תצפית על התפקוד הסיסטולי של פרוזדורים ימניים מבודדים משרקנים

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה יעילה לסריקת תרופות המשפרות את התכווצות שריר הלב באמצעות פרוזדורים ימניים מבודדים משרקנים.

Abstract

אי ספיקת לב כרונית שכיחה (CHF) מאופיינת בתפקוד לקוי של מילוי חדרים ו/או פליטה, מה שמוביל לתפוקת לב שאינה יודעת שובע ולשכיחות מוגברת. הירידה בתפקוד הסיסטולי של הלב היא גורם מפתח בפתוגנזה של CHF. תפקוד סיסטולי הוא פשוט מילוי דם מחומצן בחדר השמאלי, ואחריו הדם נשאב בכל הגוף במהלך פעימות לב. לב חלש וחוסר היכולת של החדר השמאלי להתכווץ כראוי עם פעימות הלב מצביעים על תפקוד סיסטולי לקוי. מעריכים כי צמחים מסורתיים רבים מחזקים את התפקוד הסיסטולי של הלב אצל מטופלים. עם זאת, שיטות ניסיוניות יציבות ויעילות לסינון תרכובות המשפרות את התכווצות שריר הלב עדיין חסרות בתהליך המחקר של הרפואה האתנית. כאן, אם ניקח את הדיגוקסין כדוגמה, ניתן פרוטוקול שיטתי וסטנדרטי לסינון תרכובות המשפרות את התכווצות שריר הלב על ידי שימוש בפרוזדורים ימניים מבודדים משרקנים. התוצאות הראו כי דיגוקסין יכול לשפר באופן ניכר את ההתכווצות של הפרוזדור הימני. פרוטוקול שיטתי וסטנדרטי זה נועד לשמש כהתייחסות מתודולוגית לסינון המרכיבים הפעילים של תרופות אתניות בטיפול ב-CHF.

Introduction

אי ספיקת לב נגרמת על ידי אוטם שריר הלב, מיוקרדיופתיה, עומס יתר המודינמי, דלקת וגורמים אחרים לפגיעות בשריר הלב, אשר משנים את האנטומיה והפעילות של שריר הלב ובסופו של דבר מובילים לכשל בשאיבה או במילוי החדר. דפיקות לב, עייפות ואגירת נוזלים הם התסמינים הקליניים העיקריים¹. CHF הוא מצב של אי ספיקת לב כרונית שניתן לשמר, להידרדר או להראות חוסר פיצוי לאורך זמן, והשכיחות והשכיחות שלו עולות עם גיל^שנתיים. הירידה בתפקוד הסיסטולי של הלב היא גורם מפתח בפתוגנזה של CHF³. הטיפול הרפואי הנוכחי במחלה כולל בעיקר שימוש בתרופות להורדת לחץ דם כגון מעכבי אנזים ממיר אנגיוטנסין, β-אדרנוצפטורים (המעכבים הפעלה מוגזמת של המערכת הנוירו-הורמונלית, כלומר המערכת הסימפתטית ומערכת רנין-אנגיוטנסין-אלדוסטרון), או משתנים (המפחיתים את הגודש)⁴. עם זאת, הסימנים הקליניים של אי ספיקת לב הנגרמים על ידי ירידה בתפוקת הלב והרזרבה אינם מטופלים לעתים קרובות במחקרים הבוחנים את ההשפעה של טיפולים רפואיים אלה⁵.

