מבחן בטיחות איום חברתי חושף פנוטיפים הקשורים ללחץ פסיכו-סוציאלי

Summary

מבחן בטיחות האיום החברתי מאפשר הערכה סימולטנית של התפתחות הימנעות חברתית כמדד ללמידה מותנית מרתיעה ויכולת אפליה בין איום חברתי לבטיחות, שתיהן משמשות לזיהוי פרטים רגישים ללחץ ועמידים ללחץ בתוך קבוצה אחת של עכברים זכרים מובסים חברתית כרונית.

Abstract

לחץ חברתי הוא גורם מרכזי להתפתחות הפרעות נפשיות. כדי לשפר את הערך התרגומי של מחקרים פרה-קליניים, חוויית הלחץ החברתי והשפעתה ההתנהגותית על עכברים צריכה להיות דומה לבני אדם. תבוסה חברתית כרונית (CSD) משתמשת בסוג של לחץ חברתי הכולל התקפות פיזיות ואיומים חושיים כדי לגרום לתפקוד לקוי של הנפש הדומה להפרעות רגשיות אנושיות. כדי לחזק את המרכיב הפסיכו-סוציאלי של CSD, יושם פרוטוקול CSD של 10 ימים שבו התקפות פיזיות יומיות מתוקננות לשלושה פרקים של 10 שניות ואחריו שלב חושי של 24 שעות. לאחר השלב החושי^העשירי , פרוטוקול CSD מלווה בבדיקה התנהגותית מעודנת הנקראת מבחן בטיחות איום חברתי (STST). מבחני התנהגות לאחר לחץ צריכים לקבוע כיצד ובאיזו מידה השפיע גורם הלחץ החברתי על ההתנהגות. STST מאפשר לעכברים זכרים מובסים חברתית כרונית לקיים אינטראקציה עם 2 פרטים זכרים חדשים (מטרות חברתיות): מטרה חברתית אחת מהזן התוקף שבו נתקלו במהלך ימי CSD והשנייה מזן חדש. שניהם מוצגים בו זמנית בתאים שונים של זירת מבחן תלת קאמרית. המבחן מאפשר הערכה סימולטנית של התפתחות הימנעות חברתית כדי למדוד למידה מותנית מרתיעה מוצלחת ויכולת אפליה של איום חברתי-בטיחות. התפתחות ההימנעות החברתית כלפי שני הזנים משקפת תגובה מרתיעה כללית ולפיכך מדידה של רגישות ללחץ. בינתיים, התפתחות ההימנעות החברתית כלפי הזן התוקף בלבד משקפת אפליה בין איום לבטיחות ובכך מדד לחוסן מפני לחץ. לבסוף, היעדר הימנעות חברתית כלפי הזן התוקף משקף למידה מותנית מרתיעה לקויה. הפרוטוקול נועד לחדד את המודלים העכבריים המשמשים כיום של רגישות/חוסן ללחץ על ידי הכללת קריטריונים תרגומיים, במיוחד אפליה בין איום לבטיחות והכללה של תגובה מרתיעה, כדי לסווג קבוצה אחת של בעלי חיים מובסים חברתית כרונית לתת-קבוצות עמידות ורגישות, ובסופו של דבר לקדם גישות תרגום עתידיות.

