער ב- AMD, אשר במשך זמן רב הועלה השערה כי הוא נובע מהצטברות יתר של ליפופוסצין בתאי RPE⁷. עם זאת, כימות היסטולוגי וקליני של AF גילה ירידה במיקוד אוטומטי ב-AMD (עקב חלוקה מחדש ואובדן של גרגרי ליפופוסצין אוטופלואורסצנטיים ומלנוליפופוסצין), במקום העלייה המוצעת במיקוד אוטומטי ^8,9,10.

לניטור מיקוד אוטומטי יש השלכות קליניות. Von der Emde et al. ואחרים הראו כי AF הוא לא רק ירידה אלא גם ירידה נוספת במהלך AMD בסיכון גבוה, בינוני AMD^{עיניים 8,9}. בנוסף, מחקרים היסטולוגיים מצביעים על כך שרוב תאי RPE המושפעים מ- AMD מראים התנהגות אופיינית עם צבירת גרגירים ושחול לפני אובדן תאי RPE באמצעות הפחתה, החלקה, נדידה או ניוון^13,14,15,16. זה מצביע עוד יותר על כך שאובדן AF עשוי להיות טריגר או איתות חלופי להתקדמות המחלה הממשמשת ובאה.

מחקרי QAF עד כה העריכו את מיקוד האוטומטי באופן גלובלי רק במערכות קואורדינטות קוטביות טרומיות באמצעות רשת טרומית (למשל, QAF8/Delori Grid)¹⁷. שימוש ברשתות טרומיות למדידת מיקוד אוטומטי יוצר ערכי מיקוד אוטומטי מרובים באזורים קבועים מראש לעין של נושא הצילום. חקירת ערכי מיקוד אוטומטי בדרך זו עלולה להחמיץ שינויים מקומיים באזורים עם מיקוד אוטומטי שהשתנה פתולוגית, לדוגמה, ב- AMD מעל או קרוב למשקעי דרוסן או דרוסנואידים תת-רשתיים (SDD). דרוסן, ובמידה גבוהה יותר SDDs, קשורים לסיכון גבוה לפתח AMD מאוחר ואובדן ראייה. לדרוזנים בפרט יש מחזור טיפוסי של גידול בגודל לאורך שנים רבות והם עלולים להידרדר במהירות לפני הניוון. ניתן להעלות על הדעת, למשל, כי AF גלובלי יורד ב- AMD, אך עולה או אפילו מופחת עוד יותר בתוך וסביב נגעים מוקדיים ספציפיים אלה הקשורים למחלה.

דפוסי מיקוד אוטומטי מקומיים שונים יכולים גם להיות בעלי רלוונטיות פרוגנוסטית להתקדמות המחלה. לדוגמה, רמות אוטופלואורסנציה עשויות לשמש כדי להעריך אם דרוסן גדלים בגודלם או שהם כבר נמצאים ברגרסיה לניוון. כבר הוכח כי שינויים בדפוסים ההיקפיים של מיקוד אוטומטי באטרופיה גיאוגרפית משפיעים במידה רבה על התקדמות הניוון לאורך זמן¹⁸. בנוסף, דפוסי אוטופלואורסנציה מקומיים עשויים לחשוף פרטים נוספים על בריאות RPE. לעתים קרובות, טומוגרפיית הקוהרנטיות האופטית (OCT) מראה השתקפות יתר לתוך choriocapillaris, אם כי שכבת RPE נראה שלם. גישה רב-מודאלית המשלבת ערכי QAF מקומיים ו-OCT עשויה לסייע בהבחנה בין נגעים בעלי סיכון גבוה לשיבוש RPE וניוון מתקרב.

אחת הסיבות לכך שניתוחים מרחביים במחקרים לא בוצעו היא שתוכנת היצרן הנפוצה ביותר אינה מספקת כלי לניתוחים מסוג זה. תכונות AF של נגעים שונים התלויים בשלב מחלת AMD יכולות להסביר עוד יותר את הפתוגנזה של AMD. לכן, רצוי כלי למדידת מיקוד אוטומטי אזורי ספציפי לנגע. כדי להשוות במדויק נגעים הממוקמים ברחבי הרשתית, זרימת העבודה זקוקה לדרך להסביר דרגות שונות של מיקוד אוטומטי בפונדוס האנושי¹⁹. באופן המרכזי ביותר, מיקוד אוטומטי נמוך יותר באופן אופייני בשל השפעות ההצללה של פיגמנט מקולרי וספירות גרגירים שונות^20,21.

מיקוד אוטומטי מגיע לשיאו ב~9° (המרחק לגומה המרכזית לכל הכיוונים) ויורד במידה רבה יותר באופן היקפי⁴. לכן, אם היינו משווים ערכים מוחלטים של רמות מיקוד אוטומטי מדרוזן רך (הממוקם בגומה המרכזית ובפרפוביה באזורים עם מיקוד אוטומטי נמוך) ומדוכני SDD (הממוקמים באופן פארא-מרכזי באזורי מיקוד אוטומטי גבוה), התוצאות לא היו ניתנות להשוואה²². בהשראת עבודתם של Pfau et al. והרעיון של אובדן רגישות (תיקון רגישות הנמדדת ב- AMD עבור גבעת הראייה [ירידה ברגישות הרשתית עם המרחק לגומה המרכזית] של בקרות בריאות) עבור היקף מבוקר פונדוס, AF מושווה לערכי מיקוד אוטומטי סטנדרטיים ברחבי המקולה^23,24. התוצאות מדווחות כציוני z (מדידה מספרית של הקשר בין אזור של ערך עניין לממוצע).

