기니피그에서 고립된 우심방의 수축기 기능 관찰

요약

본 프로토콜은 기니피그에서 분리된 우심방을 사용하여 심근 수축을 향상시키는 약물을 스크리닝하는 효율적인 방법을 설명합니다.

초록

일반적인 만성 심부전(CHF)은 심실 충전 및/또는 배출 기능의 손상이 특징이며, 이는 만족할 수 없는 심박출량과 발병률 증가로 이어집니다. 심장 수축기 기능의 저하가 만성심부전 발병의 핵심 요인입니다. 수축기 기능은 단순히 좌심실에 산소가 공급된 혈액을 채운 다음 심장 박동 중에 혈액을 몸 전체로 펌핑하는 것입니다. 심장이 약하고 심장 박동이 있을 때 좌심실이 적절하게 수축할 수 없다는 것은 수축기 기능이 좋지 않음을 나타냅니다. 환자의 심장 수축기 기능을 강화하기 위해 많은 전통 허브가 제안되었습니다. 그러나 심근 수축성을 향상시키는 화합물을 스크리닝하기 위한 안정적이고 효율적인 실험 방법은 민족 의학 연구 과정에서 여전히 부족합니다. 여기에서는 디곡신을 예로 들면, 기니피그에서 분리된 우심방을 사용하여 심근 수축성을 향상시키는 화합물을 스크리닝하기 위한 체계적이고 표준화된 프로토콜이 제공됩니다. 그 결과 디곡신이 우심방의 수축성을 현저하게 향상시킬 수 있음을 보여주었습니다. 이 체계적이고 표준화된 프로토콜은 만성 만성심부전 치료에서 민족 의약품의 활성 성분을 스크리닝하기 위한 방법론적 참고 자료 역할을 하기 위한 것입니다.

서문

심부전은 심근경색, 심근병증, 혈역학적 과부하, 염증 및 기타 심근 손상의 원인으로 인해 발생하며, 이는 심근의 해부학적 구조와 활동을 변형시키고 궁극적으로 심실 펌핑 또는 충전의 실패로 이어집니다. 심계항진, 피로감, 체액 저류가 주요 주요 임상 증상이다¹. 만성 심부전은 시간이 지남에 따라 유지, 악화 또는 보상 상실을 보일 수 있는 만성 심부전 질환이며,²세에 따라 발병률과 유병률이 증가합니다. 심장 수축기 기능의 저하가 CHF³ 발병의 핵심 요인입니다. 현재 이 질병에 대한 의학적 치료법은 주로 안지오텐신 전환 효소 억제제, β-아드레날린 수용체(신경 호르몬계, 즉 교감신경계와 레닌-안지오텐신-알도스테론 체계의 과도한 활성화를 억제함) 또는 이뇨제(울혈을 감소시킴)와 같은 항고혈압제의 사용과 관련이 있습니다^.4. 그러나 심박출량과 예비력 감소로 인한 심부전의 임상적 징후는 이러한 의학적 치료의 영향을 조사하는 연구에서 다루어지지 않는 경우가 많다⁵.

양성 수축성 약물은 심근 수축력을 증가시키기 위해 고안되었습니다. 심장 배당체, 포스포디에스테라제 억제제 및 β-아드레날린성 수용체 작용제는 심부전 치료를 위한 양성 수축성 약물로 사용됩니다. 심장 배당체는 주로 Digitalis 유도체입니다. 예를 들어 가장 널리 사용되는 Digitalis 파생물인 Digoxin은 Digitalis lanata (흰 여우장갑)에서 파생됩니다⁶. 이들은 세포막의 Na⁺/K⁺-ATPase에 선택적으로 결합하여 세포 내 칼슘 농도를 증가시킴으로써 산소 섭취량을 증가시키지 않고 심장 수축성과 뇌졸중 용적을 향상시켜 심장 효율을 향상시킨다⁷. 심장 배당체를 제외하고, 포스포디에스테라제 억제제(phosphodiesterase inhibitors) 및 β-아드레날린성 수용체 작용제(-adrenergic receptor agonist)와 같은 대부분의 양성 수축성 약물은 심박 수와 심근 산소 소비량을 증가시키는 동시에 심근 수축을 증가시켜 임상적으로 심각한 부정맥과 저혈압을 유발하여 사망률을 증가시킬 수 있다⁸. 따라서 이러한 근방성 약물의 임상 적용은 제한적입니다. 세포 내 칼슘 수치 상승으로 인한 합병증을 피하기 위해서는 CHF 치료를 위한 보다 안전하고 매우 효과적인 수축성 조절제를 개발해야 합니다(그림 1).

