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Resumo

O presente protocolo descreve um método eficiente para triagem de drogas que aumentam a contratilidade miocárdica usando átrios direitos isolados de cobaias.

Resumo

A insuficiência cardíaca crônica comum (ICC) é caracterizada por comprometimento da função de enchimento e/ou ejeção ventricular, o que leva a um débito cardíaco insaciável e aumento da incidência. O declínio da função sistólica cardíaca é um fator chave na patogênese da ICC. A função sistólica é simplesmente o enchimento de sangue oxigenado no ventrículo esquerdo, seguido pelo sangue sendo bombeado por todo o corpo durante um batimento cardíaco. Um coração fraco e a incapacidade do ventrículo esquerdo de se contrair adequadamente à medida que o coração bate indicam função sistólica deficiente. Muitas ervas tradicionais foram sugeridas para fortalecer a função sistólica do coração em pacientes. No entanto, métodos experimentais estáveis e eficientes para triagem de compostos que aumentam a contratilidade miocárdica ainda faltam no processo de pesquisa em medicina étnica. Aqui, tomando a digoxina como exemplo, um protocolo sistemático e padronizado é fornecido para a triagem de compostos que aumentam a contratilidade miocárdica usando átrios direitos isolados de cobaias. Os resultados mostraram que a digoxina pode aumentar acentuadamente a contratilidade do átrio direito. Este protocolo sistemático e padronizado tem como referência metodológica para a triagem dos princípios ativos de medicamentos étnicos no tratamento da ICC.

Introdução

A insuficiência cardíaca é causada por infarto do miocárdio, miocardiopatia, sobrecarga hemodinâmica, inflamação e outras causas de lesões miocárdicas, que modificam a anatomia e a atividade miocárdica e, em última análise, levam à falha no bombeamento ou enchimento ventricular. Palpitações, cansaço e retenção de líquidos são os principais sintomas clínicos primários1. A ICC é uma condição de insuficiência cardíaca crônica que pode ser mantida, deteriorada ou apresentar descompensação ao longo do tempo, e sua incidência e prevalência aumentam com os2 anos de idade. O declínio da função sistólica cardíaca é um fator chave na patogênese da ICC3. O tratamento médico atual para a doença passa principalmente pelo uso de medicamentos anti-hipertensivos, como inibidores da enzima conversora de angiotensina, β-adrenoceptores (que inibem a ativação excessiva do sistema neuro-hormonal, nomeadamente o sistema simpático e o sistema renina-angiotensina-aldosterona), ou diuréticos (que reduzem a congestão)4. No entanto, os sinais clínicos de insuficiência cardíaca causados pela redução do débito cardíaco e da reserva cardíaca não são frequentemente abordados em estudos que examinam o impacto desses tratamentos médicos5.

Os medicamentos inotrópicos positivos são projetados para aumentar a contratilidade miocárdica. Glicosídeos cardíacos, inibidores da fosfodiesterase e agonistas do receptor β-adrenérgico são usados como drogas inotrópicas positivas para o tratamento da insuficiência cardíaca. Os glicosídeos cardíacos são principalmente derivados digitálicos ; um exemplo é a digoxina, que é o derivado de Digitalis mais usado e é derivado de Digitalis lanata (dedaleira branca)6. Eles se ligam seletivamente à Na+/K+-ATPase na membrana celular para aumentar a concentração intracelular de cálcio e, assim, aumentar a contratilidade cardíaca e o volume sistólico sem elevar a ingestão de oxigênio, melhorando assim a eficiência cardíaca7. Além dos glicosídeos cardíacos, a maioria das drogas inotrópicas positivas, como inibidores da fosfodiesterase e agonistas dos receptores β-adrenérgicos, aumentam a frequência cardíaca e o consumo de oxigênio do miocárdio, aumentando a carga de cálcio nas células miocárdicas para aumentar a contratilidade miocárdica, o que pode resultar em arritmias e hipotensão clinicamente graves e, portanto, aumento da mortalidade8. Portanto, a aplicação clínica desses medicamentos inotrópicos é limitada. Para evitar complicações causadas por níveis elevados de cálcio intracelular, é necessário desenvolver moduladores inotrópicos mais seguros e altamente eficazes para o tratamento da ICC (Figura 1).