מטרת מחקר זה היא להעריך את השימוש בכלי חדש למדידת רמות QAF מקומיות בסוגים שונים של נגעים בחולים עם AMD. כלי זה נועד למדוד רמות אוטופלואורסצנטיות של נגעים שזוהו בסריקות OCT. הדבר מאפשר הערכה של רמות אוטופלואורסצנטיות מקומיות בנגעים, כגון דרוסן רך או SDD, ומאפשר מעקב אחר שינויים במיקוד האוטומטי מנגעים לאורך זמן. התועלת הפוטנציאלית של כלי זה היא לאפשר סמן ביולוגי מבני חדש שמעריך את בריאות RPE ועשוי להיות בעל ערך פרוגנוסטי לנגעים הנחקרים.

Protocol

המחקר נערך בהתאם להצהרת הלסינקי ואושר על ידי ועדת האתיקה של אוניברסיטת בון (קוד פרוטוקול 305/21). הסכמה מדעת בכתב התקבלה מכל הנבדקים המעורבים במחקר. דרשנו מכל המשתתפים בסרטון לחתום על טופסי שחרור המעניקים לנו רשות להשתמש בדמותו ובפרטיו האישיים ביצירת סרטון מקוון.

1. רכישת תמונה אוטופלואורסצנטית כמותית (QAF)

1. לקבלת תמונה מדויקת עם התקן QAF, ודא שהמשתתף יושב בנוחות מול המכשיר. בקשו מהמשתתפים ללחוץ את הסנטר והמצח כנגד הסנטר ומשענת הראש. התאימו את גובה משענת הסנטר עד שזווית העפעף הצידית תהיה באותו גובה כמו הסימון האדום.
2. ודא שהתמונה ממוקדת במודוס האינפרא אדום הקרוב על ידי סיבוב הגלגל במכשיר ההקלטה עד שהכלים הקטנים נמצאים בפוקוס. התקרב לעין על-ידי הזזת המצלמה קדימה עד שפינות התמונה מוארות באופן שווה. ככלל אצבע, התאימו את המיקוד למקבילה הכדורית. הפחיתו את המיקוד לפני הדמיית QAF על ידי דיופטר אחד או שניים, מכיוון ש-QAF כחול משתמש באורך גל קצר יותר, והעברו את המודוס של מכשיר ה-QAF ממצב אינפרא-אדום קרוב למצב QAF.
3. כוונן מחדש ושדרג את ההארה וכוונן את מוקד התמונה עד שהכלים הקטנים הקרובים ביותר לגומה המרכזית יהיו בפוקוס והתמונה תהיה מוארת בבהירות ללא נקודות אדומות (המעידות על תאורת יתר). הלבין את הפוטופיגמנט על ידי המתנה של לפחות 30 שניות במצב QAF לפני רכישת התמונה כדי לאפשר לעירור מתמשך של אור כחול להלבין את פיגמנט קולטני האור בשדה הראייה של הגדרות המצלמה.
4. כדי לצלם תמונות, לחץ על רכישת תמונות בלוח המגע של התקן ההדמיה; הקפד לצלם יותר מתמונת QAF אחת במקרה של מצמוץ או תנועות עיניים פתאומיות במהלך הרכישה.
   הערה: זרימת העבודה דורשת גם תמונות טומוגרפיה של קוהרנטיות אופטית בתחום הספקטרלי (SD-OCT). רכישת תמונה OCT מוסברת במקום אחר, כפי שהוא נמצא בשימוש נרחב בפועל קליני²⁵.

2. ייצוא תמונות

1. עבור צינור ניתוח זה, ודא שתמונות QAF ו- OCT הן בתבנית הקובץ Extensible Markup Language (XML). במציג HEYEX, לחץ לחיצה ימנית על תמונת QAF/OCT רצויה ובחר ייצוא | כ- XML מהתפריט הנפתח.

3. תוספי קוד פתוח לניתוח QAF - התקנת הצינור

הערה: תוכנת QAF המוצגת היא תוסף קוד פתוח בשם "צינור ספקטרליס" שנוצר עבור תוכנת הקוד הפתוח ImageJ (הרחבת פיג'י)²⁶.

1. כדי לגשת לתוסף, פתח את FIJI, בחר עזרה ולאחר מכן עדכן מהתפריט הנפתח, ולאחר מכן לחץ על נהל אתרי עדכון כדי להוסיף את אתר עדכון החישוב היצירתי "https://sites.imagej.net/CreativeComputation/" לאתרי העדכון הקיימים.
2. הורד את התוספים ולאחר מכן הפעל מחדש את FIJI. כעת, צינור ספקטרליס מותקן. תוספי Spectralis השונים ממוקמים תחת התפריט הנפתח תוספים | ספקטרליס או תוספים | ספקטרליסאצווה.

4. הגדרה - אחסון נתונים

הערה: כדי לאפשר זרימת עבודה חלקה, מומלץ להגדיר את מבנה התיקיות באופן הבא. ראשית, הגדר תיקיה עבור כל נושא לימוד. Oculus dexter (OD) ו- oculus sinister (OS) מתייחסים לעין הימנית והשמאלית, בהתאמה, וקיצורים אלה משמשים לאורך זרימת עבודה זו.