תרופות אינוטרופיות חיוביות נועדו להגביר את התכווצות שריר הלב. גליקוזידים לבביים, מעכבי פוספודיאסטראז ואגוניסטים לקולטן β-אדרנרגי משמשים כתרופות אינוטרופיות חיוביות לטיפול באי ספיקת לב. גליקוזידים לבביים הם בעיקר נגזרות דיגיטליס ; דוגמה לכך היא, דיגוקסין, שהיא הנגזרת הנפוצה ביותר של Digitalis ונגזרת מ-Digitalis lanata (כפפת שועל לבנה)⁶. הם נקשרים באופן סלקטיבי ל-Na⁺/K⁺-ATPase על קרום התא כדי להגדיל את ריכוז הסידן התוך תאי ובכך לשפר את התכווצות הלב ואת נפח השבץ מבלי להעלות את צריכת החמצן, ובכך לשפר את יעילות הלב⁷. מלבד גליקוזידים לבביים, רוב התרופות האינוטרופיות החיוביות, כגון מעכבי פוספודיאסטראז ואגוניסטים לקולטן β-אדרנרגי, מגבירות את קצב הלב ואת צריכת החמצן בשריר הלב תוך הגדלת עומס הסידן בתאי שריר הלב כדי לשפר את התכווצות שריר הלב, מה שעלול לגרום להפרעות קצב ותת לחץ דם חמורות מבחינה קלינית ובכך לתמותה מוגברת⁸. לכן, היישום הקליני של תרופות אינוטרופיות אלה מוגבל. על מנת להימנע מסיבוכים הנגרמים על ידי רמות סידן תוך תאיות גבוהות, יש צורך לפתח מודולטורים אינוטרופיים בטוחים ויעילים ביותר לטיפול ב-CHF (איור 1).

בעשורים האחרונים נערכו מחקרים רבים לייצור וניתוח תרכובות שיכולות לתמוך בתכונות האינוטרופיות החיוביות של המודינמיקה של הלב. תרופות סיניות מסורתיות רבות (TCM), כגון Euodia rutaecarpa (Juss.) Benth., Apocynum venetum L., ו-Sophora alopecuroides L., בין היתר, יכולים לשפר את התכווצות שריר הלב ^9,10,11. מחקרים הוכיחו כי הרפואה הסינית המסורתית והמונומרים הפעילים שלה יכולים להפעיל השפעות אינוטרופיות חיוביות באמצעות מנגנונים שונים בהשוואה לתרופות אינוטרופיות. לדוגמה, ליגוזינדיול, צורה של ליגוסטרזין שעבר מתילציה ב-C₂ ו-C₅ (מרכיב פעיל אחד של קנה שורש סצ'ואן לובאג'), המשפר משמעותית את ההתכווצות של לבבות חולדות מבודדים על ידי שיפור מעברי הסידן ברטיקולום סרקופלזמי מבלי להגביר את קצב הלב, עשוי להיות בעל פחות תופעות לוואי ומהווה טיפול טוב יותר ל-CHF¹². בנוסף, מטרין הוא אלקלואיד המופק מצמח הרפואה הסינית המסורתית Sophora flavescens Ait. מטרין יכול לעכב את הוויסות של ביטוי חלבון_3-AR β ולהפחית את ביטוי ה-eNOS בחולדות מודל אי ספיקת לב, ובכך לשפר את התכווצות שריר הלב שלהן¹³. עם זאת, במחקר הרפואה האתנית, חסרות שיטות ניסיוניות יציבות ויעילות לסינון תרכובות שיכולות לשפר את התכווצות שריר הלב.

ידוע כי בהשוואה למכרסמים אחרים, לשרקנים יש מאפייני אלקטרופיזיולוגיה וטיפול בסידן הדומים יותר לאלה של בני אדם¹⁴. מצד אחד, האלקטרוקרדיוגרמה של שרקנים דומה מספיק לזו של בני אדם, והטיפול שלהם ב-Ca²⁺ דומה יותר לפיזיולוגיה האנושית מאשר לזו של חולדות או עכברים^15,16. מצד שני, מודלים חישוביים של קרדיומיוציטים של שרקנים עברו מחקר מקיף וכוללים תת-מערכות תאיות חיוניות, כולל אנרגטיקה ומטבוליזם של מיני חמצן תגובתי¹⁷. לכן, פרוזדורים ימניים מבודדים משרקנים נמצאים בשימוש נרחב לסינון תרכובות המשפרות את התכווצות שריר הלב. כאן, אנו לוקחים דיגוקסין כדוגמה כדי לספק פרוטוקול שיטתי וסטנדרטי לסינון תרכובות המשפרות את התכווצות שריר הלב על ידי שימוש בפרוזדורים ימניים מבודדים משרקנים. לכן, עבודה זו מספקת התייחסות מתודולוגית לסינון החומרים הפעילים של תרופות אתניות בטיפול ב-CHF.