최근 수십 년 동안 심장 혈류역학의 긍정적인 근방성 특성을 지원할 수 있는 화합물을 생성하고 분석하기 위해 많은 연구가 수행되었습니다. Euodia rutaecarpa(Juss.)와 같은 많은 중국 전통 의학(TCM) Benth., Apocynum venetum L. 및 Sophora alopecuroides L.은 심근 수축성을 향상시킬 수 있습니다 ^9,10,11. 연구에 따르면 TCM과 그 활성 단량체는 수축성 약물과 비교하여 다른 메커니즘을 통해 긍정적인 수축성 효과를 발휘할 수 있습니다. 예를 들어,_{C2 및 C5}에서 메틸화된 리구스트라진의 한 형태인 리구진디올(Szechwan Lovage Rhizome의 활성 성분 중 하나)은 심박수를 증가시키지 않고 근체망 칼슘 과도 상태를 강화하여 고립된 쥐 심장의 수축성을 크게 향상시키며, 부작용이 적고 CHF¹²에 대한 더 나은 치료법이 될 수 있습니다. 또한 matrine은 TCM 식물 Sophora flavescens Ait에서 추출한 알칼로이드입니다. Matrine은 심부전 모델 쥐에서_{β 3-AR} 단백질 발현의 상향 조절을 억제하고 eNOS 발현을 감소시켜 심근 수축성을 향상시킬 수 있습니다¹³. 그러나 민족 의학 연구에서는 심근 수축성을 향상시킬 수 있는 화합물을 스크리닝하기 위한 안정적이고 효율적인 실험 방법이 부족합니다.

기니피그는 다른 설치류에 비해 인간과 더 유사한 전기생리학 및 칼슘 처리 특성을 가지고 있는 것으로 일반적으로 알려져 있다¹⁴. 한편으로, 기니피그의 심전도는 인간의 심전도와 충분히 유사하며, 박동 간 Ca²⁺ 처리는 쥐 또는 생쥐보다 인간의 생리학에 더 유사합니다^15,16. 다른 한편으로, 기니피그 심근세포의 컴퓨터 모델은 광범위한 연구를 거쳤으며 에너지 및 활성 산소 종 대사를 포함한 중요한 세포 하위 시스템을 포함하고 있습니다¹⁷. 따라서 기니피그에서 분리된 우심방은 심근 수축성을 향상시키는 화합물을 스크리닝하는 데 널리 사용됩니다. 여기에서는 digoxin을 예로 들어 기니피그에서 분리된 우심방을 사용하여 심근 수축성을 향상시키는 화합물을 스크리닝하기 위한 체계적이고 표준화된 프로토콜을 제공합니다. 따라서 이 연구는 만성심부전 치료에서 민족 의약품의 활성 성분을 스크리닝하기 위한 방법론적 참고 자료를 제공합니다.

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프로토콜

실험 프로토콜은 닝샤 의과대학의 실험동물 사용 및 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 요구 사항에 따라 수행되었습니다. 본 연구에는 체중이 300-450g인 수컷 Dunkin-Hartley 기니피그가 사용되었습니다. 수축성에 대한 디곡신의 효과는 기니피그로부터 고립된 우심방에서 관찰되었습니다(그림 2).