1. עבור כל עין שנבחנה של כל נבדק, הגדר תיקייה אחת עבור OCT, בשם OD_OCT ו- OS_OCT, בהתאמה. אפשר לצינור Spectralis לאחסן באופן אוטומטי את הפלט שלו מהתוסף "Mark_BScans_OCT" כערכים המופרדים באמצעות טאבים בתיקיות אלה.
2. לתמונות QAF, צרו שתי תיקיות בשם OD_QAF ו- OS_QAF.
3. צור תיקיות נוספות אם נעשה שימוש בשיטות הדמיה רב-מודאליות אחרות. ודא שמבנה התיקיות שנוצר דומה למבנה המפורט להלן:
   CASE_ID
   OD_OCT
   OD_QAF
   OD_other_imaging_modality
   OS_OCT
   OS_QAF
   OS_other_imaging_modality

5. המרה של קובץ QAF XML לתמונת QAF (תוסף בשימוש: QAF_xml_reader)

1. קובצי Spectralis QAF XML Export מאוחסנים בתבנית אדום-ירוק-כחול (RGB), מוגבלים לקנה מידה מ- 0 עד 255 (המייצגים ערכי מיקוד אוטומטי שנמדדו) וכוללים אזורי כיול "סטנדרטיים" ו"שחורים". התוסף "QAF_xml_reader" מפיק תמונת QAF. לשם כך, פתח את התפריט הנפתח של התוספים , בחר Spectralis | QAF_XML_Reader ומחק את מסך הפתיחה.
2. מופיע חלון חדש המציג את הבקשה בחר ספרייה המכילה Spectralis XML QAF Export:. בחר את הספרייה ולחץ על בחר.
3. הזן את גורם כיול הייחוס (RCF) של התקן ה- QAF (הכלול במידע התמונה של תמונת QAF) ואת גיל המטופל בזמן צילום התמונה .
4. החלון הבא נקרא QAF Parameters. אם המטופל הוא pseudophakic בעת רכישת תמונה, בחר גיל 20 במקום (זה יש את ההשפעה של יישום ללא תיקון גיל). לאחר לחיצה על OK, כאשר מופיע חלון מוקפץ עם התווית Map to 8bit, הזן את הערך המינימלי של QAF (qafMin) ואת הערך המרבי של QAF (qafMax) עבור תמונת QAF מקודדת בצבע. במקרה ש- qafMin ו- qafMax אינם ידועים, השתמש בהגדרות ברירת המחדל, לחץ על אישור וצפה בתמונה המקורית שכותרתה Raw QAF Data שמופיעה, וכן בתמונת QAF של 32 סיביות ו- QAF של 8 סיביות המקודדת בצבע.
   הערה: תמונת QAF המקודדת בצבע משמשת אך ורק למטרות המחשה; תמונת QAF של 32 סיביות עם ערכי QAF בפועל משמשת לניתוח נוסף.

6. רישום תמונות QAF בתמונת OCT (תוסף בשימוש: Register_OCT_2)

הערה: שלב זה נדרש כדי ליישר במדויק את תמונת OCT עם תמונת QAF, כך שהנגעים בתמונות QAF וב- OCT BScans מיושרים.

1. גישה לתוסף דרך התפריט הנפתח תוספים | Spectralis, או צור מקש קיצור כדי לגשת לתוספים השונים שבהם נעשה שימוש. כדי להשיג זאת, בחר Register_OCT_2 תחת תוספים | קיצורי דרך | הוסף קיצור דרך ובחר את המקש הישיר הרצוי.
2. לאחר פתיחת התוסף, לחץ על אישור בחלון הראשון שמופיע. לאחר מכן, חלון המכיל את הפקודה: בחר ספרייה המכילה את ייצוא XML OCT של Spectralis: יופיע בחלון הראשי של ImageJ. בחר את התיקיה המכילה את Spectralis OCT XML Export ולחץ על פתח.
   הערה: ה-OCT ייטען כעת, דבר בהתאם לעוצמת העיבוד של המחשב שבו נעשה שימוש עשוי להימשך עד 2 דקות.
3. לאחר מכן, המתן לחלון המכיל את הבקשה שמור תמונות רשומות ב: כדי להופיע. בחר בספרייה שבה יאוחסן EnFaceStack (קובץ תמונה מיושר) ולחץ על פתח.
4. המתן לחלון קופץ המכיל את הבקשה בחר תמונה להוספה ל- EnFaceStack: כדי להופיע, בחר את תמונת QAF של 32 סיביות כדי ליישר את התמונה עם SD-OCT ולחץ על פתח. אם כל התמונות הדרושות ב - EnFaceStack זה כלולות, בחר ביטול.
5. כאשר החלון הבא מבקש מהמשתמש לבחור תווית עבור EnFaceStack, בחר את תווית QAF מוכנה מראש; לחלופין, הזן את השם הרצוי של המודל בתיבה אחר. בחר אישור כדי לרשום את התמונה.
   הערה: אל תכלול רווחים או סימני פיסוק אחרים בשדה אחר .
6. שימו לב לשלושת החלונות שצצים. הראשון מסומן בשם Localizer ומציג את SD-OCT כתמונת עין שמאלית (OS). החלון השני נקרא QAF או אחד מהאופנים האחרים שנבחרו קודם לכן כעין השמאלית (OS) או הימנית (OD) המקורית. החלון האחרון נקרא ציוני דרך, והוא מבקש לבחור ציון דרך אחד עד שלושה בכל תמונה.
7. יישרו את שתי התמונות על-ידי בחירת ציון אחד עד שלושה לכל פיצול תמונה-כלי או מאפיינים אחרים הממוקמים בשני האופנים. התקרב (השתמש בתו המקלדת " +" כדי להגדיל את התצוגה וב- " -" כדי להקטין את התצוגה) לפני בחירת ציון הדרך. ודאו שציוני הדרך שנבחרו פרוסים אנכית ואופקית בתמונה. לאחר הוספת הערות לכל ציוני הדרך, בחר אישור בכרטיסיה ציוני דרך וביטול בשורת הפקודה הבאה.
8. כאשר מופיע חלון המבקש האם ברצונך לראות את התוצאות , בחר כן כדי לבדוק אם התמונה יושרה כראוי. עשה זאת על-ידי התקרבות לכלי קטן והצבת הסמן לצדו, ולאחר מכן גלול למעלה או למטה כדי לבדוק כמה הכלי נע ביחס לסמן. אם היישור אינו מדויק, מחק את הקובץ ".tiff" בספריית OD_QAF והפעל מחדש את התהליך מתחילת שלב 2.
   הערה: מאחר שהסימונים על Mark_BScans_OCT חייבים להיות מדויקים, גם היישור בין תמונת SD-OCT לתמונת QAF חייב להיות מדויק מאוד. ניתן להשיג יישור מושלם של פיקסלים ברוב התמונות, אם כי במקרים מסוימים היישור מוגבל לדיוק של שלושה או ארבעה פיקסלים.