Introduction

מתח מוגדר כהפרעה של הומאוסטזיס הנגרמת על ידי גירויים פיזיים או פסיכולוגיים¹. לחץ הוא גורם סיכון מרכזי ידוע להתפתחות הפרעות נפשיות כגון הפרעת דחק פוסט טראומטית, דיכאון וחרדה ^2,3. בפרט, לחץ חברתי נחשב גורם סיכון מרכזי להתפתחות הפרעות נפשיות הקשורות ללחץ⁴. סוג אחד של לחץ חברתי שזכה לחשיבות מיוחדת במחקר הוא לחץ כפיפות חברתית⁵. עכברים, כמו בני אדם, מסוגלים למערך עשיר של התנהגות חברתית⁶, מה שהופך אותם מתאימים לחקירות הקשורות ללחץ חברתי. במסגרת המעבדה, כאשר עכברים בוגרים שוכנים בקבוצה, הם מקימים מבנה חברתי הכרוך בהיווצרות דרגות⁷. בהתאם לכך, מודל המושבה תוכנן לחקור את ההשפעות של היררכיות חברתיות טבעיות בקבוצות מעורבות של עכברים⁸. במהלך השנים פותחו וריאציות של מודל המושבה כדי לנצל את לחץ הכפיפות החברתית, כולל מודלים של קבוצות חד-מיניות, מודל אי-היציבות החברתית ומודל המושבה הפולשת. בשנים האחרונות, לעומת זאת, גרסה אחת מסוימת המכונה מודל התושב-פולש הגברי הפכה פופולרית בספרות, ומפשטת את המורכבות החברתית לשני עכברים: תושב ופולש. בעל החיים המעניין, המכונה פולש, מוכנס לכלוב של מגדל גדול יותר, מבוגר יותר ופנסיונר, המכונה תושב או תוקפן. לאחר מכן התושב תוקף פיזית את הפולש כשיטת עימות, ומבסס היררכיה חברתית שבה הדייר דומיננטי והפולש כפוף. כאשר עימותים הם אירועים חד פעמיים, הם מסווגים כ"אקוטיים" ("מודל התבוסה החברתית החריפה"), בעוד שעימותים חוזרים ונשנים הנמשכים מספר ימים (בדרך כלל 10) ידועים כ"כרוניים" ("מודל התבוסה החברתית הכרונית"). במודל התבוסה החברתית הכרונית (CSD), ההתקפות הן לסירוגין ובדרך כלל מוגבלות לתקופה של 5-10 דקות⁹, המכונה השלב הפיזי. לאחר השלב הפיזי, הפולש והדייר מוחזקים למשך הלילה באותו כלוב, מופרדים לשניים באמצעות קיר רשת, המאפשר את כל צורות האינטראקציה למעט מגע פיזי. תצורה זו, המכונה השלב החושי, גורמת ללחץ באמצעות הופעה מתמשכת של איום במקום עימות פיזי ישיר. בשנת 2018, ואן דר קוג'י ועמיתיו הציגו טיפול בתבוסה חברתית כרונית שונה כדי להתמקד במרכיב הפסיכו-סוציאלי של המודל על ידי סטנדרטיזציה והגבלה קפדנית של השלב הפיזי¹⁰. המודל המתוקן מגביל התקפות פיזיות לשלושה פרקים של 10 שניות עם תושבים שונים, המתרחשים במרווחים של 15 דקות בין פרקים של השלב החושי. לאחר האפיזודה הפיזית השלישית, השלב החושי נמשך בן לילה. מחזור זה חוזר על עצמו במשך 10 ימים רצופים עם תושבים חדשים בכל פרק. הטיפול המותאם משפר את תוקפו התרגומי של מודל התבוסה החברתית הכרונית ככל שהנזק הפיזי של הפולש ממוזער, והשונות בתוצאות ממשכי זמן דיפרנציאליים של התקפות פיזיות מצטמצמת.