1. 기니피그의 고립된 우심방을 위한 산소화 준비

1. 생체 신호 수집 및 처리 시스템, JH-2 근력 변환기, 매그너스 욕조, L자형 환기 고리, 두꺼운 가위, 페트리 접시, 파라핀 등을 포함한 실험 도구를 준비합니다( 재료 표 참조).
2. 2중증류수 1,000mL에 NaCl 7.02g(120.0mM), NaHCO3 2.10g(25.0mM), KCl(4.0mM) 0.30g, MgSO4 0.07g(0.6mM),_NaH2PO40.07g(0.6mM), CaCl2(2.5mM) 0.28g, 포도당(11.0mM) 1.98g을 첨가하여 Krebs-Henseleit 용액(K-H 용액) 1,000mL를 준비하고, Magnus 목욕을 두세 번 헹굽니다(표 1 및 재료 표 참조).
   알림: K-H 용액의 온도를 37°C ± 1°C로 유지하십시오.
3. 이중 증류수 100 mL에 NaCl 0.70 g (120.0 mM), NaHCO₃ (25.0 mM) 0.21 g, KCl (4.0 mM) 0.03 g, MgSO₄ (0.6 mM) 0.01 g,_NaH2PO4 (0.6 mM) 0.01 g, CaCl₂ (0.8 mM) 0.01 g 및 포도당 (11.0 mM) 0.20 g을 첨가하여 저칼슘 K-H 용액 100 mL를 준비한다 (표 1 및 재료 표 참조).
4. 20°C K-H 용액 약 37mL를 작동 대야에 놓습니다( 재료 표 참조).
5. 페트리 접시 바닥에 5mm의 두꺼운 파라핀을 펴 바르고 페트리 접시에 37°C K-H 용액을 채웁니다( 재료 표 참조).
6. 방광의 라텍스 튜브 끝에 L자형 환기 고리를 설치하고 페트리 접시에 넣은 다음 1-2 거품/초로 조정합니다( 재료 표 참조).
   알림: 거품을 천천히 조정하십시오. 조치가 너무 빠르면 산소가 곧 고갈될 수 있습니다.

2. 기니피그에서 고립된 우심방의 준비

1. 저울로 기니피그의 무게를 잰다( 재료표 참조).
2. 100% 산소에 5% 이소플루란이 함유된 유도 상자를 사용하여 마취를 유도한 다음 유지 관리를 위해 1.5%-3% 이소플루란이 포함된 노즈콘으로 전환합니다( 재료 표 참조).
3. 거친 가위로 경동맥을 자르고 접시에 올리기 전에 출혈을 유도합니다. 그런 다음 가위를 사용하여 흉부를 열고(시포이드 과정부터 시작하여 심장을 노출시키기 위해 측면을 완전히 분리함) 심낭을 벗겨냅니다.
   1. 왼손으로 심장을 들고 오른손을 사용하여 대동맥 뿌리에서 심장을 잘라낸 다음 K-H 용액으로 수술대에 빠르게 놓습니다. 마지막으로 손으로 심실을 두세 번 부드럽게 누르고 심실 혈액을 짜낸 다음 페트리 접시에 심장을 넣습니다.
      참고: 작업은 활발하고 2-5분 내에 완료되어야 하며 온도는 35°C로 제어되어야 합니다. K-H 용액의 온도는 37°C로 제어해야 합니다.
4. 파라핀이 코팅된 페트리 접시에 심장 끝을 바늘로 고정하면서 산소(60기포/분)를 공급합니다.
5. 올바른 아트리움을 식별합니다.
   참고: 기니피그에서 심방은 폐동맥에 의해 복부 표면에서 분리되고 대동맥에 의해 등쪽으로 분리되어 있습니다. 좌심방과 우심방은 모두 "역삼각형"처럼 심실에 부착되어 있으며, 우심방은 좌심방보다 약간 작고 가장자리가 고르지 않습니다. 우심실의 심근은 얇고 함몰의 상단은 우심방입니다. 좌심실은 더 부풀어 오르고, 관상동맥 혈관의 분포는 풍부하다¹⁸ (그림 3).
6. 안과 겸자로 우심방의 가장자리를 부드럽게 들어 올리고 방실 접합부를 따라 자릅니다( 재료 표 참조).
   알림: 동방 결절이 손상되지 않도록 하고 방실 접합부를 따라 절단하면서 심실에 더 가깝게 절단하십시오. 이 단계에서 우심방의 자동 리듬 수축을 관찰할 수 있습니다.
7. 4-0 수술용 봉합사( 재료 표 참조)를 사용하여 오른쪽 심방의 상단과 하단("대각선"의 양쪽 끝)을 각각 접합하고 한쪽 끝은 고리로 만들고 다른 쪽 끝은 고리로 된 긴 실 끝으로 남겨둡니다.
   참고: 심방의 "대각선"의 양쪽 끝을 결찰할 때 가능한 한 적은 조직을 접합하십시오.