7. יצירת תמונת QAF ממוצעת להשוואה (תוסף בשימוש: StandardRetina/BatchStandardRetina)

הערה: ערכי QAF תלויים מאוד במיקום הרשתית (למשל, הצללה מרכזית הנגרמת על ידי פיגמנט מקולרי). לכן, יש להשוות את ערכי QAF של דרוסן לערכי QAF סטנדרטיים של אותו אזור. כתנאי מוקדם לניתוח, StandardRetina יוצרת מפת enface של תמונות QAF ממוצעות (לדוגמה, מקבוצת ביקורת תואמת גיל). מפת enface המתקבלת מציגה מפה של פיקסל אחר פיקסל של ערך QAF ממוצע עבור הרשתית המרכזית.

1. ישנן שתי דרכים ליצירת רשתיות סטנדרטיות בתוך צינור הספקטרליס: הראשונה, AddToStandardRetina_OCT, מאפשרת מקרה חדש אחד בכל פעם למפת הפנים, ואילו השנייה, BatchStandardRetina, מוסיפה מספר מקרים בבת אחת.
   1. כדי להוסיף תמונה אחת בכל פעם, בחר תוספים | ספקטרליס | AddToStandardRetina_OCT ולבטל את מסך הפתיחה. כאשר חלון קופץ המציג את הטקסט בחר ספרייה המכילה ייצוא XML של Spectralis OCT, בחר את התיקיה ולחץ על בחר כדי לפתוח את BScan.
   2. כשמופיע חלון חדש המציג את הבקשה בחר ספרייה המכילה תמונות EnFace רשומות:, בחר בתיקייה המתאימה ולחץ על בחר.
   3. שימו לב לשלושת החלונות המוקפצים, חלון אחד בשם EnFaceStack המציג את התמונות המוערמות מהתיקייה שנבחרה בשלב השני, החלון השני שכותרתו Bscan Stack המציג את OCT BScan, וחלון שלישי המופיע באמצע עם התווית Choose Modality. בחר מודל מתוך EnFaceStack.
   4. בחר מודאליות והתבונן בחלון החדש שמופיע עם הבקשה בחר ספרייה המכילה את StandardRetina. אם ספרייה המכילה StandardRetina עדיין אינה קיימת, בחר תיקייה ריקה כדי ליצור StandardRetina חדש.
   5. בדוק את StandardRetina החדש, גלול למעלה ולמטה והזז את הסמן כדי להציג את הממוצע וסטיית התקן עבור מיקום ספציפי זה. לחץ על הכפתור קבל? כדי להוסיף את התמונה העדכנית ביותר ל- StandardRetina או למחוק אותה.
2. כדי להוסיף תמונות מרובות בו-זמנית, השתמשו ב-Batch_QAF_StandardRetina.
   1. תחילה, הכינו קובץ "מניפסט.txt" באותה תיקייה שבה נמצאים מזהי הרישיות וודאו שהוא מפרט את הנתיב היחסי ממיקום קובץ .txt ל-OCT ול-EnFaceStack. הפרד בין השניים באמצעות רווח טאבים וודא שאין רווח לבן נוסף לפני ומאחורי השמות. הקובץ אמור להיות דומה להגדרה זו:
      pathToOCT_1>pathToEnFaceStack_1>001/OD-OCT>001/OD-QAF
      pathToOCT_2>pathToEnFaceStack_2>002/OD-OCT>002/OD-QAF
   2. צור את הקובץ בתוכנת גיליון אלקטרוני ושמור אותו כקובץ txt. ודא שכל הנתיבים כוללים QAF של פרוסה (אותיות תו) כדי שקובץ המניפסט יפעל כראוי. התוספים ממוקמים תחת התפריט הנפתח תוספים | SpectralisBatch-Batch | QAF_StandardRetina.
   3. סגור את מסך הפתיחה והמתן עד שייפתח חלון חדש המציג את הבקשה בחר את הרשתית הרגילה הראשונית. בחר תיקייה עם StandardRetina קיים או בחר תיקייה ריקה כדי ליצור StandardRetina חדש.
   4. חפש בקשה בשם בחר Modality להופיע; ברירת המחדל היא QAF. ודא ששם הקובץ של המודאליות המתאימה תואם בדיוק לשם הקובץ של פרוסה בכל EnFaceStack ששמו מופיע בקובץ המניפסט. לאחר מכן, כאשר נפתח חלון המבקש מהמשתמש לבחור קובץ מניפסט (שתואר קודם לכן), לחץ על ביטול אם אין להוסיף קובץ מניפסט אחר לקובץ StandardRetina זה או בחר קובץ מניפסט אחר. בדוק את StandardRetina החדש בחלון חדש שכותרתו קבל?, והחלט אם להוסיף את האצווה העדכנית ביותר ל- StandardRetina או למחוק את האצווה האחרונה.
      הערה: התהליך של שילוב כל QAFs ל - StandardRetina עשוי להימשך זמן מה.