מכיוון שמודל CSD משמש לחקר מחלות הקשורות ללחץ (למשל, דיכאון, חרדה, הפרעת דחק פוסט-טראומטית), נבחרים מבדקים פוסט-התנהגותיים, כולל, אך לא רק, מבדקים התנהגותיים של תוקפנות, זיכרון ואנהדוניה. בשנים האחרונות, מבחני התנהגות פוסט-CSD בעכברים מעריכים לעתים קרובות כיצד ובאיזו מידה חברותיות מושפעת⁹. חברותיות מוגדרת כהעדפה מולדת של עכברים לקיים אינטראקציה חברתית במקום להימנע מקשר חברתי. מכיוון שחברותיות כפופה להשפעות לחץ, נקבעו בדיקות המעריכות אך ורק את התפתחות ההימנעות החברתית. להימנעות חברתית הנגרמת על ידי לחץ יש רלוונטיות תרגומית מכיוון שהיא מייצגת את אחד הסימפטומים ההתנהגותיים העיקריים של חרדה חברתית ודיכאון בבני אדם¹¹. בדומה לבני אדם, לא כל העכברים מפתחים הימנעות חברתית בעקבות טיפול CSD, מה שמרמז על נוכחות של אינדיבידואליות בתגובת מתח. כהן ועמיתיו הציעו קריטריונים התנהגותיים מנותקים כגישה מבטיחה לחקר הנוירוביולוגיה של אינדיבידואליות¹². בחירת בעלי חיים על בסיס התנהגות מביאה לחלוקת קבוצות, ומדגישה את הבסיס למחקרי גן-סביבה. לאחר מכן, תת-קבוצות שונות מראות לעתים קרובות העשרה ברורה של וריאנטים/שינויים גנטיים ספציפיים, אשר בתורם יכולים להיחקר בתנאים סביבתיים שונים¹³. בהתאם לכך, האינדיבידואליות בהתפתחות ההימנעות החברתית נוצלה כדי לחלק את הקבוצה היחידה של עכברים זכרים מובסים חברתית כרונית לשתי תת-קבוצות: רגישים ללחץ (נמנעים חברתית) ועמידים ללחץ (לא נמנעים חברתית ^9,14). עם זאת, יש לשקול את הפרשנות של פנוטיפ ההימנעות החברתית בעכברים כהתנהגות לא מסתגלת או אדפטיבית בהקשר הכולל הן של הטיפול (כאן CSD) והן של הבדיקה ההתנהגותית שלאחר הטיפול. בנוסף, המבחן ההתנהגותי של הבחירה לאחר הטיפול יעריך באופן אידיאלי היבטים אחרים של חברותיות ולא רק התפתחות הימנעות חברתית. עבודתנו האחרונה חשפה את מעורבותה של למידה מותנית בהימנעות חברתית הנגרמת על ידי CSD¹⁵. באופן ספציפי, הימנעות חברתית הנגרמת על ידי CSD היא תגובה מותנית מרתיעה כלפי התכונות המאפיינות את המתח של התושבים המשמשות כגירוי מותנה לגירוי הבלתי מותנה, כלומר התקפות התושבים. יתר על כן, בתוך תת-הקבוצה הנמנעת חברתית, פרטים מסוימים יכולים להבחין בין התכונות של זן התושבים המרתיע לבין אלה של זנים חדשים בטוחים אחרים, בעוד שפרטים אחרים מראים הימנעות חברתית כללית לשני הזנים. אנו מציעים כאן מבחן התנהגותי מזוקק לאחר CSD: מבחן האיום החברתי-בטיחות (STST)¹⁵. שלא כמו מבחני אינטראקציה חברתית^{אחרים 9}, STST מאפשר הערכה סימולטנית של התפתחות הימנעות חברתית כמדידה של התגובה המותנית המרתיעה הנכונה (כלומר, למידה מותנית מוצלחת) ויכולת אפליה של איום חברתי-בטיחות, שתיהן מנוצלות לזיהוי אנשים רגישים ללחץ ועמידים ללחץ בתוך קבוצה אחת של עכברים זכרים מובסים חברתית כרונית. ההערכה של אפליה בין איום חברתי לבטיחות לעומת הכללה של תגובה מרתיעה מרחיבה את הקריטריונים התרגומי המשמשים לסיווג הקבוצה היחידה של בעלי חיים מובסים חברתית כרונית לתת-קבוצות עמידות ורגישות.