Nas últimas décadas, muitos estudos têm sido realizados para gerar e analisar compostos que possam suportar as propriedades inotrópicas positivas da hemodinâmica cardíaca. Muitos medicamentos tradicionais chineses (MTC), como Euodia rutaecarpa (Juss.) Benth., Apocynum venetum L. e Sophora alopecuroides L., entre outros, podem aumentar a contratilidade miocárdica 9,10,11. Estudos comprovaram que a MTC e seus monômeros ativos podem exercer efeitos inotrópicos positivos por meio de diferentes mecanismos em comparação com drogas inotrópicas. Por exemplo, o liguzinodiol, uma forma de ligustrazina metilada em C2 e C5 (um ingrediente ativo do rizoma Szechwan Lovage), que aumenta significativamente a contratilidade de corações isolados de ratos, aumentando os transientes de cálcio do retículo sarcoplasmático sem aumentar a frequência cardíaca, pode ter menos efeitos colaterais e ser um melhor tratamento para ICC12. Além disso, a matrina é um alcalóide extraído da planta MTC Sophora flavescens Ait. A matrina pode inibir a regulação positiva da expressão da proteína3-AR e diminuir β a expressão da eNOS em ratos modelo de insuficiência cardíaca, aumentando assim sua contratilidade miocárdica13. No entanto, na pesquisa da medicina étnica, faltam métodos experimentais estáveis e eficientes para a triagem de compostos que possam aumentar a contratilidade miocárdica.

É comumente conhecido que, em comparação com outros roedores, os porquinhos-da-índia têm características eletrofisiológicas e de manuseio de cálcio mais semelhantes às dos humanos14. Por um lado, o eletrocardiograma de cobaias é suficientemente semelhante ao de humanos, e seu manuseio de Ca2+ batimento a batimento é mais semelhante à fisiologia humana do que à de ratos ou camundongos15,16. Por outro lado, modelos computacionais de cardiomiócitos de cobaias passaram por extensa pesquisa e incluem subsistemas celulares cruciais, incluindo o metabolismo energético e reativo de espécies de oxigênio17. Portanto, átrios direitos isolados de cobaias são amplamente utilizados para rastrear compostos que aumentam a contratilidade miocárdica. Aqui, tomamos a digoxina como exemplo para fornecer um protocolo sistemático e padronizado para a triagem de compostos que aumentam a contratilidade miocárdica usando átrios direitos isolados de cobaias. Portanto, este trabalho fornece um referencial metodológico para a triagem dos princípios ativos de medicamentos étnicos no tratamento da ICC.

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Protocolo

O protocolo experimental foi conduzido de acordo com os requisitos do Comitê de Uso de Animais de Laboratório e Cuidados e Uso de Animais Institucionais da Universidade Médica de Ningxia. Cobaias Dunkin-Hartley machos pesando 300-450 g foram utilizadas para o presente estudo. O efeito da digoxina sobre a contratilidade foi observado em átrios direitos isolados de cobaias (Figura 2).

1. Preparação de oxigenação para os átrios direitos isolados de cobaias

  1. Prepare os instrumentos experimentais, incluindo um sistema de aquisição e processamento de sinais biológicos, um transdutor de força muscular JH-2, um banho Magnus, um gancho de ventilação em forma de L, tesouras grossas, uma placa de Petri, parafina, etc. (ver Tabela de Materiais).
  2. Prepare 1.000 mL de solução de Krebs-Henseleit (solução de K-H) adicionando 7,02 g de NaCl (120,0 mM), 2,10 g de NaHCO3 (25,0 mM), 0,30 g de KCl (4,0 mM), 0,07 g de MgSO4 (0,6 mM), 0,07 g de NaH2PO4 (0,6 mM), 0,28 g de CaCl2 (2,5 mM) e 1,98 g de glicose (11,0 mM) em 1.000 mL de água bidestilada e enxágue o banho Magnus duas a três vezes (consulte a Tabela 1 e a Tabela de Materiais).
    NOTA: Mantenha a temperatura da solução KH em 37 ° C ± 1 ° C.
  3. Prepare 100 mL de solução de K-H com baixo teor de cálcio adicionando 0,70 g de NaCl (120,0 mM), 0,21 g de NaHCO3 (25,0 mM), 0,03 g de KCl (4,0 mM), 0,01 g de MgSO4 (0,6 mM), 0,01 g de NaH2PO4 (0,6 mM), 0,01 g de CaCl2 (0,8 mM) e 0,20 g de glicose (11,0 mM) em 100 mL de água bidestilada (ver Tabela 1 e Tabela de Materiais).
  4. Colocar aproximadamente 20 ml da solução K-H a 37 °C no lavatório de operação (ver Tabela de Materiais).
  5. Espalhar 5 mm de parafina espessa sobre o fundo da placa de Petri e, em seguida, encher a placa de Petri com a solução K-H a 37 °C (ver Tabela de Materiais).
  6. Instale o gancho de ventilação em forma de L na extremidade do tubo de látex da bexiga, coloque-o na placa de Petri e ajuste para 1-2 bolhas/s (consulte a Tabela de Materiais).
    NOTA: Ajuste lentamente as bolhas; Se a ação for muito rápida, o oxigênio pode acabar em breve.