8. ביאור אזורי עניין לניתוח (תוסף בשימוש: Mark_BScans_OCT)

1. כדי לסמן נגעים (כגון דרוסן), פתח תוספים | ספקטרליס | Mark_BScans_OCT ובטל את בקשת הפתיחה. חפש חלון חדש עם התווית בחר ספרייה המכילה ייצוא XML של Spectralis OCT שיופיע. בחר את התיקיה הכוללת את OCT הרצוי ולחץ על אישור.
2. לאחר ש- FIJI טען את ה- OCT, התבונן בחלון החדש עם התווית בחר ספרייה המכילה תמונות פנים רשומות להופיע. בחר בספרייה המכילה את EnFaceStack ולחץ על בחר.
3. שלושה חלונות חדשים מופיעים כעת, אחד בשם EnFaceStack, אחד בשם BscanStack ואחד בשם User Parameters.
   1. החלון User Parameters מבקש מהמשתמש להזין את הפרמטרים הבאים: מזהה רישיות, שיופיע לאחר מכן בשם קובץ csv הפלט, רוחב פס ב- mm, רוחב קו enface, רוחב קו BScan ואטימות מסיכת האזור.
      1. רוחב הפס של הפרמטר במ"מ קובע את רוחב כל גוף ISO במילימטרים (מ "מ ). השתמש ברוחב קו Enface כדי לשנות את רוחב הקו של נגעים מסומנים בחלון שכותרתו EnFaceStack.
      2. רוחב הקו BScan קובע את רוחב הקו במחסנית Bscan של החלון. שים לב שהגדרת פרמטר זה ל- 1 היא הגדרת רוחב הקו הטובה ביותר ברוב המקרים.
      3. בחרו בין מסיכת פנים או מפת מרחק המוצגת בחלון נפרד כדי להחליט אם יש לצבוע את הפסים הפנימיים. לאחר מכן, לחץ על בוצע בחלון סמן ב- BScan בתוסף.
   2. לאחר מכן, כאשר תתבקש לבחור StandardRetina קיים, בחר את התיקיה המכילה את StandardRetina ולחץ על בחר. שים לב שאם נבחר StandardRetina, Mark_BScans_OCT הפלט יבחר את התוצאה z של המצב (של ערך QAF נמדד בהשוואה ל- StandardRetina). אם ערך QAF הגולמי מועדף, לחץ על ביטול והמתן לחלון חדש שכותרתו הודעה המזהירה שהתוצאות יהיו ערכים גולמיים, ולא ציוני z.
4. חפש חלון חדש שיופיע ויופיע המציג הנחיה בחר ספרייה המכילה את המצב שנשמר עם הנתונים שנשמרו. אם קיים קובץ שמירה, לחצו על הספרייה המכילה את הפרוסות | בחר. במקרה שאין לשמור התקדמות, בחר ביטול. חפש חלון חדש בשם Mark in BScan, ומתוך התפריט הנפתח, בחר שמור, התעלם, בוצע וסמן.
   1. סימן: התחל להוסיף ביאורים לאזורי העניין ב- BScan, עם פקודות דומות כמו בתוסף "Register_OCT_2" שהוסבר לעיל. כדי לסמן אזור, בחר התחל על-ידי לחיצה ימנית וגרירת סמן העכבר לסוף הנגע, ודא שהאפשרות סמן נבחרה בחלון סמן בסריקה B-Sscan , ולחץ על אישור. אזור העניין מסומן כעת ב- BScan זה.
   2. להתעלם: בחר התעלם בחלון סימון ב- BScan ולחץ על אישור כדי להתעלם מהסימון.
   3. שמר: בחר שמור בחלון סמן ב- BScan ולחץ על אישור כדי להציג חלון חדש, המכיל את הבקשה בחר ספרייה לשמירת מצב. בחר תיקיה קיימת או צור תיקיה חדשה. פתח קבצים קיימים כבר על-ידי הפעלת "Mark_BScans_OCT" ובחר בספרייה המכילה את מצב השמירה כאשר החלון בחר ספרייה המכילה את המצב שנשמר מופיע.
      הערה: לא ניתן לאחסן מצבי שמירה מרובים בספריה אחת; לא ניתן לעבור בקלות בין שמירת מדינות מאזור אחד לאחר (למשל, גרמנית לארה"ב).
   4. לעשות: בחר בוצע בחלון סימון ב- BScan ולחץ על אישור כדי לגרום לחלון חדש עם התווית בחר מודאליות להופיע.
   5. כאשר מופיעה הנחיה עם התווית הבא את המודאליות הנכונה מעל ערימת הפנים, הבא את המודאליות הנקראת QAF למעלה, אשר יושרה באמצעות "Register_OCT_2". בצע פעולה זו על-ידי גלילה ב- EnFaceStack, בחירת החלון En face Stack או לחיצה על החץ ימינה או שמאלה. שים לב ששם המודל מוצג בפינה השמאלית העליונה.
   6. כדי לבדוק ולסמן טוב יותר את הנגעים, התקרבו לחלון Bsscan. לחץ על חלון B-Scan , הצבע על העכבר לכיוון התקרבות ולחץ על מקש + ; כדי להקטין את התצוגה, הקש על מקש -.
   7. גלול בערימת BScan על ידי גלילה למעלה או למטה בעכבר, גרירת הסרגל בתחתית שמאלה או ימינה כדי לעבור בסריקה, או על ידי בחירת מסגרת B-Scan ולחיצה על מקשי החצים ימינה ושמאלה במקלדת. שים לב שסקירה כללית של האזור הנוכחי במחסנית BScan מסופקת על-ידי הקו האדום בחלון EnFaceStack, ובפינה השמאלית העליונה של חלון BScan שבו מוצג מספר BScan (לדוגמה, 31/120).
5. לחץ על אישור כדי ליצור קובץ .tsv חדש בתיקייה "OD_OCT" או "OS_OCT" המתאימה. שים לב ששם הקובץ .tsv יורכב מ- "Mark_Bscans_OCT" בתוספת מזהה המארז שהוזנן, הרוחב והמודאליות שנבחרה בשלב האחרון של Mark_Bscans_OCT. בנוסף, "iso-hulls" מקודדים בצבע של drusen יוצגו כעת ב - EnFaceStack.