Protocol

כל ההליכים בוצעו בהתאם לדירקטיבה של מועצת הקהילות האירופית בנוגע לטיפול ושימוש בבעלי חיים להליכי ניסוי ואושרו על ידי הרשויות המקומיות (Landesuntersuchungsamt Rheinland-Pfalz). איור 1 מייצג ציר זמן סכמטי.

1. טיפול

1. בעלי חיים מעניינים: להשיג עכברים זכרים C57BL6/J בגיל 7 שבועות, ועם ההגעה, בית יחיד במתקן מבוקר טמפרטורה ולחות במחזור אור-חושך של 12 שעות (אורות דולקים: 8:00; אורות כבויים: 20:00; 23 ° C; 38% לחות) עם מזון ומים ad libitum.
2. תבוסה חברתית כרונית (CSD)
   1. קבוצת טיפול
      1. לאחר שבוע של הרגלה, בצע טיפול CSD במשך 10 ימים רצופים באמצעות זן CD-1 כזן של התושב (לפרוטוקול מפורט, עיין בתבוסה חברתית כרונית⁹ ובטיפול בתבוסה חברתית כרונית¹⁰).
      2. הכנס את עכבר C57BL6/J לכלוב של עכבר CD-1 וספור 10 שניות של התקפה פיזית. חזור על פרק זה שלוש פעמים, כל אחת עם עכבר CD-1 אחר, והפרד במרווחים של 15 דקות בין פרקים.
      3. מקם קיר רשת בין עכבר C57BL6/J ועכבר CD-1 במהלך מרווחי זמן אלה, ומאפשר מגע חושי בלבד. לאחר הפרק השלישי, משכנו את עכברי C57BL6/J למשך הלילה בכלובים של עכברי CD-1, כשהם מפרידים בין שניהם על ידי קיר רשת. חזור על הפעולה במשך 10 ימים.
         הערה: מספר עכברי CD-1 = מספר עכברי C57BL6/J + 1. אם מספר העכברים שטופלו ב-C57BL6/J נמוך מ-10, עדיין יש צורך במינימום של 10 עכברי CD-1 כדי להבטיח שבכל יום השלב החושי האחרון (שנמשך לילה) יהיה עם עכבר CD-1 חדש במהלך 10 ימי הטיפול.
      4. בזהירות להעריך את הרווחה הפיזית של בעלי החיים לאורך 10 ימים. אם בעל חיים נפצע קשה, אין לכלול אותו בניסוי מסיבות אתיות ומדעיות (ניידות/פעילות במהלך הבדיקה שלאחר הטיפול). טבלה 1 מספקת רשימת תיוג לרווחה.
   2. קבוצת בקרה
      1. עם ההגעה, יש לשמור על עכברים בני אותו גיל באותם תנאים כמו קבוצת הטיפול.
      2. לאחר שבוע של הרגלה, הכניסו את חיות הביקורת למשך 90 שניות לכלוב ריק ולאחר מכן החזירו אותן לכלובים בודדים (חד-ביתיים) המופרדים לשניים על ידי קירות רשת זהים לאלה המשמשים לקבוצת הטיפול. בצע זאת מדי יום במקביל ל -10 ימי הטיפול.
         הערה: מומלץ לשכן את קבוצת הביקורת ואת קבוצת הטיפול בחדרים שונים.
3. לאחר השלב החושי האחרון (^העשירי), יש לשכן את כל העכברים בכלובים חדשים בתנאים דומים לאלה שתוארו עם הגעתם ולהשאיר אותם לנוח למשך הלילה.
   הערה: השלב החושי האחרון אמור להימשך 24 שעות, ואז בעלי חיים הם חד-ביתיים.