2. Preparação de átrios direitos isolados de cobaias

  1. Pese os porquinhos-da-índia em uma balança (consulte a Tabela de Materiais).
  2. Induza a anestesia usando uma caixa de indução com 5% de isoflurano em 100% de oxigênio e, em seguida, mude para um cone nasal com 1,5% -3% de isoflurano para manutenção (consulte a Tabela de Materiais).
  3. Corte a artéria carótida com uma tesoura áspera e induza a exsanguinação antes de colocá-la em um prato. Em seguida, usando uma tesoura, abra o tórax (começando pelo processo xifóide e separando completamente os lados para expor o coração) e retire o pericárdio.
    1. Segure o coração com a mão esquerda, use a mão direita para cortar o coração da raiz da aorta e coloque-o rapidamente na bacia de operação com a solução KH. Finalmente, pressione suavemente o ventrículo com a mão duas a três vezes, esprema o sangue ventricular e coloque o coração na placa de Petri.
      NOTA: A ação deve ser rápida e concluída em 2-5 min, e a temperatura deve ser controlada a 35 °C. A temperatura da solução K-H deve ser regulada a 37 °C.
  4. Fixe a ponta do coração à placa de Petri revestida de parafina com uma agulha enquanto fornece oxigênio (60 bolhas/min).
  5. Identifique o átrio direito.
    NOTA: Em cobaias, os átrios são separados em sua superfície ventral pela artéria pulmonar e dorsalmente pela aorta. Tanto os átrios esquerdo quanto o direito estão ligados aos ventrículos como um "triângulo invertido", e o átrio direito é ligeiramente menor que o átrio esquerdo e tem bordas irregulares. O miocárdio do ventrículo direito é fino e a extremidade superior do colapso é o átrio direito; o ventrículo esquerdo é mais inchado e a distribuição dos vasos coronários é rica18 (Figura 3).
  6. Levante suavemente a borda do átrio direito com uma pinça oftálmica e corte ao longo da junção atrioventricular (ver Tabela de materiais).
    NOTA: Evite danificar o nó sinoatrial e tente cortar mais perto do ventrículo enquanto corta ao longo da junção atrioventricular. A contração rítmica automática do átrio direito pode ser observada nesta etapa.
  7. Use suturas cirúrgicas 4-0 (consulte a Tabela de Materiais) para ligar a parte superior e inferior do átrio direito, respectivamente (ambas as extremidades da "linha diagonal"), com uma extremidade enrolada e a outra extremidade esquerda com uma extremidade de rosca longa que também é enrolada.
    NOTA: Tente ligar o menor número possível de tecidos ao ligar ambas as extremidades da "linha diagonal" dos átrios.