Protocol

פרוטוקול הניסוי נערך בהתאם לדרישות השימוש בחיות מעבדה והוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטה הרפואית נינגשיה. שרקנים זכרים של דאנקין-הארטלי במשקל 300-450 גרם שימשו למחקר הנוכחי. השפעת הדיגוקסין על ההתכווצות נצפתה בפרוזדורים ימניים מבודדים משרקנים (איור 2).

1. הכנת חמצון לעלייה הימנית המבודדת של שרקנים

1. הכינו את מכשירי הניסוי, כולל מערכת קליטה ועיבוד אותות ביולוגיים, מתמר כוח שריר JH-2, אמבט מגנוס, וו אוורור בצורת L, מספריים עבים, צלחת פטרי, פרפין וכו' (ראה טבלת חומרים).
2. הכן 1,000 מ"ל של תמיסת Krebs-Henseleit (תמיסת K-H) על ידי הוספת 7.02 גרם NaCl (120.0 מ"מ), 2.10 גרם NaHCO₃ (25.0 מ"מ), 0.30 גרם KCl (4.0 מ"מ), 0.07 גרם MgSO₄ (0.6 מ"מ), 0.07 גרם NaH₂PO₄ (0.6 מ"מ), 0.28 גרם CaCl₂ (2.5 מ"מ) ו-1.98 גרם גלוקוז (11.0 מ"מ) ל-1,000 מ"ל מים מזוקקים כפולים, ולשטוף את אמבט מגנוס פעמיים עד שלוש (ראה טבלה 1 וטבלת החומרים).
   הערה: שמור על הטמפרטורה של תמיסת KH על 37 מעלות צלזיוס ±-1 מעלות צלזיוס.
3. הכן 100 מ"ל של תמיסת KH דלת סידן על ידי הוספת 0.70 גרם NaCl (120.0 מ"מ), 0.21 גרם NaHCO₃ (25.0 מ"מ), 0.03 גרם KCl (4.0 מ"מ), 0.01 גרם MgSO₄ (0.6 מ"מ), 0.01 גרם NaH₂PO₄ (0.6 מ"מ), 0.01 גרם CaCl₂ (0.8 מ"מ) ו-0.20 גרם גלוקוז (11.0 מ"מ) ל-100 מ"ל מים מזוקקים כפולים (ראה טבלה 1 וטבלת החומרים).
4. הנח כ-20 מ"ל מתמיסת 37 מעלות צלזיוס KH באגן ההפעלה (ראה טבלת חומרים).
5. מורחים 5 מ"מ של פרפין עבה על תחתית צלחת הפטרי, ולאחר מכן ממלאים את צלחת הפטרי בתמיסת 37 מעלות צלזיוס (ראה טבלת חומרים).
6. התקן את וו האוורור בצורת L בקצה צינור הלטקס של שלפוחית השתן, הכניס אותו לצלחת הפטרי והתאם ל-1-2 בועות/שניות (ראה טבלת חומרים).
   הערה: כוונן לאט את הבועות; אם הפעולה מהירה מדי, החמצן עלול להיגמר בקרוב.