2. מבחן לאחר הטיפול: מבחן בטיחות איום חברתי (איור 2)

1. לאחר טיפול ב-CSD, יש לשכן את כל העכברים (קבוצות טיפול וביקורת) בכלובים חדשים בתנאים דומים לאלה שתוארו עם הגעתם ולהשאיר אותם לנוח למשך הלילה.
2. בשעות הבוקר (8:00-13:30), נקו את הזירה בעלת שלושת התאים (מלבן בצורת מלבן בגודל כולל של 60X40 ס"מ, עשויה קירות אקריליים שקופים ורצפות חלקות) עם אתנול 5% והניחו אותה מתחת למצלמה בתנאי תאורה של 37 לוקס. ודא שהזירה כולה גלויה.
3. נקו את מארזי הרשת (דמויי כלוב עשויים מתכת או אקריליק) עם אתנול 5% ומקמו אותם כפי שמוצג בפינות באיור 1A.
4. שלב ההרגלה: הציגו את בעל החיים המעניין במרכז הזירה, אפשרו חקירה במשך 6 דקות, ואז החזירו אותו לכלוב הביתי שלו.
5. מקם את היעד החברתי CD-1 (הלא ידוע) החדש (הספציפי) תחת מארז רשת אחד ואת היעד החברתי 129/Sv החדש מתחת למתחם הרשת השני.
   הערה: חשוב להשתמש בקונפרט 129/Sv לא ידוע כדי למנוע הטיית היכרות. רצוי שיהיו 4 מארזי רשת לכל זירה: 2 מיוחסים לשלב ההתרגלות ו-2 לשלב הבדיקה.
6. שלב הבדיקה: הציגו מיד מחדש את בעל החיים המעניין במרכז הזירה ואפשרו חקירה במשך 6 דקות.
7. להחזיר את כל בעלי החיים לביתם. נקו את הזירה ואת מארזי הרשת עם אתנול 5% בין ניסויים בבעלי חיים שונים, אך לעולם לא במהלך התצפית על אותה חיה, כלומר לעולם לא בין שלבי ההתרגלות והניסויים.
8. החליפו את המיקום של מארזי הרשת בין בעלי חיים (ולעולם לא בין שני השלבים בתוך אותה חיה) כדי לשלוט בהטיה מועדפת אפשרית של מיקום.

3. ניקוד וניתוח

הערה: רק מבחן הטיפול שלאחר הלחץ, כלומר STST מקבל ציון ומנותח (ולא טיפול בלחץ CSD).

1. הגדירו את אזור האינטראקציה כ- 2 ס"מ מסביב לגבולות מארזי הרשת.
2. הניקוד את משך הזמן שהוקדש לחקר מארזי הרשת בשלב ההרגלה כאשר אפו של בעל החיים נמצא באזור האינטראקציה.
3. דרג את משך הזמן שהוקדש לאינטראקציה עם המטרות החברתיות במהלך שלב הניסוי כאשר אפו של בעל החיים נמצא באזור האינטראקציה.
   הערה: ניתן לבצע זיהוי באופן ידני (באמצעות טיימר או תוכנה לניקוד ידני) או באופן אוטומטי. ללא קשר לשיטת הזיהוי, קחו את נקודת האף למדידות חקירה ואינטראקציה חברתית ואת נקודת המרכז של הגוף למדידות הקשורות לפעילות (למשל, מרחק תנועה).
4. חשב את מדד האינטראקציה החברתית באופן הבא: הזמן שהוקדש לחקר כל מטרה חברתית במהלך שלב הבדיקה / הזמן הממוצע שהוקדש לחקר שני מארזי הרשת הריקים במהלך שלב ההרגלה (איור 2B).
5. חלקו את קבוצת הטיפול ל-3 תת-קבוצות באופן הבא: בעלי חיים עם מדד אינטראקציה חברתית ≥1 עם היעד החברתי CD-1 אינם נמנעים, בעלי חיים עם מדד אינטראקציה חברתית <1 עם שני היעדים החברתיים הם נמנעים ללא הבחנה, בעלי חיים עם מדד אינטראקציה חברתית ≥1 רק עם היעד החברתי 129/Sv הם נמנעים מפלים (איור 2C-D).
   הערה: מספר בעלי החיים בכל אחת משלוש תת-הקבוצות יכול להיות שונה בין קבוצות שונות של בעלי חיים (כ-1/3 מכל בעלי החיים שעוברים טיפול CSD יציגו את המאפיינים הפנוטיפיים של אחת משלוש תת-הקבוצות).
6. להעריך את אפקט הלחץ על ידי ניתוח סטטיסטי של מדד האינטראקציה החברתית עם היעד החברתי CD-1 בין קבוצות הטיפול וקבוצת הביקורת (מבחן t פרמטרי בן שתי דגימות או מבחן מאן-ויטני לא פרמטרי).