תוצאות

הצגת הפלט
כדי לנתח ולהסיק מסקנות נאותות מהתוצאות, חשוב להבין את קובץ הפלט של Mark_Bscans_OCT. שלוש העמודות הראשונות מסומנות לאחר מזהה הרישיות, הצדדיות של הקובץ ואופן ההדמיה שנבחר. העמודה הרביעית מוזכרת לפי מצב ומסומנת כ-z-score. שימו לב שנכון לכתיבת טקסט זה, מארק BScans יכול לחשב רק את כל הנגעים בבת אחת; השורות מתייחסות לגופות ISO, שהמרחקים שלהן מהקצה החיצוני של הנגע מצוינים בעמודות התחתונות והעליונות של הגיליון האלקטרוני. Iso-hulls מודדים מיקוד אוטומטי בציוני z (במקרה של QAF) בהיקף מוגדר סביב הנגע. שים לב שניתן למצוא את הערך המינימלי של פיקסל בגוף iso בעמודות המסומנות min, העמודות המסומנות בחציון, max, mean ו- stdev, בהתאמה מכילות את החציון, המקסימום, הממוצע וסטיית התקן של הממוצע של ערכי הפיקסלים בגוףISO. העמודה n מכילה את המספר הכולל של פיקסלים בגוף איזו. איור 1 מראה דרוסן רך מסומן יחיד של מטופל זכר בן 84 עם ניוון מקולרי בינוני הקשור לגיל (iAMD).

איור 2 מראה את העין השמאלית של מטופל מייצג עם כונני SDD המסומנים בכלי QAF-Workflow (איור 3). SDDs בחולה זה היו קשורים למיקוד אוטומטי מופחת (z-score = -0.4 ± 0.2). באופן דומה, גוף ה-iso סביב ה-SDD הפגין מיקוד אוטומטי מופחת (למשל, גוף ה-iso הקרוב ביותר = -0.3 ±-0.3) בהשוואה ל-StandardRetina. הסבר מתקבל על הדעת לתופעה זו עשוי להיות השפעות הצללה (שקיפות מופחתת) של נגעי SDD על RPE. השימוש בכונני SDD היה למופת. הכלי מאפשר להעריך את רמות המיקוד האוטומטי המקומי גם בנגעים אחרים, כגון דרוסן. יתר על כן, הכלי מאפשר מעקב אחר שינויים במיקוד אוטומטי מנגעים לאורך זמן.