2. הכנת פרוזדורים ימניים מבודדים משרקנים

1. שקלו שרקנים על משקל (ראו טבלת חומרים).
2. השראת הרדמה באמצעות קופסת אינדוקציה עם 5% איזופלורן ב-100% חמצן, ולאחר מכן עבור לקונוס אף עם 1.5%-3% איזופלורן לתחזוקה (ראה טבלת חומרים).
3. חותכים את עורק הצוואר במספריים גסים, וגורמים להוצאה לפני שמניחים אותו על צלחת. לאחר מכן, בעזרת מספריים, פתחו את בית החזה (החל מתהליך ה-xiphoid והפרידו לחלוטין את הצדדים כדי לחשוף את הלב), וקילפו את קרום הלב.
   1. החזיקו את הלב ביד שמאל, השתמשו ביד ימין כדי לחתוך את הלב משורש אבי העורקים, והניחו אותו במהירות באגן הניתוח עם תמיסת KH. לבסוף, לחצו בעדינות על החדר עם היד פעמיים-שלוש, סחטו החוצה את דם החדר והניחו את הלב בצלחת הפטרי.
      הערה: הפעולה צריכה להיות מהירה ולהסתיים תוך 2-5 דקות, ויש לשלוט בטמפרטורה על 35 מעלות צלזיוס. יש לשלוט על הטמפרטורה של תמיסת KH ב-37 מעלות צלזיוס.
4. מקבעים את קצה הלב לצלחת הפטרי המצופה פרפין בעזרת מחט תוך מתן חמצן (60 בועות לדקה).
5. זהה את האטריום הנכון.
   הערה: אצל שרקנים, הפרוזדורים מופרדים על פני הגחון שלהם על ידי עורק הריאה ובגב על ידי אבי העורקים. גם הפרוזדור השמאלי וגם הימני מחוברים לחדרים כמו "משולש הפוך", והאטריום הימני מעט קטן יותר מהאטריום השמאלי ובעל קצוות לא אחידים. שריר הלב של החדר הימני דק, והקצה העליון של הקריסה הוא הפרוזדור הימני; החדר השמאלי נפוח יותר, והתפלגות כלי הדם הכליליים עשירה¹⁸ (איור 3).
6. הרם בעדינות את קצה האטריום הימני בעזרת מלקחיים עיניים, וחתוך לאורך הצומת האטריו-חדרי (ראה טבלת חומרים).
   הערה: הימנע מפגיעה בצומת הסינו-פרוזדור, ונסה לחתוך קרוב יותר לחדר תוך חיתוך לאורך צומת הפרוזדור. בשלב זה ניתן לראות התכווצות קצבית אוטומטית של האטריום הימני.
7. השתמש ב-4-0 תפרים כירורגיים (ראה טבלת חומרים) כדי לקשור את החלק העליון והתחתון של הפרוזדור הימני, בהתאמה (שני הקצוות של "הקו האלכסוני"), כאשר קצה אחד לולאה והקצה השני שמאל עם קצה חוט ארוך שגם הוא לולאה.
   הערה: נסה לקשור כמה שפחות רקמות בעת קשירת שני הקצוות של "הקו האלכסוני" של הפרוזדורים.