תוצאות

מדד אינטראקציה חברתית כמדד לתגובה מותנית מרתיעה
מדד אינטראקציה חברתית ≥1 משקף אינטראקציה חברתית גדולה יותר עם היעד החברתי בהתאמה בהשוואה לחקר מארזי הרשת הריקים. בתנאי בסיס, המוגדרים כאן כבעלי ניסיון לא מעורר תיאבון ולא מרתיע עם התכונות המאפיינות זן מסוים (כאן הן מטרות חברתיות ...

Discussion

הפרוטוקול ההתנהגותי כאן מתאר את מבחן האיום החברתי-בטיחות, המשמש לחלוקת קבוצה אחת לטיפול לאחר CSD לשלוש תת-קבוצות שונות, המשמש כשיטה לחקור את הביולוגיה הבסיסית של רגישות וחוסן ללחץ ולבחון טיפולים פוטנציאליים. יש לשקול בזהירות את ההקשר הביולוגי ואת הפרטים הטכניים כדי להנחות תכנון ניסוי יסוד...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Arenas	Noldus, Sociability cage, Wageningen, the Netherlands	https://www.noldus.com/applications/sociability-cage	Three-chambered, rectangle in shape with a total size of 60 cm x  40 cm, made of acrylic transparent walls and smooth floors
Camera for video recording	Basler AG, Germany An der Strusbek 60-62 22926 Ahrensburg	ace Classic acA1300-60gc	If using automatic detection program, make sure cameras are compatible
Camera objective	KOWA Kowa Optimed Deutschland GmbH Fichtenstr. 123 40233 Duesseldorf: LMVZ4411 | 1/1.8" 4.4~11mm Varifokal Objektiv	Part-No. 10504
Detection program/Timer	Noldus, EthoVision-XT, Wageningen, the Netherlands	https://www.noldus.com/ethovision-xt	Detection can be achieved either manually (using a timer or a software for manual scoring) or automatically
Housing cages	ZOONLAB GmbH, Hermannstraße 6, 44579 Castrop-Rauxel	3010010	Type 2 cages: 265 mm x 205 mm x 140 mm (l x w x h) i.e. 360 cm² bottom area. Made of Polycarbonate (Makrolone©) and Polysulfone. Lids are made of stainless steel. European standard cages for up to 5 mice (20–25 g). Autoclavable up to 134 °C
Mesh enclosures	Part of the Arena Package: Noldus, Sociability cage, Wageningen, the Netherlands	https://www.noldus.com/applications/sociability-cage	Small acrylic or metal cage-like with a diameter of 100 mm and a height of 200 mm with openings of a 10 mm in size. Two mesh enclosures per arena would work but four is preferable (see point 2.5 in protocol)
Mesh wall	selfmade	N/A	Acrylic or metal, one for each cage. Size depends on cages used. The walls must not allow the two animals to have a physical contact
Social targets: Mice of the strains CD-1 and 129/Sv; retired male breeders	Mice provided by Charles River: Strain name: CD-1®IGS Mouse 129S2/SvPasCrl	Crl:CD1(ICR); 129S2/SvPasCrl	CD-1 and 129/Sv retired male breeders, single-housed, novel (unknown) conspecifics to the animals of interest. If retired male breeders are not available then males older than 1 year from both strains would suffice