איור 1: דרוסן רך מסומן יחיד של מטופל זכר בן 84 עם ניוון מקולרי בינוני הקשור לגיל (iAMD). (A) תמונת QAF של עין שמאל עם דרוסן מסומן. (B) תקריב של הדרוסן: מרכז חום המייצג את הדרוסן המסומן ופסים צבעוניים המייצגים את קליפות האיזו-קליפות שמסביב. הטבלה הבאה מתארת את קובץ הפלט. ערכי QAF drusen מושווים לערכי QAF המתאימים של האקסצנטריות המתאימה מה- StandardRetina. התוצאה היא ציוני z המייצגים סטייה מהממוצע של אזורים שאינם מושפעים. התיבה הכחולה מציגה משמאל לימין: מזהה המקרה, צידיות העין, אופן השימוש והפלט הרצוי (במקרה זה, z-scores). עמודות בתוך התיבה הכתומה מציגות את גבולות השטח הנמדד במילימטרים (תחתון = חסם תחתון, עליון = חסם עליון). התיבה הירוקה מסמנת את העמודות המציגות את מדידות QAF. משמאל לימין, אלה מכילים את המינימום, החציון, המקסימום, מספר הפיקסלים, הממוצע וסטיית התקן של הממוצע. כל שורה מייצגת איזו-גוף, שורות בתוך התיבה הכחולה מייצגות ערכים בתוך הנגע, ושורות בתוך התיבה הסגולה מציגות את קליפות האיזו-קליפה המקיפות כל נגע (מלמעלה למטה עם הגדלת המרחק לנגע). סרגל קנה מידה = 1 מ"מ. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: SDDs מסומנים בתמונת QAF של מטופלת בת 80 עם AMD מוקדם. (A) ניתן לראות SDD בתמונת QAF. אותה תמונת QAF מוצגת עם ביאורים מוטבעים של כונני SDD. (B) סביב כל נגע מסומן, קליפות האיזו-קליפות מתוארות בקידוד צבע (ירוק בהיר, ירוק כהה ואדום). (C) גרסה מוגדלת של המלבן הכחול. הקצה החיצוני של כל SDD מסומן בכחול. קיצורים: QAF = autofluorescence כמותי; AMD = ניוון מקולרי הקשור לגיל; SDD = משקעים דרוסנואידים תת-רשתית. סרגל קנה מידה = 1 מ"מ. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: זרימת עבודה לקביעת מיקוד אוטומטי של נגעים. איור זה ממחיש את תוספי התוכנה הדרושים לקביעת מיקוד אוטומטי ספציפי לנגע. (A) התמונה מציגה תמונת QAF מקודדת בצבע שניתן להשתמש בה כדי להמחיש את ההתפלגות של ערכי QAF, אך אין להשתמש בה לניתוח נוסף. (B) מוצגת תמונת QAF בחזית, עם תמונת אינפרא-אדום מסריקת SD-OCT ברקע. זה אמור לדמיין את היישור באמצעות התפצלויות כלי שיט. ניתן לעשות זאת באמצעות תוסף Register_OCT_2. (C) StandardRetina המשמש למדידת ערכי ציון z של נגעים. ניתן ליצור StandardRetinas באמצעות StandardRetina/BatchStandardRetina. (D) מתואר BScan עם חצים כחולים המצביעים על SDDs, המסומנים בקווים צהובים (הערה: נגעים מסומנים תמיד מתחת ל-RPE ללא תלות במיקום בכיוון z). (E) כל הנגעים המסומנים נראים מוטבעים על תמונת QAF (ראו איור 1). שני השלבים האחרונים מתבצעים באמצעות תוסף Mark_BScans_OCT. קיצורים: AF = autofluorescence; QAF = אוטופלואורסצנטיות כמותית; SDD = פיקדון דרוסנואיד תת-רשתית; IR = אינפרא אדום; RPE = אפיתל פיגמנט ברשתית; SD-OCT = טומוגרפיית קוהרנטיות אופטית בתחום ספקטרלי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

זרימת עבודה זו מספקת מדריך שלב אחר שלב לשימוש בכלי תוסף FIJI בקוד פתוח כדי לקבוע ולהשוות מיקוד אוטומטי של נגעים ספציפיים ל- AMD. התוספים מספקים תבניות קלות לשימוש שאינן דורשות ידע בקידוד וניתנות ליישום על ידי רופאים ללא תמיכה טכנית²⁷. למיטב ידיעתנו, כלים אלה הם יחידים מסוגם לכימות מיקוד אוטומטי ספציפי לנגע.

ערכי QAF משתנים באופן טבעי על פני הרשתית, כאשר הערכים גבוהים יותר בפריפריה ונמוכים יותר במקולה עקב פיזור לא אחיד של ליפופוסצין ומלנוליפופוסצין בתוך הרשתית, מיקוד אוטומטי נמוך של כלי דם ופיזור פיגמנט מקולרי לא אחיד. בשל השונות הגבוהה של רמות QAF טבעיות ברשתית, ניתוח ערכי QAF מוחלטים של נגעים ישירות אינו גישה מבטיחה. לדוגמה, נגע היפואוטופלואורסצנטי בפריפריה עשוי עדיין להיות בעל ערכי QAF מוחלטים גבוהים יותר מאשר רמות פלואורסצנטיות פיזיולוגיות של המקולה. השימוש ב- StandardRetina והשימוש בציוני z למדידת רמות הפלואורסצנטיות של דרוסן נכונים לשונות טבעית זו של ערכי QAF.