3. Medição e registro da função sistólica dos átrios direitos isolados de cobaias

  1. Ligue o computador e entre no sistema de aquisição e processamento de sinais biológicos (consulte a Tabela de Materiais). Ajuste o ganho (50 mV), a constante de tempo (CC), o filtro (20 Hz) e a velocidade de varredura (1.00 s/div) após determinar o canal de conexão (primeiro canal, tensão).
  2. Pendure uma extremidade da amostra no gancho de ventilação em forma de L com a placa de Petri e oxigênio ao lado do banho Magnus. Pendure a outra extremidade da amostra no transdutor de força muscular JH-2 (consulte a Tabela de Materiais).
  3. Observe a curva sistólica atrial, ajuste a pré-carga para 0,5-1,0 g e aguarde a estabilização (cerca de 30 min).
    NOTA: Troque a solução KH a cada 20 min. Quando normal, tome a curva observada como padrão e marque "normal". Se a tela for verificada um pouco rápido, isso deve ser desacelerado.
  4. Administre 0,2 mL de solução de K-H com baixo teor de cálcio e observe por 5 min até que a curva não diminua mais.
  5. Administre 0,2 mL de digoxina a 5% (ver Tabela de Materiais), observe por 5 min, lave três vezes e depois volte ao normal.
    NOTA: Marque a administração. Quando o efeito for óbvio, escaneie a tela mais rapidamente. Quando a curva não subir mais, ou seja, quando a amplitude de contração não aumentar mais, lave três vezes rapidamente; caso contrário, ocorrerá arritmia, o que afetará os resultados dos experimentos com drogas subsequentes.
  6. Colete os dados e salve-os em um disquete.

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Resultados

A diminuição da contratilidade miocárdica causa débito cardíaco insuficiente, o que leva à ICC (Figura 1). Este protocolo permitiu o registro dos efeitos de diferentes drogas na função sistólica de átrios direitos isolados de cobaias e, em seguida, a triagem rápida de compostos de drogas étnicas que aumentam a contratilidade miocárdica. Após a conexão do átrio direito, do transdutor de força muscular JH-2 e do sistema de aquisição e proces...

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Discussão

A atividade rítmica normal do coração requer um ambiente físico e químico adequado, assim como a atividade dos átrios direitos isolados. Os átrios direitos isolados são isolados da inervação do corpo e da influência direta de fatores humorais sistêmicos, ou seja, podem ser observadas alterações na atividade dos átrios direitos ao trocar as drogas às quais são expostos. As causas fundamentais da atividade bioelétrica em células excitáveis são mudanças na permeabilida...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pela Fundação de Ciências Naturais de Ningxia (Grant no. 2023AAC03620), pelo Projeto de Pesquisa Científica do Departamento de Ensino Superior de Ningxia (NYG2022030) e pelas Fundações Nacionais de Ciências Naturais da China (Grant no.82160816 e 82260797).

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
4-0 surgical sutureYangzhou Fuda Medical Devices Co., Ltd
5% Digoxin (soluble in dimethyl sulfoxide)TCI ShanghaiD1828CAS: 20830-75-5; Purity: >96.0%
BL-420N biological signal acquisition and processing systemChengdu Tai Meng Software Co., Ltd1700142S
CaCl2Shanghai yuanye Bio-Technology Co., LtdS24110CAS: 10043-52-4; Purity: 96%
GlucoseShanghai yuanye Bio-Technology Co., LtdS11022CAS: 50-99-7; Purity: 99%
IsofluraneRWD Life Science Co., LtdR510-22-16
JH-2 muscle force transducerInstitute of Aerospace Medical Engineering, Beijing, China
KCl Shanghai yuanye Bio-Technology Co., LtdS24120CAS: 7447-40-7; Purity: 99.5%
Magnus bathShanghai Future Experimental Equipment Co., LtdL046525
MgSO4Shanghai yuanye Bio-Technology Co., LtdS24253CAS: 7487-88-9; Purity: 98%
NaCl Shanghai yuanye Bio-Technology Co., LtdS24119CAS: 7647-14-5; Purity: 99.5%
NaH2PO4Shanghai yuanye Bio-Technology Co., LtdS24161CAS: 7558-80-7; Purity: 99%
NaHCO3Shanghai yuanye Bio-Technology Co., LtdS24153CAS: 144-55-8; Purity: 99.8%
Operating basinGuangzhou Telekuan Medical Instrument Co., Ltd305 mm x 230 mm
Ophthalmic forcepSuzhou Shuanglu Medical Instrument Co., Ltd
Ophthalmic operating scissor Suzhou Shuanglu Medical Instrument Co., Ltd
ParaffinLeica Biosystems 39601095
Petri dishCorning430167100 mm x 20 mm
Rodent anesthesia machineShanghai Yuyan Instruments Co., LtdABS type (single channel)
ScaleShanghai Yueping Scientific Instrument Co., LtdYP1002
Surgical plate Zhengzhou Ketai Experiment Equipment Co., Ltd21 cm x 31 cm
Tissue scissorSuzhou Shuanglu Medical Instrument Co., LtdSL0023

Referências

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