3. 기니피그에서 격리된 우심방의 수축기 기능 측정 및 기록

1. 컴퓨터를 켜고 생체 신호 수집 및 처리 시스템으로 들어갑니다( 재료 표 참조). 연결 채널(첫 번째 채널, 장력)을 결정한 후 게인(50mV), 시간 상수(DC), 필터(20Hz) 및 스캔 속도(1.00s/div)를 조정합니다.
2. 표본의 한쪽 끝을 Magnus 수조 옆에 페트리 접시와 산소와 함께 L자형 환기 고리에 걸어둡니다. 표본의 다른 쪽 끝을 JH-2 근력 변환기에 걸어둡니다( 재료표 참조).
3. 심방 수축기 곡선을 관찰하고 예압을 0.5-1.0g으로 조정하고 안정화될 때까지 기다립니다(약 30분).
   알림: KH 솔루션을 20분마다 교체하십시오. 정상인 경우 관측된 곡선을 표준으로 사용하고 "정상"으로 표시합니다. 화면을 조금 더 빨리 스캔하면 속도를 줄여야 합니다.
4. 0.2mL의 저칼슘 K-H 용액을 투여하고 만곡이 더 이상 감소하지 않을 때까지 5분 동안 관찰합니다.
5. 0.2mL의 5% 디곡신( 재료 표 참조)을 투여하고 5분 동안 관찰한 후 3회 세척한 다음 정상으로 돌아갑니다.
   참고: 관리를 표시합니다. 효과가 분명하면 화면을 더 빠르게 스캔하십시오. 곡선이 더 이상 상승하지 않을 때, 즉 수축 진폭이 더 이상 증가하지 않을 때 빠르게 세 번 씻습니다. 그렇지 않으면 부정맥이 발생하여 후속 약물 실험의 결과에 영향을 미칩니다.
6. 데이터를 수집하여 플로피 디스크에 저장합니다.

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결과

심근 수축성의 감소는 심박출량의 불충분한 결과를 유발하여 만성심부전증을 유발합니다(그림 1). 이 프로토콜을 통해 기니피그에서 분리된 우심방의 수축기 기능에 대한 다양한 약물의 효과를 기록한 다음 심근 수축성을 향상시키는 인종 약물의 화합물을 신속하게 스크리닝할 수 있었습니다. 우심방, JH-2 근력 변환기, 생체 신호 수집 및 처리 시스...

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토론

심장의 정상적인 리듬 활동은 고립된 우심방의 활동과 마찬가지로 적절한 물리적, 화학적 환경을 필요로 합니다. 고립된 우심방은 신체의 신경 분포와 전신 체액성 요인의 직접적인 영향으로부터 격리되어 있으며, 이는 우심방이 노출되는 약물을 변경할 때 우심방의 활동 변화를 관찰할 수 있음을 의미합니다. 흥분성 세포에서 생체 전기 활동의 근본적인 원인은 세포막?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-0 surgical suture	Yangzhou Fuda Medical Devices Co., Ltd
5% Digoxin (soluble in dimethyl sulfoxide)	TCI Shanghai	D1828	CAS: 20830-75-5; Purity: >96.0%
BL-420N biological signal acquisition and processing system	Chengdu Tai Meng Software Co., Ltd	1700142S
CaCl2	Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd	S24110	CAS: 10043-52-4; Purity: 96%
Glucose	Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd	S11022	CAS: 50-99-7; Purity: 99%
Isoflurane	RWD Life Science Co., Ltd	R510-22-16
JH-2 muscle force transducer	Institute of Aerospace Medical Engineering, Beijing, China
KCl	Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd	S24120	CAS: 7447-40-7; Purity: 99.5%
Magnus bath	Shanghai Future Experimental Equipment Co., Ltd	L046525
MgSO4	Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd	S24253	CAS: 7487-88-9; Purity: 98%
NaCl	Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd	S24119	CAS: 7647-14-5; Purity: 99.5%
NaH2PO4	Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd	S24161	CAS: 7558-80-7; Purity: 99%
NaHCO3	Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd	S24153	CAS: 144-55-8; Purity: 99.8%
Operating basin	Guangzhou Telekuan Medical Instrument Co., Ltd		305 mm x 230 mm
Ophthalmic forcep	Suzhou Shuanglu Medical Instrument Co., Ltd
Ophthalmic operating scissor	Suzhou Shuanglu Medical Instrument Co., Ltd
Paraffin	Leica Biosystems	39601095
Petri dish	Corning	430167	100 mm x 20 mm
Rodent anesthesia machine	Shanghai Yuyan Instruments Co., Ltd		ABS type (single channel)
Scale	Shanghai Yueping Scientific Instrument Co., Ltd	YP1002
Surgical plate	Zhengzhou Ketai Experiment Equipment Co., Ltd		21 cm x 31 cm
Tissue scissor	Suzhou Shuanglu Medical Instrument Co., Ltd	SL0023