ציון z הוא מדידה מספרית של הקשר בין אזור של ערך עניין לממוצע ב- StandardRetina. הוא מחושב על ידי חיסור הממוצע מאדם מהממוצע מה- StandardRetina באותו מיקום, ולאחר מכן חלוקת התוצאה בסטיית התקן. סטנדרטיזציה זו מאפשרת השוואה בין תמונות QAF שונות, שכן ציון z מציין כמה סטיות תקן ערך שונה מהממוצע. ציון z חיובי מציין שהערך נמצא מעל הממוצע, בעוד שציון z שלילי מציין שהוא מתחת לממוצע.

חשוב לציין כי ייתכנו מלכודות פוטנציאליות שיש לקחת בחשבון. בעוד ששיטה זו לוקחת בחשבון את הכמות המשתנה של רמות מיקוד אוטומטי ברחבי הקרן, ייתכן שזו עדיין לא הדרך המדויקת ביותר למדוד ולהשוות מיקוד אוטומטי של RPE. לאנשים יש רמות וטופוגרפיה שונות של פיגמנט לוטאלי מקולרי, ונגעים עלולים להשפיע על שקיפות הרשתית שמעל^28,29. לכן סביר שהמיקוד האוטומטי המופחת שנמדד באזורים של SDD (ראו תוצאות מייצגות) הוא תוצאה של השפעות הצללה ולא ירידה בפלואורופורים ב-RPE^30,31,32.

אנו עובדים כעת על זרימת עבודה כדי לקחת בחשבון את החזרות הרשתית, עובי ופיגמנט מקולרי מכומת (באמצעות מיקוד אוטומטי ירוק וכחול) עם מודלים מעורבים ליניאריים. בנוסף, עד כה, QAF משתמש בגורם תיקון תלוי גיל כדי להסביר opacification לנטיקולרי שמתעלם מהבדלים בין-אישיים באופסיפיקציה הלנטיקולרית של משתתפים בגיל³³ דומה. לכן אנו עובדים כעת על זרימת עבודה עבור גורם תיקון מותאם אישית של autofluorescence lenticular ו opacification. כדי לחלץ באופן אמין מידע של מיקוד אוטומטי מנגעים קטנים, יש צורך באמינות נאותה של תמונות QAF לבדיקה חוזרת. כדי להבדיל עוד יותר בין תמונות QAF שבהן ניתוח מפורט יותר הוא בר קיימא, אנו חוקרים "מדדי אמינות תמונה QAF" שיכולים לחזות את אמינות הבדיקה החוזרת של תמונות QAF. בשלב הנוכחי, הגישה הנבונה היא לרכוש תמונות כפולות ולחקור את אמינות הבדיקה החוזרת של מיקוד אוטומטי ספציפי לנגע.

השיטה המוצגת של ניתוח נוסף של iso-קליפות של נגעים היה קשה מבחינה טכנית ליישם, כמו iso-קליפות של נגעים שכנים להתמזג. אזורים של איזו-קליפות ממוזגות יכולים להיות מאופיינים באופן ייחודי בהתאם לנגע הנחשב. הפתרון שלנו היה להתייחס לכל הנגעים מסוג אחד כאל נגע אחד ולנתח את הפריפריה שלהם כאיזו-גוף משותף. שיטה זו, לעומת זאת, מפחיתה באופן דרסטי את היכולת למדוד את קליפות האיזו-קליפות של דרוסן בודד ועשויה להיחשב למלכודת נוספת של טכניקה זו. שיטות מתוחכמות יותר מבחינה טכנית להתחשבות בגופי איזו-קליפה ממוזגים או דיווח מושהה של מיקוד אוטומטי באזורים של גופי איזו-קליפה ממוזגים יכולים להקל על ניתוח המיקוד האוטומטי בהיקף הנגעים בעתיד.

השתמשנו ב-AMD כמחלת מודל עבור מחקר זה. ניתן להתאים את זרימת העבודה לחקר נגעים גם במחלות אחרות. עד כה, QAF שימש במחלות כוריורטינליות רבות, כולל מחלת Stargardt רצסיבית, מחלות הקשורות Bestrophin-1, צורות שונות של רטיניטיס פיגמנטוזה, רטינופתיה חיצונית סמויה זונלית חריפה, pseudoxanthoma elasticum, ואחרים 17,33,34,35,36,37. מכיוון שזרימת עבודה זו משתמשת בתוכנת קוד פתוח, אנו מעודדים אחרים לשכפל עבודה זו בקביעת מיקוד אוטומטי ספציפי לנגע ולהרחיב את הידע שלנו על הפרעות רשתית. לסיכום, אנו מציגים זרימת עבודה כדי לקבוע ולהשוות רמות AF של נגעים שונים ברשתית לאורך המקולה. זרימת עבודה זו סוללת את הדרך לניתוח מעמיק יותר של מיקוד אוטומטי ויכולה להקל על הפיתוח של סמנים ביולוגיים חדשים ב- AMD ומעבר לה.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BatchStandardRetina plugin	n.a.	n.a.	n.a.
FIJI (Image J)	n.a.	n.a.	n.a.
Mark_Bscans_OCT plugin	n.a.	n.a.	n.a.
Microspft office	Microsoft	n.a.	n.a.
QAF_xml_reader plugin	n.a.	n.a.	n.a.
Register_OCT_2 plugin	n.a.	n.a.	n.a.
Spectralis	Heidelberg Engineering	n.a.	QAF extension
StandardRetina plugin	n.a.	n.a.	n.a.