3. מדידה ורישום של התפקוד הסיסטולי של פרוזדורים ימניים מבודדים משרקנים

1. הפעל את המחשב והיכנס למערכת קליטת ועיבוד האותות הביולוגיים (ראה טבלת חומרים). כוונן את הרווח (50 mV), קבוע הזמן (DC), המסנן (20 הרץ) ומהירות הסריקה (1.00 s/div) לאחר קביעת ערוץ החיבור (ערוץ ראשון, מתח).
2. תלו קצה אחד של הדגימה על וו האוורור בצורת L עם צלחת הפטרי והחמצן ליד אמבט מגנוס. תלו את הקצה השני של הדגימה על מתמר כוח השריר JH-2 (ראה טבלת חומרים).
3. התבונן בעקומה הסיסטולית הפרוזדורית, כוונן את העומס המוקדם ל-0.5-1.0 גרם והמתן עד שהוא יתייצב (כ-30 דקות).
   הערה: החלף את תמיסת KH כל 20 דקות. כאשר הוא תקין, קח את העקומה הנצפית כסטנדרט, וסמן "נורמלי". אם המסך נסרק מעט מהר, יש להאט זאת.
4. יש לתת 0.2 מ"ל של תמיסת K-H דלת סידן, ולהתבונן במשך 5 דקות עד שהעקומה כבר לא יורדת.
5. יש לתת 0.2 מ"ל של 5% דיגוקסין (ראה טבלת חומרים), להתבונן במשך 5 דקות, לשטוף שלוש פעמים ולאחר מכן לחזור לקדמותו.
   הערה: סמן את הניהול. כאשר ההשפעה ברורה, סרוק את המסך מהר יותר. כאשר העקומה כבר לא עולה, כלומר כאשר משרעת ההתכווצות כבר לא גדלה, יש לשטוף שלוש פעמים במהירות; אחרת, תתרחש הפרעות קצב, אשר תשפיע על תוצאות ניסויי התרופות הבאים.
6. אסוף את הנתונים ושמור אותם בתקליטון.

תוצאות

ירידה בהתכווצות שריר הלב גורמת לתפוקת לב לא מספקת, מה שמוביל ל-CHF (איור 1). פרוטוקול זה איפשר רישום של ההשפעות של תרופות שונות על התפקוד הסיסטולי של פרוזדורים ימניים מבודדים משרקנים ולאחר מכן סינון מהיר של תרכובות מתרופות אתניות המשפרות את התכווצות שריר הל...

Discussion

הפעילות הקצבית הרגילה של הלב דורשת סביבה פיזית וכימית מתאימה, וכך גם פעילות הפרוזדורים הימניים המבודדים. פרוזדורים ימניים מבודדים מהעצבוב של הגוף ומההשפעה הישירה של גורמים הומורליים מערכתיים, כלומר ניתן להבחין בשינויים בפעילות הפרוזדורים הימניים בעת שינוי התרופות אל?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-0 surgical suture	Yangzhou Fuda Medical Devices Co., Ltd
5% Digoxin (soluble in dimethyl sulfoxide)	TCI Shanghai	D1828	CAS: 20830-75-5; Purity: >96.0%
BL-420N biological signal acquisition and processing system	Chengdu Tai Meng Software Co., Ltd	1700142S
CaCl2	Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd	S24110	CAS: 10043-52-4; Purity: 96%
Glucose	Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd	S11022	CAS: 50-99-7; Purity: 99%
Isoflurane	RWD Life Science Co., Ltd	R510-22-16
JH-2 muscle force transducer	Institute of Aerospace Medical Engineering, Beijing, China
KCl	Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd	S24120	CAS: 7447-40-7; Purity: 99.5%
Magnus bath	Shanghai Future Experimental Equipment Co., Ltd	L046525
MgSO4	Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd	S24253	CAS: 7487-88-9; Purity: 98%
NaCl	Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd	S24119	CAS: 7647-14-5; Purity: 99.5%
NaH2PO4	Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd	S24161	CAS: 7558-80-7; Purity: 99%
NaHCO3	Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd	S24153	CAS: 144-55-8; Purity: 99.8%
Operating basin	Guangzhou Telekuan Medical Instrument Co., Ltd		305 mm x 230 mm
Ophthalmic forcep	Suzhou Shuanglu Medical Instrument Co., Ltd
Ophthalmic operating scissor	Suzhou Shuanglu Medical Instrument Co., Ltd
Paraffin	Leica Biosystems	39601095
Petri dish	Corning	430167	100 mm x 20 mm
Rodent anesthesia machine	Shanghai Yuyan Instruments Co., Ltd		ABS type (single channel)
Scale	Shanghai Yueping Scientific Instrument Co., Ltd	YP1002
Surgical plate	Zhengzhou Ketai Experiment Equipment Co., Ltd		21 cm x 31 cm
Tissue scissor	Suzhou Shuanglu Medical Instrument Co., Ltd	SL0023